PENGEMBANGAN ENZIM REKOMBINAN
REVERSE
TRANSCRIPTASE
SIMIAN BETARETROVIRUS
SEROTIPE-2
ISOLAT INDONESIA ASAL MONYET EKOR PANJANG
UUS SAEPULOH
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul “Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 Isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2013
RINGKASAN
UUS SAEPULOH. Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 Isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang. Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI, DIAH ISKANDRIATI, dan DEDY DURYADI SOLIHIN.
Reverse transcriptase (RT) retrovirus merupakan suatu enzim multifungsi yang mengkatalisis pembentukan DNA utas ganda dari RNA utas tunggal genom retrovirus. Proses yang kompleks ini disebut dengan transkripsi balik (reverse transcription) yaitu suatu tahapan yang sangat penting dalam siklus hidup retrovirus dan bertanggung jawab terhadap replikasi genomnya. Di bidang bioteknologi, enzim RT retrovirus telah dimanfaatkan sebagai salah satu perangkat yang sangat penting dalam bidang biologi molekuler yaitu untuk menyintesis DNA komplementer (cDNA) dari mRNA. Aplikasi dari enzim RT ini telah memberikan pemahaman yang luas mengenai sejumlah mekanisme regulator seluler. Selain itu, kombinasi antara aktivitas RT dengan amplifikasi PCR telah menjadi suatu gold standard dalam proses pengklonaan daerah penyandi gen (coding region) dari berbagai sasaran gen yang diinginkan. Di bidang biomedis, enzim RT asal virus HIV-1 (human immunodeficiency virus) merupakan enzim yang paling banyak dipelajari sebagai sasaran utama dalam pengembangan senyawa obat antiretrovirus untuk terapi penyakit AIDS (acquired immunodeficiency syndrome).
Simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) merupakan agen penyebab terjadinya sindroma penurunan kekebalan tubuh dan bertanggung jawab terhadap terjadinya morbiditas dan mortalitas pada satwa primata monyet Asia genus Macaca. Infeksi SRV-2 pada Macaca juga dapat menjadi faktor pengganggu (confounding variable) dalam penelitian biomedis yang menggunakan satwa primata ini sebagai hewan model penelitian. Namun demikian, terdapat potensi menguntungkan yang dapat dieksplorasi dengan mempelajari virus SRV-2 ini. Virus ini dapat dijadikan sebagai model untuk mempelajari retrovirus lainnya terutama terhadap HIV/AIDS melalui pemahaman mekanisme interaksi dengan inangnya dan efek imunosupresi, mekanisme infeksi, struktur virus, serta pengembangan antiretrovirus dan vaksinnya. Sebagaimana karakteristik yang dimiliki oleh semua retrovirus, SRV-2 mempunyai kemampuan untuk mentranskripsi balik genom RNA-nya menjadi DNA utas ganda melalui aksi dari enzim reverse transcriptase. Adanya gen penyandi enzim RT pada SRV-2 sangat potensial untuk dipelajari dan dimanfaatkan sebagai model enzim RT untuk pengembangan kandidat senyawa obat anti-RT terhadap retrovirus. Selain itu, dapat dimanfaatkan juga melalui pengembangan enzim rekombinan RT SRV-2 untuk diaplikasikan dalam bidang biologi molekuler.
Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk menghasilkan enzim rekombinan RT SRV-2 isolat Indonesia asal monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) melalui tahapan penelitian: Isolasi, pemodelan struktur 3D dan karakterisasi molekuler, ekspresi gen menggunakan sistem ekspresi Escherichia coli, pemurnian, analisis hasil ekspresi dan uji aktivitas enzim rekombinan RT SRV-2.
Pemodelan struktur 3D dilakukan menggunakan program I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) yang divisualisasi dengan program PyMol. Ekspresi gen target RT SRV-2 dilakukan dalam sistem ekspresi E.coli dengan metode Gateway technology menggunakan vektor entry pENTR/SD/TOPO dan vektor destinasi pDEST17 yang diekspresikan dalam E.coli BL21AI. Pemurnian enzim rekombinan dilakukan menggunakan kromatografi afinitas Ni2+-NTA yang dilanjutkan dengan analisis ekspresi dengan teknik SDS-PAGE dan Western blot. Aktivitas enzim dianalisis menggunakan RT colorimetric assay dan diaplikasikan pada teknik reverse transcription PCR (RT-PCR).
Gen penyandi enzim RT SRV-2 isolat Indonesia asal monyet ekor panjang telah berhasil diisolasi. Runutan nukleotida gen RT SRV-2 berada di daerah pol posisi 3284-4925 menyandikan 547 asam amino yang meliputi domain polimerase dan RNase H. Program komputasi I-TASSER berhasil memprediksi struktur tiga dimensi RT SRV-2 yang terdiri atas domain palm/finger, thumb, connection dan RNase H. Situs aktif polimerase mengandung tiga residu aspartat pada sisi katalitiknya yaitu Asp90, Asp165, Asp166 dan mempunyai motif sangat lestari (conserved region) YMDD yaitu Tyr163, Met164, Asp165, dan Asp166. Model
struktur ini memiliki homologi tertinggi dengan RT HIV-1 (2B6A). Domain
RNase H juga berhasil ditentukan struktur molekulnya secara parsial yang mempunyai homologi dengan RNase H E.coli (1GOA) dan RNase H HIV-1 (3HYF). Situs katalitik RNase H SRV-2 mengandung tiga asam amino dengan residu karboksilat yaitu Asp436, Glu465 dan Asp486.
