BAB III METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun sirih merah segar, telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Biologi Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan merujuk acuan baku.
2. Pengumpulan dan penyiapan bahan
Bahan yang digunakan berupa daun sirih merah, diambil dari tanaman sirih merah di Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Jawa Tengah. Daun tersebut dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan sampai sisa-sisa air
menghilang. Daun kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 60˚-65˚C.
Setelah kering, lalu diserbuk dengan blender sampai halus dan diayak dengan ayakan 0,75 mm.
3. Ekstraksi
Serbuk simplisia diekstrak secara maserasi memakai etanol 70%. Untuk tiap 100 gram serbuk digunakan 700 ml etanol 70%. Maserasi yang digunakan adalah secara remaserasi, yakni dengan menambahkan 100 gram serbuk simplisia dengan 500 ml etanol 70% dalam erlenmeyer, kemudian ditutup dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari untuk mencegah reaksi yang dikatalisis oleh cahaya atau perubahan warna. Setelah 24 jam sari diserkai, disaring, ampas diperas. Ampas yang diperoleh kemudian ditambah cairan penyari sebanyak 200 ml, diaduk dan diserkai. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari kemudian endapan dipisahkan. Rendaman
20
harus dikocok berulang-ulang (kira-kira 3 x sehari). Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring, kemudian ditampung. Maserat yang terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan suhu 60-65oC, dibantu dengan
kipas angin sampai kental.
4. Sterilisasi alat dan bahan
Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat tersebut dicuci bersih dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 1210C dan tekanan 2,05 abs bar (Hagman, 2005).
5. Uji sitotoksisitas ekstrak daun sirih pada sel HeLa a. Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar 1000 µg/ml, 1250 µg/ml, 1500 µg/ml, 1750 µg/ml, dan 2000
µg/ml dimasukkan ke dalam 100 μl suspensi sel HeLa dengan kepadatan
2x104/100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang berbeda. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya 96-well
plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan
aliran 5% CO2.
Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10
μl MTT 5 μg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100
μl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang
550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.
b. Uji Sitotosisitas dengan Metode Direct Counting
Sel dengan kepadatan 2 x 104 sel / 100 μl media diinkubasikan dalam sumuran bersama dengan ekstrak uji sesuai dengan seri kadar yang dibuat yaitu 1000 μg / ml, 1250 μg / ml, 1500 μg / ml, 1750 μg / ml, 2000 μg / ml serta media RPMI 1640 dan sel sebagai kontrol. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu
37oC dan dialiri 5% CO2. Pada akhir masa inkubasi, tiap sumuran sel
diresuspensi, dimasukkan dalam haemocytometer kemudian dihitung jumlah sel nya dengan metode pewarnaan biru tripan dan dibaca di bawah mikroskop.
6. Analisis Hasil
a. Metode Direct Counting
Apabila tidak didapatkan hasil dengan metode MTT (data fluktuatif),
maka dilakukan perhitungan langsung dengan menggunakan haemocytometer.
Jumlah sel hidup yang telah dihitung pada masing-masing kadar ekstrak etanolik daun sirih merah digunakan untuk menentukan presentase kematian dengan rumus
% Kematian sel = ( (A-B) / A ) x 100 % Keterangan : A = Jumlah sel hidup pada sumuran kontrol media
B =Jumlah sel yang hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan ekstrak etanolik daun sirih merah.
22
Dari data % tersebut, dibuat persamaan regresi linear antara log konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah vs harga probit. Dari persamaan regresi tersebut maka harga LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah dapat dihitung.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengumpulan dan Penyiapan Bahan
Daun sirih merah yang digunakan pada penelitian ini diambil dari tanaman yang tumbuh di daerah Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Jawa Tengah, pada bulan September 2007. Pengambilan bahan dari satu tanaman dan dalam sekali waktu pemanenan saja untuk menghindari adanya perbedaan kualitas kandungan kimia dalam daun. Dipilih daun yang tidak terlalu muda atau terlalu tua, sehingga diharapkan mempunyai kandungan senyawa aktif yang optimal. Daun yang dikumpulkan dibersihkan dari debu, serangga, serta benda asing yang terbawa saat pengumpulan daun sirih merah.
Daun yang sudah bersih kemudian dikeringkan dengan menggunakan oven. Tujuan pengeringan di oven adalah untuk mengurangi kadar air dan menghentikan reaksi enzimatik sehingga dapat mencegah kerusakan sampel.
Daun sirih merah yang telah kering kemudian diserbuk dengan menggunakan alat blender. Hal ini bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel. Apabila dalam bentuk serbuk, maka luas permukaan partikel daun menjadi lebih besar sehingga dapat mempengaruhi proses ekstraksi. Ukuran serbuk yang optimal akan memberikan hasil ekstraksi yang baik.
