BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan ekstrak daun jambu monyet
a. Determinasi tumbuhan
Determinasi tumbuhan dilakukan menggunakan buku determinasi kunci determinasi (Van Steenis dan Bloembergen, 1987), dengan bantuan bagian tumbuhan berupa daun, bunga dan buah.
b. Pengumpulan daun jambu monyet
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun yang masih berwarna hijau tumbuhan jambu monyet (Anacardium occidentale L.) yang diperoleh dari satu pohon tanaman jambu monyet (Anacardium occidentale L.) yang tumbuh di desa Bogor, Kecamatan Cawas, Kabupaten Klaten, Jawa Tengah. Pengambilan sampel daun dilakukan saat tumbuhan mulai berbunga.
c. Pembuatan simplisia daun jambu monyet
Daun jambu monyet yang telah dikumpulkan, selanjutnya dicuci dengan menggunakan air mengalir untuk dibersihkan dari segala pengotor, kemudian ditiriskan. Setelah itu ditimbang sebagai berat basah sebesar 1,2 kg, lalu dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada suhu ruangan di tempat yang teduh selama enam hari, dan ditimbang sebagai bobot kering sebesar 0,75 kg. Daun kering yang diperoleh selanjutnya diserbuk dengan bantuan blender. Serbuk simplisia selanjutnya disimpan dalam wadah kedap udara.
d. Pembuatan ekstrak daun jambu monyet
Daun kering jambu monyet dan etanol 95%, dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dengan perbandingan satu bagian kering daun jambu monyet dan sepuluh bagian etanol 95%, di tempatkan pada shaker dan dibiarkan selama lima hari. Kemudian maserat disaring dengan menggunakan corong Bunchner dan dibantu dengan menggunakan pompa vaccum. Filtrat yang diperoleh selanjutnya dimasukkan ke dalam vaccum rotary evaporator, hingga diperoleh cairan yang cukup kental. Cairan ini selanjutnya dipindahkan ke cawan porselin untuk diuapkan sisa pelarutnya dengan bantuan waterbath, hingga diperoleh ekstrak kental berwarna hijau tua dan berbau khas.
2. Orientasi level kedua faktor penelitian
a. Orietasi level carbopol
Level faktor yang akan digunakan dalam penelitian ini ditentukan dengan melakukan orientasi level. Orientasi level faktor gelling agent carbopol dilakukan dengan mengembangkan carbopol dengan jumlah 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 dan 3 g dalam 100 mL air, kemudian didiamkan selama 24 jam. Selanjutnya ditambah dengan trietanolamin sampai terbentuk masa gel yang jernih dan pH 6-7. Setelah masa gel terbentuk, lalu ditambah gliserol dengan jumlah 5 g untuk masing-masing konsentrasi carbopol dicampur dengan kecepatan putar skala satu mixer selama 30 detik.
Gel kemudian diuji viskositasnya dengan menggunakan viscotester RION-4 Japan dan selanjutnya ditentukan level yang akan dipakai dalam penelitian. Massa gel yang telah terbentuk selanjutnya diuji daya sebar dengan cara menimbang 1 g gel di atas kaca bundar, selanjutnya sediaan ditimpa dengan kaca bundar yang lainnya dengan berat 55 g, ditunggu satu menit, kemudian diukur diameter penyebarannya dengan menggunakan penggaris dari empat bagian.
b. Orientasi level gliserol
Orientasi level gliserol dilakukan dengan cara menambahkan gliserol dengan massa 1, 3, 5, 7 dan 9 g dalam masa gel yang dibuat dari 2 g carbopol yang dikembangkan ke dalam 100 mL aquadest. Selanjutnya dicampur dengan kecepatan putar mixer skala satu selama 30 detik, lalu diuji viskositasnya. Gel yang telah terbentuk selanjutnya diuji daya sebar
dengan cara menimbang 1 g gel di atas kaca bundar, selanjutnya sediaan ditimpa dengan kaca bundar yang lainnya dengan berat 55 g, ditunggu satu menit, kemudian diukur diameter penyebarannya dengan menggunakan penggaris dari empat bagian.