Gen RT SRV-2 berhasil diekspresikan melalui tahapan pengklonaan pada vektor pENTR/SD/TOPO dan disubklonakan pada vektor pDEST17. Analisis hasil ekspresi menggunakan teknik SDS PAGE dan Western blot menunjukkan adanya pita protein spesifik berukuran 64.9 kDa yang diperkirakan sebagai enzim rekombinan RT SRV-2. Pemurnian terhadap enzim rekombinan RT SRV-2 menghasilkan 312 µg mL-1 protein yang memiliki aktivitas enzim sebesar 7.1 Unit (U) µL-1. Aplikasi enzim rekombinan SRV-2 RT pada teknik RT-PCR terhadap target gen -globin dan -aktin menunjukkan bahwa enzim ini mampu mentranskripsi balik mRNA menjadi cDNA. Hal ini ditunjukkan dengan adanya pita DNA berukuran 206 base pairs (bp) dan 350 bp yang spesifik untuk gen -globin dan -aktin. Dengan demikian, enzim rekombinan RT SRV-2 memiliki aktivitas yang mirip dengan enzim komersial sejenis, meskipun aktivitasnya masih rendah.
Kata kunci: reverse transcriptase, enzim rekombinan RT SRV-2, I-TASSER, sistem ekspresi Escherichia coli
SUMMARY
UUS SAEPULOH. Development of Serotype-2 Simian Betaretrovirus Reverse Transcriptase Recombinant Enzyme Isolated from Indonesian Cynomolgus Monkey. Supervised by DONDIN SAJUTHI, DIAH ISKANDRIATI, and DEDY DURYADI SOLIHIN.
Reverse transcriptase (RT) is a multifunctional enzyme that catalyzes the formation of double-stranded DNA from single-stranded RNA viral genomes. Reverse transcription is an essential and critical step in life cycle of all retroviruses replication. RT has become an important enzyme in molecular biology, genetics and medicine for the synthesis of complementary DNA (cDNA) from messenger RNA (mRNA). The application of this enzyme combining with PCR amplification technique (RT-PCR) has expanded our knowledge of numerous cellular regulatory mechanisms and has become a gold standard to facilitate the coding region cloning of any gene of interest. The development of biotechnology has been relying on the availability of this efficient RT. In biomedical fields, RT of human immunodeficiency virus (HIV), the virus causing acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) has been the most studied enzyme due to the prime target for the development of antiretroviral drug therapy of HIV/AIDS.
Simian betaretrovirus serotype-2 (SRV-2) is the causative agent of simian acquired immunodeficiency syndrome (SAIDS) in Asian macaques with varying severity. While SRV is an important pathogen in Asian macaque and causes a potential confounding variable in biomedical research, SRV also provides a valuable viral model to compare with other retrovirals for a better understanding of aspects of retroviral–host interactions, infection mechanism, retroviral structure, antiretroviral and vaccine development. As is characteristic of all retroviruses, SRV-2 can transcribe its own RNA genome into a double-stranded DNA by the action of reverse transcriptase enzyme. The presence of gene encoding RT enzyme in SRV-2 genome potentially be studied and utilized further as RT enzyme model for developing the anti RT drug of others retrovirus. On the other hands, the gene encoding SRV-2 RT can be isolated and cloned to produce RT recombinant enzyme and applied in molecular biology techniques.
In this study, we isolated the gene encoding RT enzyme of SRV-2 that infected Indonesian cynomolgus monkey and predicted the three dimensional (3D) structure model using I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) computational program and visualized with PyMol program. Gene expression was constructed in Escherichia coli expression system with Gateway technology methods using pENTR/SD/TOPO entry vector and pDEST17 destination vector. Purification was performed using Ni2+-NTA affinity chromatography. Expression was analyzed using SDS-PAGE and Western blot techniques; meanwhile enzyme activity was measured using RT colorimetric assay and RT-PCR technique.
The polymerase active site located in the finger/palm subdomain characterized by three conserved catalytic aspartates (Asp90, Asp165, Asp166), and has a highly
conserved YMDD motif as Tyr163, Met164, Asp165, and Asp166. This SRV-2
RT structure model has the highest homology to HIV-1 RT (2B6A.pdb). Meanwhile, the structure of SRV-2 RNase H closely related to its ortologs such as Escherichia coli RNase H (1GOA) and HIV-1 RNase H (3QIO, 3HYF). The catalytic active site of SRV-2 RNase H contains three amino acid carboxylate-residues as Asp436, Glu465 and Asp486.
