BAB II PENELAAHAN PUSTAKA
E. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita,
2004).
Prosedur validasi metode analisis digunakan untuk membuktikan bahwa
metode analisis tersebut dapat memberikan hasil seperti yang diharapkan dengan
kecermatan dan ketelitian yang memadai. Metode analisis instrumen merupakan
metode yang terpilih dan memadai untuk mengantisipasi persoalan analisis yaitu
sangat kecilnya kadar senyawa yang dianalisis (Mulja dan Suharman, 1995).
Metode uji yang berbeda membutuhkan validasi yang berbeda. Kategori
metode pengujian dengan validasi metode yang diperlukan adalah sebagai berikut,
seperti yang juga dicantumkan dalam Tabel III (United States Pharmacopeial
Tabel III. Elemen Data yang Dibutuhkan untuk Validasi Metode Analisis Karakteristik analisis Kategori I Kategori II Kategori III Kategori IV Kuantitatif Batas Tes
Ketepatan Ya Ya * * Tidak
Ketelitian Ya Ya Tidak Ya Tidak
Spesifitas Ya Ya Ya * Ya
Batas Deteksi Tidak Tidak Ya * Tidak Batas Kuantitasi Tidak Ya Tidak * Tidak Linearitas Ya Ya Tidak * Tidak
Rentang Ya Ya * * Tidak
Keterangan : * tergantung dari masing-masing uji
1. Kategori I: metode analitik yang digunakan untuk penetapan kadar komponen
utama dalam bahan baku atau bahan aktif (termasuk pengawet) dalam produk
akhir sediaan farmasi;
2. Kategori II: metode analitik yang digunakan untuk penetapan ketidakmurnian
dalam bahan baku atau bahan aktif atau hasil degradasi senyawa dalam produk
akhir sediaan farmasi;
3. Kategori III: metode analitik yang digunakan untuk penetapan karakteristik
penampilan obat (misalnya disolusi, pelepasan obat);
4. Kategori IV: metode analitik yang digunakan untuk uji identifikasi (United
States Pharmacopeial Convention, 2005).
Beberapa parameter yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode
analisis meliputi antara lain selektivitas/spesifisitas, ketepatan, ketelitian,
linearitas, rentang, batas deteksi, batas kuantitasi, ketangguhan metode dan
kekuatan (Harmita, 2004).
Selektivitas suatu metode analisis adalah kemampuan untuk
mengukur analit secara cermat dan seksama dengan adanya komponen yang
mungkin ada dalam matrik sampel (Yuwono dan Indrayanto, 2005).
Selektivitas sering dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode
terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran,
produk degradasi, senyawa sejenis, dan senyawa asing lain (Harmita, 2004).
Gambar 6. Simulasi pemisahan peak
Gambar 7 merupakan suatu simulasi pemisahan puncak kromatografi
antara dua kurva Gaussian identik, yang terpisah secara perlahan-lahan. Dapat
dilihat bahwa nilai resolution factor (R) akan sesuai dengan diagram. Dimana
nilai R = 0,75 kedua puncak masih berhimpit sekitar 65%, pada R = 1, kedua
puncak masih berhimpit sekitar 27%, dan pada R=1,5 kedua puncak dapat
dianggap telah akan mencapaibaselinedimana kedua puncak hanya berhimpit
sekitar 2% (Rouessac and Rouessac, 2007).
Selektivitas pada metode kromatografi ditunjukkan melalui nilai
resolusi (daya pisah) antara analit yang dituju dengan pengganggu lainya
resolution, yaitu pemisahan sempurna dari dua puncak dengan ukuran yang
sama (Pecsok, Shield, Cairns and McWilliam, 1976).
2. Ketepatan (accuracy)
Ketepatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil
analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Biasanya dinyatakan sebagai
persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan (Harmita,
2004). Akurasi biasanya didemostrasikan dengan menambahkan sejumlah
tertentu analit yang diketahui kedalam matriks sampel dan ditentukan hasil
terukurnya menggunakan prosedur analisis yang dilakukan (The British
Pharmacopoeia Commission, 2011).
Kriteria penerimaan akurasi ditentukan berdasarkan kadar analit,
dinyatakan dalam persen (%) perolehan kembali, seperti yang tertera pada
tabel IV:
Tabel IV. Kriteria Penerimaan Akurasi pada Konsentrasi Analit yang Berbeda
Kadar Analit (%) Analyte Ratio Unit Mean Recovery (%) 100 1 100 % 98 102 10 101 10 % 98 102 1 102 1 % 97 103 0,1 103 0,1 % 95 105 0,01 104 100 ppm 90 107 0,001 105 10 ppm 80 110 0,0001 106 1 ppm 80 110 0,00001 107 100 ppb 80 110 0,000001 108 10 ppb 60 115 0,0000001 109 1 ppb 40 -120
3. Ketelitian (precision)
Pesisi atau keseksamaan asalah ukuran yang menunjukkan derajat
kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil
individual dari rata-rata jika prosedur ditetapkan secara berulang pada sampel-
sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004).
Presisi biasanya dinyatakan dalam coefficient of variation (CV).
Suatu metode dapat dinyatakan memiliki presisi yang baik apabila memiliki
CV < 2 % tetapi kriteria ini fleksibel tergantung dari kondisi analit yang
diperiksa, jumlah sampel dan kondisi laboratorium (Harmita, 2004).
