BAB III METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun mimba, telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku (Backer dan Backuizen van den Brink, 1965).
2. Pengumpulan daun mimba
Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada bulan Juni 2006.
3. Sterilisasi alat dan bahan
Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 1210C.
4. Preparasi fraksi protein dari daun mimba
Daun tanaman mimba dikumpulkan segar, diseleksi, dan ditimbang sebanyak 400 gram. Daun kemudian dicuci bersih dengan air mengalir kemudian dibungkus plastik dan disimpan dalam freezer semalam. Bahan ditumbuk halus dalam mortir bersih dan steril dengan penambahan sedikit demi sedikit dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl pada suhu dingin (dengan penambahan es di sekitarnya). Bahan diperas dan disaring dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang diperoleh disentrifus dengan 4000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak gubal, dikumpulkan dalam beker gelas dan diukur volumenya. Supernatan ekstrak gubal yang diperoleh, diendapkan proteinnya dengan menambahkan amonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 10%. Penambahan amonium sulfat dilakukan sedikit demi sedikit, diikuti pengadukan teratur dengan
dengan kecepatan 10000 rpm 4ºC selama 25 menit. Supernatan (1) ditampung dalam labu ukur sedangkan endapan yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya endapan tadi didialisis dengan memasukkan larutan endapan dalam dapar natrium fosfat ke dalam membran dialisis yang salah satu ujungnya telah dijepit dengan penjepit khusus membran kemudian ujung membran yang lainnya ditutup dengan dijepit dengan penjepit khusus membran dengan kuat. Membran dialisis lalu digantung dalam bekerglass yang berisi dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sebanyak 1000 ml. Proses dialisis dilakukan dalam almari es selama semalam dengan di-stirrer perlahan dan dilakukan penggantian dapar natrium fosfat satu kali. Hasil dialisis disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 20 menit. Endapan hasil dialisis dibuang dan supernatan diambil. Supernatan ini merupakan sampel fraksi protein daun mimba dengan konsentrasi amonium sulfat 10% jenuh.
Supernatan (1), (2) dan (3) ditampung secara bertahap kemudian ditambah dengan ammonium sulfat hingga mencapai kejenuhan 20%, 30% dan 40% dengan menggunakan langkah yang sama dengan konsentrasi 10% jenuh.
5. Pengukuran kadar protein dengan spektrofotometri UV
Sampel fraksi protein daun mimba 10%, 20%, 30% dan 40%, masing-masing sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam kuvet 1 ml lalu ditambah 990 µl larutan dapar natrium fosfat 5 mM, diukur serapannya dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 280 nm dengan blanko larutan dapar natrium fosfat 5 mM. Untuk mengoreksi adanya serapan oleh asam nukleat pada panjang gelombang tersebut maka pengukuran juga dilakukan pada panjang gelombang 260 nm.
Perbandingan antar serapan pada 280 nm dan 260 nm merupakan rasio serapan R
280/260, dan digunakan untuk menghitung faktor koreksi dengan cara ekstrapolasi terhadap tabel kadar protein (Layne cit Candra, 2006). Selanjutnya, kadar protein dihitung dari perkalian antara serapan pada 280 nm, faktor koreksi dan faktor pengenceran.
6. Propagasi dan panen sel Myeloma a. Propagasi sel Myeloma
Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel Myeloma dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian (Freshney cit Candra, 2006).
b. Panen sel Myeloma
Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel
dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x104/100 μl dan siap dipakai untuk penelitian (Freshney cit Candra, 2006).
7. Propagasi dan panen sel Vero a. Propagasi sel Vero
Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel normal dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium M199. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium M199 yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian (Freshney cit Candra, 2006).
b. Panen sel Vero
Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), sel dicuci dengan FBS 10% sebanyak 3 ml. Untuk melepaskan sel-sel dari dinding flask,
diberi tripsin 2,5% sebanyak 1 ml. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan FBS 10% sebanyak 3 ml. Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang sama dan disentrifuse selama 5 menit. Untuk menghilangkan sisa tripsin, sel dicuci sekali lagi dengan menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet ditambah media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya lakukan perhitungan jumlah sel dengan menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x104/100 μl dan siap dipakai untuk penelitian (Freshney cit Candra, 2006).
8. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Myeloma
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl suspensi sel Myeloma dengan kepadatan 2,5x104/100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang telah berisi 100 μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 200 µg/ml pada sumuran A1, B1 dan C1 pada kolom 1, kemudian pada sumuran A2, B2 dan C2 di kolom 2 ditambahkan 100 μl suspensi sel Myeloma pada sumuran yang telah berisi 100 μl fraksi protein daun mimba dengan kadar 100 µg/ml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 sedangkan untuk faktor koreksi, 100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).
Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 2,5 μg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 50 μl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.
9. Uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero
Untuk uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba pada sel Vero
menggunakan langkah yang sama dengan uji sitotoksisitas fraksi protein pada sel
Myeloma, tetapi pada sel Vero menggunakan medium M199.