Analysis of expression using SDS PAGE and Western blot techniques showed a specific band of 64.9 kDa, indicating SRV-2 RT recombinant enzyme. Purification of SRV-2 RT recombinant enzyme produced 312 µg mL-1 protein with 7.1 Unit (U) µL-1 enzyme activities. Application of this recombinant enzyme in reverse transcription-PCR (RT-PCR) of -globin and -actin genes produced DNA fragments of 206 base pairs (bp) and 350 bp, indicating amplification of -globin and -actin genes, respectively. Therefore, the expressed SRV-2 RT enzyme was proven to be functional, although the activity was low.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor
pada
Program Studi Primatologi
PENGEMBANGAN ENZIM REKOMBINAN
REVERSE
TRANSCRIPTASE
SIMIAN BETARETROVIRUS
SEROTIPE-2
ISOLAT INDONESIA ASAL MONYET EKOR PANJANG
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Penguji pada Ujian Tertutup: Prof Dr Ir Maggy Thenawidjaja Dr drh Joko Pamungkas, MSc
Judul Disertasi : Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 Isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang
Nama : Uus Saepuloh NIM : P063100011
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD Ketua
Dr drh Diah Iskandriati
Anggota Dr Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA Anggota
Diketahui oleh Ketua Program Studi
Primatologi
Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 26 Agustus 2013
PRAKATA
Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, karena atas berkah, rahmat, dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan disertasi dengan judul “Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 Isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang”. Disertasi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dari Program Studi Primatologi Sekolah Pascasarjana IPB.
Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terimakasih kepada Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD selaku ketua komisi pembimbing, Dr drh Diah Iskandriati dan Dr Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA selaku anggota komisi pembimbing atas bimbingan, arahan, dan waktu yang diluangkannya kepada penulis sehingga penelitian ini dapat terselesaikan. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada penguji luar komisi ujian tertutup yaitu Prof Dr Ir Maggy Thenawidjaja dan Dr drh Joko Pamungkas, MSc; serta penguji luar komisi ujian terbuka yaitu Prof Ir Antonius Suwanto, PhD dan Prof dr Mohamad Sadikin, DSc; atas berbagai masukan demi perbaikan disertasi ini.
Terimakasih kepada ketua Program Studi Primatologi Bapak Prof drh Dondin Sajuthi, MST, PhD beserta seluruh staf pengajar atas kesempatan studi di Sekolah Pascasarjana IPB. Penghargaan dan terimakasih penulis sampaikan kepada Dr drh Joko Pamungkas, MSc selaku Kepala Pusat Studi Satwa Primata Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat Institut Pertanian Bogor (PSSP LPPM IPB), Dr drh Diah Iskandriati selaku Kepala UPT Laboratorium PSSP LPPM IPB, atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk melanjutkan sekolah S3 di Sekolah Pascasarjana IPB dan penggunaan segala fasilitas yang diberikan untuk terlaksananya penelitian ini.
Kepada Direktorat Perguruan Tinggi Kementrian Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia, penulis mengucapkan terimakasih atas sebagian dana penelitian yang diberikan melalui Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Tahun 2012 dan kepada SEAMEO BIOTROP melalui program Thesis Research Grants for Indonesian PhD Students tahun 2012.
Penulis juga menyampaikan terimakasih dan penghargaan kepada teman-teman di Laboratorium Bioteknologi PSSP LPPM IPB yaitu: Sela Septima Mariya, SSi; Elis Dwi Ayuningsih, Amd; dan Mad Ramdan; kepada rekan-rekan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi PSSP LPPM IPB : Silmi Mariya, SSi, MSi; Maryati Surya, SSi, MS; Rachmitasari Noviana, SKH, MSi; Isti Kartikasari, SSi, MSi; Iin Indriawati, SSi dan Tri Faujiani, SSi serta semua staf dan karyawan PSSP LPPM IPB atas bantuannya selama penelitian.
Terimakasih yang tulus disampaikan kepada kedua Orang tua dan Mertua, Kakak-Kakak dan Adik-Adik atas segala doa untuk kesuksesannya. Kepada Isteri tercinta Dewi Ratnaningsih, SPdi; dan putera kami tercinta Azka Razaqy Saepuloh, atas segala doa, kasih sayang dan motivasi yang diberikan kepada penulis.
