BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Pengumpulan, penyiapan dan penyerbukan simplisia rimpang kencur Serbuk rimpang kencur (Kaempferia galanga L.) didapat dari Laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
2. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman dilakukan untuk membuktikan kebenaran tanaman kencur yang digunakan. Determinasi tanaman kencur dilakukan oleh bagian Laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
3. Pembuatan ekstrak rimpang kencur
Ekstrak rimpang kencur diperoleh dengan proses maserasi. Serbuk rimpang kencur ditimbang sebanyak 50 gram, ditempatkan dalam erlenmeyer 750 mL, ditambahkan 500 mL etanol 95% kedalam erlenmeyer yang berisi serbuk rimpang kencur. Kemudian dilakukan maserasi selama 48 jam dengan menggunakan maserasi mekanis, setelah dilakukan maserasi mekanis selanjutkan
dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring dengan bantuan destilat vakum dan proses diulangi 1 kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Setelah tahap maserasi selesai maka dilakukan penguapan dengan rotary evaporator dan waterbath sampai kandungan pelarut dalam ekstrak kurang dari 10%.
4. Uji kualitatif EPMS
Ekstrak kencur yang didapat dari proses maserasi selanjutnya dilakukan uji kualitatif. Uji ini bertujuan untuk memastikan apakah benar dalam ekstrak kencur yang diperoleh dalam penelitian ini mengandung EPMS, dengan cara: Sampel ditimbang sebanyak 50 mg, kemudian diekstraksi dengan menggunakan etanol 2 ml, lalu disentrifugasi pada kecepatan 600 rpm selama 2 menit. Sampel sebanyak 10 µl ditotolkan pada plate silikagel 60 F254., setelah itu dimasukkan ke dalam chamber yang berisi jenuh fase gerak hexan-etil asetat dengan perbandingan (40:10). Eluasikan hingga batas, plate diangkat dan dikeringkan, kemudian diamati di bawah sinar UV. Pereaksi vanillin asam sulfat disemprotkan pada plate yang sudah kering, dan yang terakhir plate dipanaskan pada suhu 110oC hingga spot maksimum.
5. Penentuan nilai SPF ekstrak kencur
Ekstrak kencur ditimbang sebanyak 0,04 gram, lalu dilarutkan dalam 10 mL etanol p.a dan diaduk sampai homogen. Kemudian larutan tersebut diencerkan dengan cara mengambil 5 mL larutan tersebut yang dilarutkan dalam 10 mL etanol p.a dan diencerkan lagi dengan mengambil 5 mL larutan tersebut yang
dilarutkan dalam 10 mL etanol p.a. Lalu dari larutan tersebut diambil lagi 1 mL dilarutkan dalam 10 mL etanol p.a dan diencerkan lagi dengan mengambil 1 mL dilarutkan dalam 10 mL etanol p.a sehingga didapatkan konsentrasi larutan sampel ekstrak kencur 10 ppm.
Pengukuran selanjutnya dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 290-330 nm menggunakan kuvet dengan tebal 1 cm dan etanol (kualitas p.a) sebagai pelarut dan blanko. Data serapan dibaca pada rentang panjang gelombang 290-330 nm dengan interval 2,5 nm. Menggunakan metode perhitungan A.J. Petro (1981), dihitung nilai SPF dengan rumus:
Log SPF =
n- 1 ... (6)
SPF = Antilog SPF ... (7)
6. Formula emulgel a. Formula
Formula standar: Formulation and Evaluation of Optimized Clotrimazole Emulgel Formulations (Yassin, 2014).
Tabel IV. Formula standar
Bahan Formula Clotrimazole 1 g Carbopol 934 1 g Parafin cair 7,5 g Tween 20 1 g Span 20 1,5 g Propilen glikol 5 g Etanol 2,5 g Metil paraben 0,03 g Propil paraben 0,01 g Purified water to 100 ml
Formula hasil modifikasi (untuk 200 gram) tersaji dalam tabel V.
Tabel V. Formula emulgel yang telah dimodifikasi
Formula 1 a b ab
Ekstrak rimpang kencur 4 g 4 g 4 g 4 g
Carbopol® 940 2 g 3 g 2 g 3 g Propilen glikol 10 g 10 g 25 g 25 g Span 80 3 g 3 g 3 g 3 g Tween 80 2 g 2 g 2 g 2 g TEA 1,5 g 1,5 g 1,5 g 1,5 g Parafin Cair 10 g 10 g 10 g 10 g Metil Paraben 0,2 g 0,2 g 0,2 g 0,2 g Propil paraben 0,8 g 0,8 g 0,8 g 0,8 g Aquadest (mL) 150 g 150 g 150 g 150 g b. Pembuatan emulgel
Carbopol® 940 dikembangkan dalam 80 mL aquadest selama 24 jam. Fase minyak dibuat dengan mencampurkan Span 80, parafin cair, propil paraben, dan ekstrak kencur di atas waterbath pada suhu 50oC. Fase air dibuat dengan mencampur Tween 80 dengan propilen glikol yang sebelumnya telah dicampur metil paraben di atas waterbath pada suhu 50oC. Fase minyak dan fase air dicampur bersama dengan sisa aquadest, campuran di mixer pada kecepatan skala 1 selama 10 menit.