24
B. Ekstraksi
Serbuk daun sirih merah seberat 100 gram dimaserasi dengan etanol 70%. Pertimbangan dari penggunaan pelarut etanol karena etanol merupakan pelarut universal sehingga hampir semua kandungan kimia dapat terambil.
Penyarian simplisia daun sirih merah menggunakan metode maserasi karena metode ini memiliki beberapa kelebihan dibandingkan dengan metode ekstraksi yang lain. Selain itu metode maserasi tidak menggunakan pemanasan sehingga rusaknya senyawa-senyawa yang tidak tahan panas tinggi dapat dihindari. Metode ini sangat sederhana, mudah dilakukan dan cepat dalam pelaksanaannya. Maserasi dilakukan dalam bejana tertutup agar etanol tidak menguap karena etanol mudah menguap pada suhu kamar. Di samping itu juga untuk mencegah masuknya kontaminan dari luar dan menjaga supaya kedap udara karena ada senyawa-senyawa tertentu yang mudah teroksidasi oleh oksigen dari udara.
Bejana maserasi diletakkan di tempat gelap atau dibungkus dengan plastik hitam agar tidak terkena cahaya dan sinar matahari. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya reaksi senyawa-senyawa tertentu oleh adanya cahaya dan dan rusaknya senyawa-senyawa aktif oleh ultraviolet matahari.
Pada proses maserasi, serbuk daun sirih merah direndam selama 24 jam sambil sesekali diaduk. Perendaman dimaksudkan agar susunan sel sampel akan dapat larut dalam pelarut. Sedangkan pengadukan bertujuan agar pelarut dapat mengalir secara berulang-ulang ke dalam serbuk halus sehingga memungkinkan adanya interaksi antara pelarut dengan serbuk. Pada umumnya larutnya zat aktif
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
akan terjadi apabila pelarut menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang berisi zat aktif yang dapat larut dalam pelarut. Zat aktif dapat keluar dari rongga sel karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam dan di luar sel.
C. Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian disterilkan terlebih dahulu untuk menghilangkan adanya pengotor dan mencegah terjadinya kontaminasi oleh mikroorganisme yang akan mengganggu proses penelitian Alat-alat tersebut dicuci bersih, dikeringkan dan dibungkus dengan alumunium foil kemudian disterilisasi dilakukan selama kurang lebih 20 menit dengan suhu 1210C, tekanan 2,05 abs bar, menggunakan alat autoklaf. Prinsip sterilisasi yang digunakan ialah sterilisasi dengan uap bertekanan yaitu dengan menaikkan tekanan hingga suhu tinggi sehingga terbentuk uap air panas. Uap air panas tersebut akan membunuh mikroorganisme dengan menyebabkan terjadinya proses koagulasi dan denaturasi protein pada mikroorganisme.
Medium dan pereaksi yang akan digunakan juga disterilkan dengan menggunakan membran filter dengan pori-pori berukuran 0,22 μm. Pengotor dan kontaminan yang kemungkinan ada akan tersaring dan tertahan pada membran filter ini, sehingga medium dan pereaksi benar-benar bebas dari kontaminasi.
D. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah Terhadap Sel HeLa
Uji sitotoksisitas yang dilakukan pada awalnya adalah dengan menggunakan metode MTT. Prinsip uji sitotoksik dengan metode MTT adalah
26
kemampuan sel hidup mereduksi garam MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) menjadi kristal formazan. Kemampuan reduksi ini ditunjukkan oleh enzim suksinat dehidrogenase mitokondria pada sel yang viable/sel hidup yang masih melangsungkan proses respirasi.
Reaksi reduksi MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase ditunjukkan dengan gambar berikut
Gambar 1. Reaksi reduksi MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase
Senyawa MTT yang larut dalam air dan berwarna kuning setelah direduksi oleh suksinat dehidrogenase akan menjadi formazan yang berwarna biru.
Intensitas warna yang terbentuk kemudian ditetapkan absorbansinya
dengan pembacaan ELISA reader. Absorbansi yang terbaca ini berkorelasi
langsung dengan jumlah sel yang hidup. Semakin besar absorbansi berarti semakin banyak sel hidup yang aktif melakukan metabolisme dan sebaliknya, semakin kecil absorbansi yang terbaca menunjukkan semakin sedikit sel yang hidup. Metode ini dipilih dengan pertimbangan bahwa metode ini cukup baik, mudah, cepat, akurat, tidak menggunakan bahan radioaktif, dan sensitif karena mampu menghitung jumlah sel yang sedikit.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Namun pada penelitian, ternyata ELISA reader tidak mampu membaca
dengan tepat intensitas warna ungu formazan yang terbentuk akibat reaksi MTT dengan sel. Hal ini kemungkinan disebabkan karena ekstrak etanolik daun sirih merah yang digunakan sebagai senyawa uji memiliki warna coklat. Warna coklat ini dapat berpengaruh pada nilai absorbansi yang dihasilkan karena dimungkinkan terjadi penambahan intensitas warna sehingga absorbansi yang terbaca dapat menjadi lebih besar daripada nilai yang sebenarnya.