Semoga Allah SWT senantiasa memberikan jalan kemudahan dalam mengungkap dan mempelajari ayat-ayat-Nya. Amiin
Bogor, Agustus 2013
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL xii
DAFTAR GAMBAR xii
DAFTAR LAMPIRAN xiv
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 5
Manfaat Penelitian 5
Tempat dan Waktu Penelitian 5
Ruang Lingkup Penelitian 5
Kebaruan Penelitian 6
2 ISOLASI DAN MODEL STRUKTUR TIGA DIMENSI GEN PENYANDI ENZIM REVERSE TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS
SEROTIPE-2 (SRV-2) ASAL MONYET EKOR PANJANG INDONESIA 9
Pendahuluan 9
Bahan dan Metode 11
Hasil dan Pembahasan 13
Simpulan 20
3 ISOLASI DAN MODEL STRUKTUR TIGA DIMENSI ENZIM RNASE H ASAL SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 (SRV-2) YANG
DIISOLASI DARI MONYET EKOR PANJANG INDONESIA 21
Pendahuluan 21
Bahan dan Metode 23
Hasil dan Pembahasan 24
Simpulan 30
4 PENGKLONAAN DAN EKSPRESI GEN PENYANDI REVERSE TRANSCRIPTASE SIMIAN BETARETROVIRUS SEROTIPE-2 (SRV-2) ASAL MONYET EKOR PANJANG INDONESIA MENGGUNAKAN
SISTEM EKSPRESI ESCHERICHIA COLI 31
Pendahuluan 31
Bahan dan Metode 33
Hasil dan Pembahasan 35
Simpulan 43
5 PEMBAHASAN UMUM 43
6 SIMPULAN DAN SARAN 49
DAFTAR PUSTAKA 50
LAMPIRAN 56
DAFTAR TABEL
2.1Perbandingan asam amino yang berperan dalam pembentukan motif
dari RT SRV-2 Indo terhadap RT HIV-1 17
3.1Perbandingan asam amino yang berperan dalam situs aktif RNase H
SRV-2 dan HIV-1 30
4.1Pengukuran secara kuantitatif konsentrasi protein dan aktivitas enzim. Konsentrasi protein ditentukan dengan Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific) dan aktivitas enzim diukur dengan Reverse Transcriptase Assay colorimetric Kit (Roche) 41
DAFTAR GAMBAR
1.1Skema proses reverse transcriptase pada Retrovirus. Garis hitam (RNA), garis jingga muda (utas negatif DNA), garis jingga tua (utas
positif DNA) (Coffin et al. 1997) 2
1.2Peta organisasi genom lengkap virus SRV-2 yang disusun oleh gen gag, pol dan env berukuran sekitar 8,000 bp (Coffin et al. 1997) 4 1.3Kerangka pemikiran Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse
Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 (SRV-2) isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis) 7 1.4Bagan alir rencana penelitian pengembangan enzim rekombinan
reverse transcriptase simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) isolat Indonesia asal monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) 8 2.1Hasil amplifikasi PCR terhadap gen RT SRV-2 isolat indonesia, M)
1kb DNA ladder (Invitrogen), 1-2) produk PCR dari RT SRV-2
menghasilkan 1641 bp, 3) kontrol pereaksi 13
2.2Pohon filogenetik dari runutan asam amino RT SRV-2 terhadap retrovirus lainnya. RT SRV-2 isolat Indonesia ditandai dengan
warna merah 14
2.3Penyejajaran runutan asam amino dan prediksi motif struktur sekunder RT SRV-2 Indo dan RT HIV-1. Runutan asam amino RT SV-2 Indo pada posisi 1-547 dan RT HIV-1 pada posisi 18-553. Motif dicirikan oleh heliks- (H) lembaran- (S), dan coils (C). Asam amino yang berperan dalam situs aktif ditandai huruf merah dan bayangan merah, huruf hijau untuk runutan yang berikatan dengan DNA, huruf biru untuk berikatan dengan dNTPs, dan huruf ungu/bayangan ungu adalah hibrid RNA-DNA (RNase H) 16 2.4Model struktur tiga dimensi dari enzim RT SRV-2 Indo
pengikatan dNTPs, sedangkan motif YXDD digambarkan oleh
bulatan warna kuning 17
2.5Model superposisi antara RT SRV-2 Indo dengan RT HIV-1 (2B6A.pdb), nilai estimasi akurasinya yaitu 0.911 (TM-score), 1.85
Å (RMSD), dan 0.953 (coverage). 18
2.6Diagram pita dari dari RT SRV-2 Indo yang terikat pada model stick substrat dupleks oligonukleotida RNA/DNA 18-19-basa. Berbagai variasi domain enzim diwarnai seperti pada Gambar 2.4. Situs aktif asam amino dari DNA polimerase dan RNase H digambarkan dalam
bulatan warna kuning 19
2.7Interaksi antara asam amino yang berperan penting dalam situs aktif polimerase pada RT SRV-2 Indo dengan bagian terminal dari dupleks RNA/DNA. DNA diindikasikan dengan model stick berwarna merah dan biru, sedangkan RNA dicirikan dengan stick warna merah, putih dan biru dan ditandai dengan -1, -2, dan -3 sebagai dupleks, sedangkan RNA yang menggantung ditandai dengan +1. A) situs RT SRV-2 digambarkan dalam permukaan berwarna hijau dengan asam amino lestari berupa Asp165, Gln131, Gly132, dan Arg58 (ditunjukkan dalam stick warna hijau). (B) Interaksi situs aktif asam amino RT SRV-2 yang digambarkan dalam
model stick warna hijau 20
3.1Hasil amplifikasi PCR terhadap gen RNase H SRV-2, M) 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1) produk PCR RNase H SRV-2
menghasilkan 354 bp 2) Kontrol reagen 25
3.2Pohon filogenetik runutan asam amino RNase H dari berbagai
retrovirus 25