3. Optimasi komposisi carbopol dan gliserol
a. Formula
Formula standar gel penyembuh luka dalam 100 g dengan komposisi masing masing ekstrak sebesar 2% (Patel, et. al., 2011).
R/ C. asiatica extract (%w/w) 2 g C. longa extract (%w/w) 2 g T. arjuna extract (%w/w) 2 g Carbopol 934 (%w/w) 2 g Propylene glycol 2 mL Ethanol 5 mL
Triethanolamine q. s. to neutralize the gel base
Air qs
Formula tersebut selanjutnya dimodifikasi sebagai berikut :
R/ Anacardii Folium Ekstrak 1 g
Carbopol 934 (%w/w) 0,5-2,0 g
Gliserol 1,0-5,0 g
Triethanolamine 1 g
Nipagin 0,1 g
b. Rancangan desain faktorial
Tabel I. Rancangan penelitian dengan aplikasi desain faktorial Carbopol Gliserol (1) 0,5 1 a 2,0 1 b 0,5 5 ab 2,0 5 Keterangan :
F(1) = konsentrasi carbopol level rendah, konsentrasi gliserol level rendah F(a) = konsentrasi carbopol level tinggi, konsentrasi gliserol level rendah F(b) = konsentrasi carbopol level rendah, konsentrasi gliserol level tinggi F(ab) = konsentrasi carbopol level tinggi, konsentrasi gliserol level tinggi c. Pembuatan sediaan gel ekstrak daun jambu monyet
Carbopol dikembangkan dalam sebagian aquades dengan cara menaburkan carbopol diatas aquades 100 mL, kemudian didiamkan di suhu kamar selama 24 jam. Carbopol yang telah mengembang selanjutnya ditambahkan trietanolamin sambil diaduk dengan menggunakan mixer dengan kecepatan skala satu selama 30 detik, sampai pH mencapai 6-7 dan terbentuk massa gel yang baik dan jernih). Selanjutnya gel yang telah terbentuk disterilisasi dengan menggunakan autoclave, dengan suhu 1210C selama 20 menit, dengan tekanan satu atmosfer.
Ekstrak kental daun jambu monyet, diencerkan dengan etanol 96% secukupnya, selanjutnya ditambahkan ke dalam campuran. Nipagin yang telah dilarutkan dalam air panas dimasukkan ke dalam campuran, selanjutnya diaduk dengan menggunakan mixer dengan kecepatan skala satu, selama setengah menit. Semua proses ini dilakukan di dalam LAF
(Laminary Air Flow), di ruang ini sebelumnya telah dilakukan sterilisasi dengan cara penyinaran ruangan dengan menggunakan lampu UV selama 24 jam.
4. Uji sifat fisik
a. Uji daya sebar
Pengujian daya sebar sediaan gel merupakan hasil modifikasi dari pengujian (Garg et. al., 2002), pengujian ini dilakukan dua hari setelah sediaan gel terbentuk. Pengukuran dilakukan dengan cara menimbang 1 g gel, lalu diletakkan pada lempeng kaca bulat berskala, selanjutnya diletakkan lagi lempeng kaca bulat yang lain keatasnya dengan berat 55 g, selanjutnya diukur diameter penyebarannya dari empat bagian sisi. Pengujian daya sebar ini dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
b. Uji viskositas
Uji viskositas dilakukan sesaat setelah sediaan gel terbentuk, dua hari, dua minggu, tiga minggu dan satu bulan. Masing-masing formula ditentukan viskositasnya dengan menggunakan alat viscotester Rion seri VT 04. Ukuran rotor yang digunakan adalah skala dua.
