Tata Cara Penelitian

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

F. Tata Cara Penelitian

Diambil 100 bungkus sampel teh hijau merk X dari satu perusahaan teh di Yogyakarta dengan nomor batch yang sama. Seluruh sampel kemudian diambil 80 % (80 bungkus) berdasarkan tabel Krecjie (Sugiyono, 2005). Pengambilan sampel dilakukan secara acak menggunakanrandom numbers table(lampiran 8).

2. Pembuatan serbuk teh hijau

Diambil 20 bungkus (1800 g) teh hijau, dihomogenkan, digiling dan dihaluskan menggunakan blender. Serbuk yang didapat kemudian diayak dengan ayakan nomor mesh 12 sampai 50 (derajat halus serbuk 4/18). Serbuk yang digunakan adalah serbuk yang berada di atas ayakan nomor mesh 50 dan di bawah ayakan nomor mesh 12.

3. Preparasi sampel

a. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau

Pembuatan fraksi etil asetat dan fraksi air diawali dengan pembuatan ekstrak etanol teh hijau menggunakan metode penyarian remaserasi (Anonim, 1986). Serbuk teh hijau sebanyak 300 g dimaserasi dengan cara direndam dalam 1 liter etanol 70 % selama 24 jam di dalam bejana bertutup. Maserat yang didapat disaring, filtrat dikumpulkan. Ampas dimaserasi lagi dengan 500 ml etanol 70 % selama 24 jam, kemudian disaring, filtrat dikumpulkan, ampas dimaserasi lagi, demikian seterusnya sampai filtrat hasil penyaringan jernih. Seluruh filtrat hasil remaserasi dicampur dan diuapkan pelarutnya dengan rotaevaporator sampai kental. Ekstrak kental yang didapat diuapkan di atas penangas air hingga diperoleh ekstrak kering.

b. Pembuatan fraksi etil asetat dan fraksi air

Ekstrak etanol kering hasil remaserasi ditimbang sebanyak 75 g dan dilarutkan dalam 150 ml air, kemudian difraksinasi dengan 100 ml kloroform menggunakan corong pisah, dengan pengulangan 6 kali. Fraksi air (A₁) yang didapat kemudian dikumpulkan dan difraksinasi dengan 50 ml etil asetat menggunakan corong pisah dengan pengulangan 12 kali sampai fraksi etil asetat jernih untuk mendapatkan jumlah senyawa terlarut dalam fraksi etil asetat yang optimum. Fraksi etil asetat dan fraksi air (A2) yang diperoleh kemudian dikumpulkan, lalu diuapkan menggunakan rotaevaporator hingga kental. Sisa penguapan diuapkan lagi di atas waterbath hingga kering, lalu disimpan dalam

desikator. Serbuk yang diperoleh kemudian ditimbang, dihitung rendemennya, dan digunakan sebagai sampel untuk uji penangkapan radikal hidroksil menggunakan metode deoksiribosa. Proses preparasi sampel dapat dilihat pada gambar 9.

Filtrat dikumpulkan Filtrat dikumpulkan

300 g serbuk teh hijau

Ekstrak kering

Fraksi air (A₂)

Dimaserasi dengan 1000 ml etanol 70 %, disaring

Residu dimaserasi dengan 500 ml etanol 70 %, disaring (diulangi sampai filtrat jernih)

Residu dibuang Dievaporasi

Dilarutkan dalam 150 ml air

Difraksinasi dengan 100 ml kloroform (6 kali)

Fraksi kloroform Fraksi air (A₁)

Ditimbang 75 g ekstrak kering

Difraksinasi dengan etil asetat 50 ml (12 kali)

Fraksi etil asetat

Diuji aktivitas penangkapan radikal hidroksilnya dengan metode deoksiribosa

Dibuang

4. Persiapan uji penangkapan radikal hidroksil a. Pembuatan larutan bufer fosfat pH 7,4

Ditimbang seksama sebanyak 1,4196 g Na2HPO4 kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 500,0 ml sehingga dicapai kadar 20 mM. Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,6805 g KH₂PO₄ kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 250,0 ml sehingga dicapai kadar 20 mM. Kedua larutan tersebut dicampur sampai didapat larutan bufer fosfat dengan pH 7,4.

b. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM

Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,02012 g 2-deoksi-D-ribosa, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 15 mM. Dari larutan tersebut diambil 4,2 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 25,0 ml, sehingga didapat kadar 2,5 mM.

c. Pembuatan reagen Fenton

Reagen Fenton yang digunakan terdiri dari FeCl31 mM, EDTA 1 mM, H₂O₂ 20 mM, dan Vitamin C 1 mM.

1). Larutan FeCl31 mM

Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,01352 g FeCl₃. 6 H₂O, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 5 mM. Dari larutan tersebut diambil 2,0 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml, sehingga diperoleh kadar 1 mM.

2). Larutan EDTA 1 mM

Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,01861 g Na₂EDTA. 2 H₂O, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 5 mM. Dari larutan tersebut diambil 2,0 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml, sehingga diperoleh kadar 1 mM.