3.3Hasil penyejajaran majemuk (multiple alignment) domain RNase H berbagai retrovirus beserta keterangan prediksi struktur dua dimensi
dan daerah lestarinya 27
3.4Model struktur tiga dimensi RNase H SRV-2 (Panel A) dibandingkan dengan RNase H HIV-1 (Panel B) dan superposisi diantara keduanya (Panel C). Model bola menggambarkan residu motif DED dari sisi aktif RNase H. Struktur heliks digambarkan dengan huruf kapital (A- E) dan lembaran dengan nomor (1-5) 28 3.5Sisi aktif katalitik residu asam amino yang berinteraksi dengan
kation Mg2+ (ditunjukkan dengan bulat kuning) pada RNase H
SRV-2 (A) dan RNase H HIV-1 (B) 29
3.6Interaksi sisi aktif RNase H SRV-2 (A) dan HIV-1 (B) dengan substrat nukleotida RNA. Residu asam amino yang berinteraksi dengan nukleotida digambarkan dengan model bola dan nukleotida
RNA digambarkan dengan model tongkat 29
4.1Amplifikasi gen RT 2 menggunakan primer spesifik RT SRV-2 RT 3SRV-284F dan 49SRV-25R. M) 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1-2)
Produk PCR RT SRV-2 berukuran 1641bp 35
2. B) Ilustrai peta genetik vektor pENTR/SD/TOPO- RT
SRV-2 36
4.3Runutan nukleotida RT SRV-2 isolat Indonesia pada posisi nukleotida 3284-4925 yang disisipkan ke dalam vektor pENTR/SD/TOPO. Situs-situs spesifik dari vektor ditandai dengan huruf tebal dan posisi primer dicirikan dengan huruf warna merah 37 4.4A) Amplifikasi PCR terhadap plasmid pDEST17 RT SRV-2
menggunakan primer T7 forward dan SRV-2 RT4925R, M) 1 kb DNA ladder (Invitrogen), 1-2) Produk PCR berukuran 1829 bp. B) ilustrasi peta genetik vektor pDEST17- RT SRV-2 38 4.5Runutan nukleotida RT SRV-2 isolat Indonesia pada posisi
nukleotida 3284-4925 yang disisipkan ke dalam vektor pDEST17. Situs-situs spesifik dari vektor ditandai dengan huruf tebal dan posisi
primer dicirikan dengan huruf warna merah 39
4.6Panel A: Hasil elektroforesis SDS PAGE terhadap sampel protein rekombinan RT SRV-2. M) Broad low prestained marker (BioRad) 1) pra-purifikasi, 2) bufer pengikat, 3) bufer pencuci, 4) bufer elusi. Panel B: Analisis hasil ekspresi RT SRV-2 dengan teknik Western blot terhadap antibodi spesifik anti-6xHis. M) Kaleidoskop prestained marker (BioRad), 1) pra-pemurnian, 2) bufer elusi, 3)
bufer pencuci, 4) bufer pengikat 40
4.7Hasil uji two step RT PCR menggunakan enzim RT SRV-2 dibandingkan dengan enzim RT komersial Superscript III RT (SSTIII, Invitrogen®). M) 100 bp DNA ladder (Invitrogen), 1-4)
ulangan sampel, 5) kontrol reagensia 42
5.1A). Skema kloning gen dan transfer melalui kloning rekombinasi. Segitiga menunjukkan sisi rekombinasi. Gene yang berupa produk PCR diklonkan ke dalam vektor entry yang mengandung situs attL, KmR dan disubklonakan dengan reaksi LR clonase ke dalam vektor destinasi yang mengandung situs attR, ApR dan ccdB. B). Sekuens dari sisi attB1 dan attB2 yang menempel pada gene dalam klona
ekspresi (Hartley et al. 2000) 48
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil pengukuran konsentrasi protein enzim rekombinan RT SRV-2
dengan teknik BCA Assay 57
2 Hasil pengukuran konsentrasi enzim rekombinan RT SRV-2 dengan
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Selama beberapa dekade terakhir, enzim reverse transcriptase (RT) menjadi salah satu perangkat yang sangat penting dalam bidang biologi molekuler yaitu untuk menyintesis DNA komplementer (cDNA) dari mRNA. Aplikasi dari enzim RT ini telah memberikan pemahaman yang luas mengenai sejumlah mekanisme regulator seluler. Selain itu, kombinasi antara aktivitas enzim RT dengan amplifikasi PCR telah menjadi suatu gold standard dalam proses pengklonaan daerah penyandi gen (coding region) dari berbagai sasaran gen yan diinginkan. Enzim RT telah menjadi bagian penting dalam perkembangan biologi molekuler, genetik, dan biomedis. Sampai saat ini, kemajuan bioteknologi sangat tergantung salah satunya terhadap keberadaan enzim RT yang efisien misalnya diaplikasikan dalam teknik microarray untuk mentranskripsi balik mRNA menjadi cDNA dalam menganalisis berbagai ekspresi gen (Hizi dan Herschhorn 2008).
Penemuan enzim RT oleh Temin dan Baltimore pada tahun 1970 telah memberikan pengaruh yang besar dalam kemajuan penelitian bidang biologi molekuler. Identifikasi terhadap enzim ini yang pertama kali ditemukan pada virus RNA penyebab tumor merupakan enzim yang bersifat RNA-dependent DNA polymerase. Identifikasi ini telah memberikan tambahan dalam dogma pusat aliran informasi genetik, yaitu dari RNA ke DNA melalui proses transkripsi balik (reverse transcription). Enzim RT memiliki aktivitas antara lain yaitu sebagai RNA-dependent DNA polymerase (RDDP), DNA-dependent DNA polymerase (DDDP), dan ribonuklease H (RNase H) yang akan memecah utas RNA dari heterodupleks RNA-DNA (Herschhorn dan Hizi 2010; Goff 2001; Coffin et al. 1997).