Ketelitian adalah derajat kesesuaian antara hasil uji individual yang
diperoleh dari pengambilan sampel yang berulang suatu sampel yang
homogen dengan menggunakan suatu metode analisis. Presisi umumnya
dinyatakan dengan coefficient of variation (CV) atau standar deviasi relatif
(RSD), seperti yang tertera pada tabel V (United States Pharmacopeial
Convention, 2005):
Tabel V. Kriteria Penerimaan Presisi pada Konsentrasi Analit yang Berbeda
Kadar Analit (%) Analyte Ratio Unit CV (%)
100 1 100 % 1,3 10 101 10 % 1,8 1 102 1 % 2,7 0,1 103 0,1 % 3,7 0,01 104 100 ppm 5,3 0,001 105 10 ppm 7,3 0,0001 106 1 ppm 11 0,00001 107 100 ppb 15 0,000001 108 10 ppb 21 0,0000001 109 1 ppb 30
4. Linearitas (linearity)
Linearitas merupakan kemampuan metode untuk memberikan respon
yang proporsional terhadap konsentrasi analit di dalam sampel (Snyder et al.,
1997).
Penggambaran linearitas secara visual biasanya dilakukan dengan
memplotkan signal yang muncul sebagai fungsi dari konsentrasi analit. Apabila
terdapat hubungan yang linier, hasil uji harus dievaluasi dengan bantuan
metode statistik, misalnya dengan perhitungan garis regresi (The British
Pharmacopoeia Commission, 2011).
Regresi liner merupakan suatu metode statistik untuk mengevaluasi
bagaimana pengaruh satu atau lebih variabel bebas (predictor) pada satu
continuous dependent variable(respon) melalui suatu hubungan linear. Regresi
linier melibatkan suatu garis lurus atau fungsi linier. Garis ini merupakan
estimasi dari data sampel. Analisis dengan regresi linier dilakukan dengan
menggambarkan garis yang tepat diantara titik-titik data. Dari sini kemudian
akan diketahui kemiringan garis dan nilai dari y-interceptnya yang kemudian
dapat digunakan untuk perhitungan, dirumuskan dengan y=Bx+A. Dimana y
adalah variabel tergantung, B adalah nilai slope (kemiringan) garis, x adalah
variabel bebas dan A adalah y-intercept (De Muth, 1999). Hubungan antara
garis linear dengan regresi linear disebut sebagai koefisien determinasi (r2). Koefisien determinasi menggambarkan kedekatan titik dengan garis linear,
semakin dekat titik dengan garis berarti semakin dekat hubungan korelasinya.
Muth, 1999). Suatu metode memiliki linearitas yang baik jika nilai koefisien
determinasi (r2) 0,997 (Chan, 2004).
Menurut De Muth (1999) linearitas ditunjukkan dengan nilai
koefisien determinasi (r2) dan koefisien korelasi (r) yang didapat dari
perhitungan regresi linear. Dimana koefisien determinasi (r2) menunjukkan
hubungan antara garis linear dengan respon dan koefisien korelasi (r)
menunjukkan hubungan antara konsentrasi dan respon pengukuran. Semakin
dekat nilai respon dengan garis linear, semakin linear data tersebut dan
semakin kuat hubungan korelasinya. Suatu metode dikatakan memiliki
linearitas yang baik apabila memiliki nilai r2 0,997 (Chan, 2004).
5. Rentang (range)
Rentang dalam suatu metode analisis merupakan interval antara
konsentrasi analit tertinggi dan konsentrasi analit terendah yang memenuhi
persyaratan linearitas, akurasi, dan presisi. Dalam suatu assay biasanya
menggunakan rentang tidak kurang dari 80%-120% dari konsentrasi sampel
dan untuk penetapan keseragaman kadar biasanya digunakan rentang tidak
kurang dari 70%-130% (The British Pharmacopoeia Commission, 2011).
6. Batas deteksi (Limit of Detection)
Batas deteksi merupakan parameter uji batas yang diartikan sebagai
jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih
memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko (Harmita,
7. Batas kuantifikasi (Limit of Quantification)
Batas kuantifikasi (LOQ) merupakan parameter dari suatu
quantitative assay untuk level rendah dari komponen didalam sampel,
biasanya digunakan untuk penentuan impurities dan/atau produk yang telah
terdegradasi. LOQ diartikan sebagai batas terendah dari jumlah analit dalam
sampel yang masih dapat ditentukan secara kuantitatif dan memberikan
akurasi dan presisi yang baik. (The British Pharmacopoeia Commission,
2011). Menurut Harmita (2004), Batas kuantitasi merupakan parameter pada
analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel
yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.
8. Ketangguhan metode
Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang
diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal,
seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang
berbeda, dll. Ruggednessbiasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh
perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji (Harmita, 2004).
9. Kekuatan (robustness)
Robustness suatu prosedur analisis adalah ukuran kapasitas untuk
tetap tidak terpengaruh oleh variasi kecil tapi disengaja dalam parameter
metode dan memberikan indikasi keandalannya selama penggunaan normal.
Biasanya ditunjukkan dengan melakukan perubahan kecil yang disengaja
membandingkan hasilnya dengan yang diperoleh menggunakan metode yang
sesuai prosedur (The British Pharmacopoeia Commission, 2011).
Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan
metodologi yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik
dan efek presisi dan akurasi. Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisis
yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah. Faktor orisinal ini
dapat diidentifikasi sebagai A, B, dan C. Perubahan nilai faktor-faktor ini
dapat diidentifikasi dengan a, b, dan c. Lakukan analisis pada kondisi yang
telah disebutkan pada pemeriksaan ketangguhan (Harmita, 2004).