3). Larutan H2O2 20 mM

Diambil 0,091 ml H₂O₂ 30 %, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 80 mM. Dari larutan tersebut diambil 2,5 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml, sehingga diperoleh kadar 20 mM.

4). Larutan Vitamin C 1 mM

Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,01761 g vitamin C, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai kadar 10 mM. Dari larutan tersebut diambil 1,0 ml dan dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml, sehingga diperoleh kadar 1 mM.

d. Pembuatan larutan TCA 5 %

Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 1,25 g TCA, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 25,0 ml sehingga dicapai kadar 5 % b/v.

e. Pembuatan larutan TBA 1 %

Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 0,25 g TBA, dimasukkan ke dalam beakerglass 100 ml dan ditambah akuades secukupnya, kemudian

dipanaskan di atas hot plate hingga seluruh TBA larut. Setelah itu, dilarutkan dalam akuades sampai 25,0 ml sehingga dicapai kadar 1 % b/v.

f. Pembuatan larutan uji fraksi etil asetat 1 mg/ml

Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 10 mg serbuk fraksi etil asetat, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai konsentrasi 1 mg/ml.

g. Pembuatan larutan uji fraksi air 1 mg/ml

Ditimbang seksama lebih kurang sebanyak 10 mg serbuk fraksi air, kemudian dilarutkan dalam akuades sampai 10,0 ml sehingga dicapai konsentrasi 1 mg/ml.

5. Penentuanoperating time(OT)

Diambil 600 l larutan deoksiribosa 2,5 mM, dimasukkan dalam tabung reaksi bertutup, kemudian ditambah dengan 300 l FeCl₃1 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300l H2O220 mM, 4,2 ml bufer fosfat pH 7,4, dan 300l vitamin C 1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 % dan 1,0 ml TBA 1 %, dipanaskan dalam waterbath pada suhu 80C selama 30 menit sampai terbentuk kromogen MDA-TBA yang berwarna merah muda, kemudian didinginkan, dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum teoritis (_maksteoritis) 532 nm selama 60 menit.

6. Penentuan panjang gelombang maksimum (maks)

Diambil 100, 300, dan 600 l larutan deoksiribosa 2,5 mM, dimasukkan dalam tabung reaksi bertutup, kemudian masing-masing ditambah dengan 300 l FeCl3 1 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300 l H2O220 mM, bufer fosfat pH 7,4 (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume larutan deoksiribosa yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml), dan 300l vitamin C 1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit. Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 % dan 1,0 ml TBA 1 %, dipanaskan dalam waterbathpada suhu 80 C selama 30 menit, sampai terbentuk kromogen MDA-TBA yang berwarna merah muda, kemudian didinginkan, dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 400-600 nm selamaoperating time.

7. Pembuatan larutan kontrol

Diambil 600 l deoksiribosa 2,5 mM, dimasukkan dalam tabung reaksi bertutup, kemudian ditambah dengan 300 l FeCl₃1 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300 l H2O2 20 mM, 4,2 ml bufer fosfat pH 7,4, dan 300 l vitamin C 1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 % dan 1,0 ml TBA 1 %, dipanaskan dalam waterbath pada suhu 80 C selama 30 menit sampai terbentuk kromogen MDA-TBA yang berwarna merah muda, kemudian didinginkan, dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi selama operating time.

8. Uji penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat

Diambil fraksi etil asetat 1 mg/ml dengan volume 200, 400, 600, 800, dan 1000 l, masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup. Ke dalam tiap-tiap tabung tersebut kemudian ditambah dengan 600 l deoksiribosa 2,5 mM, 300 l FeCl31 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300 l H2O2 20 mM, bufer fosfat pH 7,4 (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume larutan fraksi etil asetat yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml), dan 300l vitamin C 1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit. Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 % dan 1,0 ml TBA 1 %, dipanaskan dalamwaterbath pada suhu 80C selama 30 menit, sampai terbentuk kromogen MDA-TBA yang berwarna merah muda, kemudian didinginkan, dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi selama operating time.

9. Uji penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi air

Diambil fraksi air 1 mg/ml dengan volume 200, 400, 600, 800, dan 1000

l, masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup. Kemudian ke dalam tiap-tiap tabung tersebut ditambah dengan 600 l deoksiribosa 2,5 mM, 300 l FeCl₃1 mM, 300 l EDTA 1 mM, 300 l H₂O₂ 20 mM, bufer fosfat pH 7,4 (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume larutan fraksi air yang ditambahkan sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml), dan 300l vitamin C 1 mM. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit. Setelah itu ditambah 1,0 ml TCA 5 % dan 1,0 ml TBA 1 %, dipanaskan dalam

waterbathpada suhu 80 C selama 30 menit, sampai terbentuk kromogen MDA-TBA yang berwarna merah muda, kemudian didinginkan, dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi selama operating time.