Proses reverse transkripsi diinisiasi setelah terjadinya penggabungan antara enzim RT dengan RNA genomik virus dan primer. Primer diperlukan oleh semua RT untuk inisiasi proses sintesis DNA. Transfer RNA (tRNA) asal sel inang bertindak sebagai primer tersebut yang berbeda-beda tergantung virusnya. tRNAlys3 digunakan oleh lentivirus dan betaretrovirus, tRNApro digunakan gamaretrovirus, dan tRNAtrp oleh alfaretrovirus. tRNA mengandung 18 nukleotida pada ujung 3’ yang bersifat komplementer terhadap primer binding site (PBS) yang berlokasi dekat dengan ujung 5’ dari genom RNA virus (pada HIV-1, PBS berlokasi di 180 nukleotida dari ujung) sehingga memungkinkan terjadinya hibridisasi diantara keduanya (Flint et al. 2009; Coffin et al. 1997; Herschhorn dan Hizi 2010).
daerah R bervariasi pada berb (mouse mammary tumor viru virus). Akibat dari dulpikasi (strand transfer(-)) dan berhib molekul virus. Setelah utas D sintesis DNA berlanjut sep mendegradasi RNA yang tela Coffin et al.1997).
Gambar 1.1 Skema pros (RNA), garis positif DNA Pemotongan dengan RN kaya akan purin (polypurine RNase H (Coffin et al. 1997 RNA virus (3’-PPT) yang sed sebagai primer utama untuk s lainnya. Segmen RNA lainn dapat bertindak sebagai prime walaupun semua retrovirus m
erbagai retrovirus pada kisaran 12 nukleotida pad irus) sampai 235 nukleotida pada BLV (bovine
si daerah R, (-) sssDNA dapat mengalami transf ibridisasi terhadap sekuens R yang berlokasi pad DNA asal berhibridisasi dengan utas (-) daerah R sepanjang RNA virus, sedangkan RNase H elah dikopi (Herschhorn dan Hizi 2010; Flint et
oses reverse transcriptase pada Retrovirus. G ris jingga muda (utas negatif DNA), garis jingga A) (Coffin et al. 1997).
Nase H tidak bersifat sekuens spesifik, tetapi sek ne tracks, PPTs) mempunyai ketahanan terhadap 97; Goff 2001). PPT berlokasi dekat dengan uju edikit berbeda pada retrovirus yang berbeda. PPT sintesis DNA utas (+) setelah penghilangan sek innya yang tertinggal setelah degradasi RNA pa
er minor untuk sintesis DNA utas (+). Dengan menginisiasi sintesis utas (+) menggunakan PPT
ada MMTV ne leukemia nsfer utas (-) ada ujung 3’ R ujung 3’, H langsung et al. 2009;
Garis hitam gga tua (utas
sebagai primer, namun beberapa retrovirus seperti HIV-1, equine infectious anemia virus (EIAV), feline immunodeficiency virus (FIV) dan avian sarcoma and leukosis virus (ASLV), memulai sintesis DNA utas (+) dari sisi dimulainya penambahan RNA (Herschhorn dan Hizi 2010). Proses sintesis DNA utas (+) ini akan terhenti pada ujung primer tRNA yang sudah mengalami transkripsi balik menghasilkan utas DNA yang disebut plus-strand strong-stop DNA (+sssDNA). RNase H akan mendegradasi primer tRNA menghasilkan sekuens (+)sssDNA yang berkomplemen dengan sekuens pada ujung 3’ dari DNA utas (-). Adanya komplemen segmen PBS pada (+)sssDNA dengan pada DNA utas (-) memungkinkan terjadinya transfer utas kedua (second strands transfer). Terjadinya sintesis DNA utas (+) dan (-) secara komplit menghasilkan utas ganda DNA yang akan dijadikan cetakan untuk utas berikutnya (Herschhorn dan Hizi 2010; Flint et al. 2009; Coffin et al. 1997 ). Tahapan proses RT retrovirus terdapat pada Gambar 1.1.
Gencarnya penelitian mengenai enzim RT dipicu oleh penemuan retrovirus manusia yaitu human immunodeficiency virus (HIV) pada dekade 1980-an yang merupakan agen patogen penyebab terjadinya acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) pada manusia. Telah tersedianya informasi mengenai retrovirus dan enzim RT sangat membantu dalam identifikasi dan penelitian mengenai agen patogen ini. Tingginya morbiditas dan mortalitas pada penderita HIV/AIDS mengharuskan ditemukannya agen antiretrovirus untuk tujuan terapi (Hizi dan Herschhorn 2007). Sehubungan dengan peran sentral enzim RT dalam replikasi virus HIV, maka enzim ini menjadi target utama untuk pengembangan senyawa antivirusnya. Hampir setengah dari obat anti HIV/AIDS yang tersedia saat ini mempunyai target penghambatan pada aktivitas polimerase enzim RT (Sarafianos et al. 2009; Ilina et al. 2012).