Pengukuran dilakukan dengan cara rotor yang akan digunakan dipasangkan pada alat, selanjutnya sediaan yang akan diuji dimasukkan ke dalam cup viscotester hingga hampir memenuhi wadah. Rotor dibenamkan ke dalam sediaan hingga sampai batas tertentu, lalu viscotester dihidupkan, rotor akan berputar, jarum penunjuk skala akan bergerak dan menunjukkan
besaran nilai viskositas. Nilai viskositas diketahui dengan membaca angka pada skala yang sesuai dengan rotor yang digunakan.
5. Uji stabilitas fisik gel
Pengujian stabilitas sediaan gel dilakukan dengan melihat nilai persentase pergeseran viskositas yang diperoleh dari selisih viskositas 48 jam dan satu bulan setelah sediaan gel terbentuk kemudian dikali 100%.
6. Uji efikasi gel dengan ekstrak daun jambu monyet terhadap hewan uji
Uji efikasi sediaan gel luka bakar ekstrak daun jambu monyet dilakukan pada tikus jantan galur Wistar dengan berat 200-250 g. Sediaan gel dibuat dari gelling agent konsentrasi 0,5% dan humektan 1%, dengan ekstrak etanol 1%. Pengujian dilakukan dengan cara punggung hewan uji dibersihkan dari rambut, kemudian dianestesi menggunakan Kethamin dengan dosis 0,1 mL/250 g bobot hewan uji yang diberikan secara intraperitoneal (ip). Langkah selanjutnya pada empat bagian punggung ditempel plat logam panas dengan diameter 1,7 cm selama selama dua detik, sebelumnya plat logam tersebut sudah dipanaskan di nyala api Bunsen selama lima menit, sehingga menghasilkan luka bakar sebanyak empat luka pada punggung hewan uji.
Masing-masing luka diberikan perlakuan : diberi sediaan gel dengan ekstrak etanol daun jambu monyet, sediaan Gel Betadine® obat luka bakar sebagai kontrol positif, basis gel tanpa ekstrak etanol daun jambu monyet dan satu luka tidak diberi perlakuan sebagai kontrol negatif. Luka yang terbentuk selanjutnya diukur diameternya, lalu ditutup dengan kasa steril dan hewan uji masing-masing ditempatkan pada kandang yang terpisah.
Pengujian efikasi sediaan dari tumbuhan untuk menyembuhkan luka bakar pada hewan uji dilakukan selama tujuh hari (Rumayar, Yamlean dan Edy, 2011). Selanjutnya dilakukan pengukuran diameter masing-masing luka bakar pada tiap hewan uji setiap hari hingga hari ke tujuh menggunakan jangka sorong.
Nilai perubahan diameter diperoleh dari selisih diameter luka bakar pada hari ke-0 dan hari ketujuh. Data yang diperoleh selanjutnya diolah dengan menggunakan uji analisis varian ANOVA satu arah dengan aplikasi R-12.4.1, untuk mengetahui signifikansi, selanjutnya dilakukan pengujian dengan uji-T sampel saling bebas antar dua kelompok perlakuan untuk menentukan apakah terdapat perbedaan yang signifikan atau tidak.
Perhitungan diameter rata-rata luka bakar
Cara perhitungan diameter luka bakar pada hewan uji dapat dilihat pada gambar berikut ini :
Gambar 3. Cara pengukuran diameter luka pada hewan uji
Rumus : dx = d1 + d2 + d3 + d4
4
Keterangan :
dx : diameter luka pada hari ke x
d1, d2, d3, d4 : diameter luka (Simanjuntak, 2008).
d4
d3 d1
7. Skrining Fitokimia
a. Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g simplisia dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan air panas, selanjutnya didinginkan sambil dikocok kuat selama sepuluh detik, jika terbentuk buih yang mantap setinggi 1-10 cm, tidak kurang dari sepuluh menit dan tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N, menunjukkan adanya kandungan saponin (Ciulei, 1985). b. Pemeriksaan tanin
Ekstrak etanol (0,5-1 mL) diencerkan dengan aquadest (1-2 ml), kemudian ditambahkan satu sampai dua tetes pereaksi besi (III) klorida. Hasil positif jika terbentuk warna biru atau hijau kehitaman (Ciulei, 1985).