Emulsi selanjutnya dicampurkan ke dalam Carbopol® 940 yang sebelumnya telah dikembangkan dengan aquadest dengan kecepatan putar mixer pada skala 1 selama 10 menit. Trietanolamin ditambahkan ke dalam
campuran sampai pH 6, kemudian campuran diaduk kembali menggunakan
mixer kecepatan skala 1 selama 5 menit.
7. Uji sifat fisik dan stabilitas emulgel sunscreen ekstrak kencur a. Uji organoleptis
Uji organoleptis dilakukan dengan mengamati bentuk, bau, warna, dan homogenitas emulgel sunscreen ekstrak kencur 48 jam setelah pembuatan. b. Uji pH
Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan indikator pH universal, yaitu dengan memasukkan indikator pH universal (pH strips) ke dalam emulgel ekstrak kencur yang telah dibuat. Kemudian nilai pH ditentukan dengan cara membandingkan warna yang dihasilkan dengan standar.
c. Pengujian tipe emulgel dengan metode pengenceran
Emulgel diletakan di atas gelas arloji kemudian diencerkan dengan fase air (aquadest) dengan volume dua kali lipat volume emulgel, demikian juga dengan menggunakan fase minyak (parafin cair). Pengamatan dilakukan dengan melihat apakah emulgel bercampur atau tidak.
d. Uji viskositas
Pengukuran viskositas menggunakan alat Viscometer Rion seri VT 04 dengan cara sediaan emulgel dimasukkan kedalam wadah dan dipasang pada
portable viscometer. Sediaan emulgel dituang ke dalam wadah viscotester,
kemudian rotor nomor 2 dipasangkan pada alat dan didiamkan terlebih dahulu selama lima menit. Pendiaman ini bertujuan selain menyamakan perlakuan juga untuk memastikan jarum penunjuk pada alat menunjukkan angka yang
pasti dan tidak naik turun. Nilai viskositas emulgel ditunjukkan dengan skala yang ditunjukkan oleh jarum pada alat viscotester tersebut. Viskositas yang dikehendaki pada penelitian ini antara 150-300 d.Pa.s.
Pengujian viskositas dilakukan dalam lima periode, yaitu 48 jam setelah pembuatan, 7 hari, 14 hari, 21 hari, dan 28 hari untuk mengetahui persentase pergeseran viskositas. Nilai persen pergeseran viskositas diperoleh dengan cara menghitung selisih antara viskositas sediaan 48 jam setelah pembuatan dengan viskositas setelah penyimpanan selama 28 hari dibandingkan dengan viskositas sediaan 48 jam setelah pembuatan dikalikan 100%. Pergeseran viskositas yang dikehendaki adalah kurang dari 10%.
e. Uji daya sebar
Pengukuran daya sebar dilakukan 48 jam setelah pembuatan emulgel. Pengukuran dilakukan dengan cara emulgel ditimbang 1 gram kemudian emulgel diletakkan di tengah lempeng kaca bulat berskala. Di atas emulgel diletakkan kaca bulat lain yang transparan dan anak timbang dengan berat total 125 gram. Lalu didiamkan selama 1 menit dan dicatat diameter penyebarannya (Garg, Anggarwal, Garf, dan Singla, 2002). Setelah itu dihitung diameter penyebarannya pada posisi vertikal, horisontal, dan diagonal. Daya sebar yang diinginkan pada penelitian adalah pada rentang 3-5 cm.
8. Uji iritasi dengan HET-CAM
Telur ayam kampung fertil yang sudah diinkubasi selama 10 hari dipilih lalu dibuka cangkang pada bagian yang punya rongga udara, membran dalam yang menutupi dihilangkan dengan cara dibasahi terlebih dahulu dengan larutan
NaCl 0,9% hingga membran berwarna bening kemudian membran dibuang dengan bantuan pinset. Sejumlah sampel emulgel ditempatkan pada permukaan
Chorioallantoic Membrane. Perubahan pembuluh darah yang terjadi meliputi hemoragi (adanya pembekuan darah disekitar pembuluh darah Chorioallantoic Membrane), lisis (hilangnya pembuluh darah Chorioallantoic Membrane), dan koagulasi (pendarahan dari darah Chorioallantoic Membrane) diamati. Pengujian juga dilakukan pada masing-masing formula dan digunakan NaOH sebagai kontrol positif dimana NaOH bersifat iritan apabila di aplikasikan pada kulit.
Efek iritasi yang terjadi diberi skor sesuai dengan waktu awal terjadinya hemoragi, lisis, dan koagulasi sehingga dapat ditentukan skor iritasinya. Tingkat iritasi ditentukan dari nilai rata-rata skor ketiga telur dan dapat dikategorikan apakah terjadi iritasi lemah, sedang, kuat atau tidak mengiritasi.