Obat anti-RT HIV yang direkomendasikan saat ini dibagi ke dalam dua kategori yaitu sebagai nucleoside RT inhibitors (NRTIs) dan non-nucleoside RT inhibitors (NNRTIs). Mekanisme kerja senyawa NRTIs adalah sebagai substrat analog nukleosida alami yang tidak memiliki gugus 3’-OH yang akan berikatan dengan situs aktif DNA polimerase sewaktu proses polimerisasi DNA. Masuknya senyawa NRTIs ke dalam rantai perpanjangan DNA yang berkompetisi dengan nukleosida alami akan menghentikan proses polimerisasi tersebut sehingga proses replikasi virus juga terhenti (Huang et al. 1998; Kohlstaedt et al. 1992). Senyawa NNRTIs akan berikatan dengan NNRTI-binding pocket merupakan daerah hidrofobik yang berbatasan dengan situs aktif polimerase RT (∼10 Å). Senyawa NNRTI merupakan senyawa anti-RT HIV yang bersifat non kompetitif dan tidak berinterferensi dengan pengikatan dNTP atau substrat nukleotida RT (Sarafianos et al. 2009; Roth et al. 1997). Data struktural menunjukkan bahwa pengikatan senyawa NNRTI akan mendistorsi posisi primer grip sehingga mempengaruhi keselarasan dari terminal primer dengan situs aktif polimerase yang dapat mempengaruhi tahapan sintesis DNA virus (Sarafianos et al. 2009; Herschhorn dan Hizi 2010). Kebanyakan regimen tiga jenis obat anti-HIV standar yang biasa diberikan untuk tujuan terapi mengandung kombinasi dua senyawa NRTIs dan satu senyawa NNRTI atau inhibitor protease HIV. Senyawa NRTIs HIV yang telah mendapat ijin dari Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat adalah: AZT (azidovudine), 3TC-(lamivudine), FTC (emtricitabine), ddI (didanosine), dan ABC (abacavir); sedangkan senyawa NNRTIs adalah nevirapine, delavirdine, efavirenz, dan etravirine (Sarafianos et al. 2009; Ilina et al. 2012)
HIV sehingga dilakukan penca berasosiasi dengan enzim RT target pengembangan senyawa al. 2012). Beberapa senyawa a uji pra-klinis. Hal ini membuk enzim yang paling banyak d 2010).
Penelitian enzim RT te juga dari berbagai jenis virus tersebut selain untuk pencaria untuk pemenuhan enzim rek Berbagai jenis enzim RT y pengembangan enzim rekomb virus (MMLV) (Chen et al. 2 lymphotropic virus (HTLV), 2009; Coffin et al. 1997; Hers ditentukan struktur tiga dimen pada RT HIV (Cote et al. 2008
Gambar 1.2 Peta organisasi pol dan env ber
Simian betaretrovirus s dan genus betaretrovirus. Viru Asia genus Macaca khususny 1998; Pamungkas et al. 1991 berbahaya yang dapat meny (Philipp-Staheli et al. 2006; Simian acquired immunodefic manusia (Fujimoto et al. 201 terdahulu tentang SRV-2 tela memiliki empat gen utama y (protease), dan pol (polymera 1999; Thayer et al. 1987 ).
Gen pol pada SRV-2 me pol polyprotein, yang terbag Enzim RT berperan untuk me berperan untuk menggabungka Hingga kini belum ada pene Indonesia. Adanya gen RT menjadi enzim rekombinan R
carian target senyawa obat lainnya. Domain RNa T yang penting dalam proses replikasi virus jug wa anti-HIV baru (Su et al. 2010; Kirby et al. 201 a anti-RNase H HIV telah dikembangkan dan sud uktikan bahwa sampai saat ini enzim RT menjadi dipelajari dalam bidang biomedis (Herschhorn
terus berkembang tidak hanya terhadap virus H us lainnya dari famili Retroviridae. Tujuan dari rian model virus dalam pengembangan anti RT ekombinan RT yang mempunyai aktivitas enz yang telah dipelajari karakteristik biokimiany mbinannya antara lain berasal dari Molony murine 2009), MMTV (Taube et al. 1998), ASLV, FIV,
), dan Simian immunodefieciency virus (SIV) ( rschhorn dan Hizi 2010). Enzim RT MMLV bah ensinya melalui teknik kristalografi sinar-X sepe 08).
si genom lengkap virus SRV-2 yang disusun ole erukuran sekitar 8,000 bp (Coffin et al. 1997).
serotipe-2 (SRV-2) tergolong dalam famili Re irus ini umumnya secara alami menyerang popula nya asal Indonesia (Iskandriati et al. 2010; Iskand 91; Marx et al. 1985). SRV-2 merupakan pat nyebabkan infeksi endemik bagi populasi satw
; Lerche 2010). Virus ini dapat menyebabkan ficiency syndrome (SAIDS) yang menyerupai A 010; Gardner et al. 1998; Marx et al. 1984). lah berhasil mengidentifikasi genom SRV-2 dan yaitu gag (group specific antigen), env (enve erase) (Gambar 1.2) (Marraci et al. 1995; Mar
memiliki panjang sekitar 867 asam amino dan me agi menjadi dua enzim yaitu RT/RNase-H dan menyintesis utas DNA dari RNA virus, sedangkan
kan DNA yang baru terbentuk dengan kromosom nelitian mengenai RT asal SRV-2 khususnya un
T pada SRV-2 memungkinkan untuk dikemb RT asal SRV-2 isolat Indonesia yang dapat dia
Nase H yang juga menjadi 012; Ilina et udah melalui di salah satu rn dan Hizi HIV namun ri penelitian T HIV, juga nzim tinggi.