Pada penelitian ini dilakukan pengukuran absorbansi dari perlakuan dan kontrol pada masing-masing konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah. Perlakuan adalah sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etanolik daun sirih merah. dan kontrol adalah sel HeLa tanpa ada perlakuan.
Hasil yang diperoleh antara pembacaan absorbansi dengan ELISA reader ternyata tidak signifikan dengan hasil gambar sel. ELISA reader memberikan absorbansi yang rendah namun pada foto terlihat bahwa sel HeLa pada semua seri konsentrasi justru masih hidup. Padahal seharusnya apabila sel banyak yang hidup maka absorbansi yang diberikannya adalah tinggi.
Metode uji sitotoksisitas lain dapat dilakukan untuk mengatasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang berwarna coklat ini seperti metode Tripan Blue
yang tidak dipengaruhi oleh warna dari ekstrak Pada metode ini, penghitungan dilakukan secara manual terhadap sel hidup setelah sebelumnya sel diwarnai
dengan reagen Tripan Blue. Sel yang mati akan menyerap reagen sehingga
warnanya lebih gelap daripada sel hidup dan ekstrak yang berwarna tidak akan terlalu berpengaruh pada penghitungan sel.
28
Nilai absorbansi hasil uji sitotoksisitas dengan metode MTT pada inkubasi selama 24 jam dapat dilihat pada tabel berikut:
Tabel I. Tabel Nilai Absorbansi Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah pada Berbagai Konsentrasi dengan Metode MTT
Replikasi
I II III Konsentrasi
(µg/ml) Absorbansi Absorbansi Absorbansi
Kontrol 1,394 1,293 1,289 32000 0,798 0,875 0,821 16.000 0,679 0,679 0,681 8000 0,734 0,731 0,713 4000 0,778 0,727 0,735 2000 1,119 1,037 0,724 1000 0,973 0,921 0,923 500 1,329 1,367 1,315 250 1,655 1,674 1,513 125 1,496 1,530 1,440
Dari hasil uji sitotoksisitas dengan metode MTT didapatkan data absorbansi sampel yang lebih besar daripada absorbansi kontrol, dimana seharusnya absorbansi sampel lebih kecil daripada absorbansi kontrol. Hal itu disebabkan karena ekstrak etanolik daun sirih merah yang digunakan berwarna sehingga juga memberikan absorbansi dan menyebabkan absorbansi sampel meningkat. Oleh karena itu,maka selanjutnya uji sitotoksisitas dilakukan dengan menggunakan metode penghitungan langsung (direct counting)
Metode yang digunakan untuk menguji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah adalah metode penghitungan langsung (direct counting). Pada
prinsipnya, sel yang masih hidup setelah pemaparan dengan senyawa uji dihitung
secara langsung menggunakan mikroskop dengan bantuan haemocytometer.
Untuk membedakan sel yang hidup dan mati digunakan Tripan blue sebagai
pewarna. Sel yang mati akan berwarna biru tua karena menyerap Tripan blue
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
sedangkan sel yang hidup tetap bening dan bercahaya. Hal ini terjadi karena sel yang mati kehilangan integritas membrannya sehingga Tripan blue dapat masuk
ke dalam sel dan berikatan dengan protein-protein sel. Sel yang hidup tampak bulat,bening dan bercahaya karena membran sel masih utuh sehingga Tripan blue tidak dapat berikatan dengan protein-protein sel. Sel yang masih hidup tampak bercahaya karena sitoplasmanya masih utuh.
Kelemahan dari metode penghitungan langsung adalah subyektivitasnya yang tinggi dan membutuhkan waktu penghitungan yang lama. Untuk mengurangi subyektivitas, penghitungan diulang minimal 3 kali dan pengamatan bentuk sel yang hidup dan mati harus konsisten. Pemaparan sel dengan Tripan blue yang
terlalu lama dapat menyebabkan sel yang hidup juga menyerap Tripan blue dan lama – kelamaan sel dapat mati karena Tripan blue. Untuk mengatasi hal ini maka
penambahan Tripan blue ke dalam sumuran tidak dilakukan secara serempak
namun satu persatu tiap sumuran ditambah Tripan blue, dihomogenkan kemudian langsung dibaca. Media yang digunakan banyak mengandung protein dimana dimana protein-protein serum dalm media juga memiliki afinitas terhadap Tripan
blue. Hal ini juga dapat mempengaruhi pengamatan karena akan mempengaruhi
bidang pandang, yaitu saat pengamatan akan terlihat gelap dan kotor sehingga menyulitkan pengamatan sel hidup. Penghitungan secara langsung membutuhkan waktu yang cukup lama. Hal ini dapat berpengaruh pda stabilitas sel karena sel berada di suhu penyimpanan dengan suhu dan aliran CO2 yang berbeda.
30