nya melalui ine leukemia V, Human T (Flint et al. ahkan sudah eperti halnya
leh gen gag,
baik dalam bidang biologi molekuler misalnya pada teknik RT-PCR maupun sebagai model enzim RT untuk pencarian senyawa anti RT retrovirus.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk menghasilkan enzim rekombinan RT SRV-2 isolat Indonesia asal monyet ekor panjang (Macaca fascicularis), melalui tahapan penelitian sebagai berikut:
Isolasi, pemodelan struktur tiga dimensi, dan karakterisasi molekuler secara in silico enzim RT dan RNase H SRV-2 isolat Indonesia
Ekspresi gen penyandi RT SRV-2 isolat Indonesia menggunakan sistem ekspresi Escherichia coli
Pemurnian, analisis hasil ekspresi dan uji aktivitas enzim rekombinan RT SRV-2 isolat Indonesia
Manfaat Penelitian
Tersedianya enzim rekombinan reverse transcriptase produk lokal asal SRV-2 isolat Indonesia yang mempunyai aktivitas enzim optimal diharapkan akan dapat diaplikasikan dalam bidang biologi molekuler khususnya dalam teknik RT-PCR dan dapat dijadikan model enzim dalam pengembangan senyawa antiretrovirus. Diharapkan, hal ini akan memberikan kontribusi dalam mendukung kemajuan bidang biologi molekuler di Indonesia dan mengurangi ketergantungan terhadap enzim sejenis yang masih didatangkan dari produsen di luar negeri. Teknologi untuk menghasilkan produk enzim reverse transcriptase SRV-2 isolat Indonesia ini merupakan salah satu contoh potensi yang dapat dikembangkan dalam memanfaatkan keanekaragaman biodiversitas Indonesia.
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi dan Laboratorium Bioteknologi Pusat Studi Satwa Primata, Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat, Institut Pertanian Bogor (PSSP LPPM IPB), jalan Lodaya II/5 Bogor 16151. Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari 2012 sampai dengan bulan Desember 2012.
Ruang Lingkup Penelitian
menggunakan program komputasi on line EMBOSS Transeq dan ORF finder dan selanjutnya asam amino yang diperoleh dikonstruksi struktur molekulnya dengan program I-TASSER yang divisualisasi dengan program PyMol. Informasi yang diperoleh yaitu model struktur sekunder, struktur tersier (3D), asam amino yang berperan dalam situs aktif, dan situs katalitik enzim. Tahap pertama ini dilakukan karena belum adanya informasi-informasi terkait yang diperoleh dari penelitian sebelumnya terutama penelitian tentang struktur molekul RT SRV-2.
Berbekal informasi dari Bab 2 dan Bab 3 tersebut, selanjutnya dilakukan tahap kedua yaitu konstruksi gen untuk proses pengklonaan dalam sistem ekspresi Escherichia coli dalam upaya menghasilkan enzim rekombinan RT SRV-2 yang dijelaskan dalam Bab 4. Digunakan metode Gateway technology (Invitrogen, USA) dalam mengekspresikan gen target RT SRV-2 menggunakan vektor entry pENTR/SD/TOPO yang disubklonakan pada vektor destinasi pDEST17 untuk diekspresikan dalam E. coli BL21AI. Pemurnian protein rekombinan dilakukan menggunakan kromatografi afinitas Ni2+-NTA. Hasil ekspresi dianalisis dengan teknik SDS-PAGE dan Western blot yang menghasilkan protein berukuran sekitar 64.9 kDa dan diuji aktivitasnya dengan RT colorimetric assay serta RT-PCR. Dihasilkannya enzim rekombinan RT SRV-2 isolat Indonesia yang mempunyai aktivitas enzim optimal diharapkan akan dapat diaplikasikan di bidang biologi molekuler khususnya dalam teknik RT-PCR dan dapat dijadikan model enzim dalam pengembangan senyawa antiretrovirus.
Kebaruan Penelitian (Novelty)
Selama ini, SRV-2 dianggap sebagai agen patogen penyebab terjadinya SAIDS pada monyet Asia genus Macaca. Infeksi SRV-2 dapat menyebabkan morbiditas dan mortalitas yang menjadi masalah dalam penangkaran satwa primata. Infeksi SRV-2 juga menjadi faktor pengganggu (confounding variable) pada penelitian yang menggunakan satwa primata sebagai hewan model penelitiannya. Penelitian ini mencoba untuk mengeksplorasi virus SRV-2 dengan harapan dapat diperoleh nilai positif yang bermanfaat. Adanya gen penyandi enzim RT pada SRV-2 berpotensi untuk dipelajari dalam upaya pengembangan enzim rekombinan RT mengingat enzim ini sangat potensial dalam bidang biomedis. Sampai saat ini, enzim RT SRV-2 belum banyak diteliti sehingga informasi terkait struktur molekul, sifat-sifat biokimia dan pengembangan enzim rekombinannya belum ada terutama asal isolat Indonesia. Kebaruan dari penelitian ini adalah:
Gen penyandi enzim RT asal SRV-2 isolat Indonesia berhasil diisolasi dan dikarakterisasi.
Pemodelan struktur tiga dimensi menggunakan program komputasi I-TASSER berhasil memprediksi gambaran tiga dimensi enzim RT SRV-2 baik domain-domainnya, interaksi dengan substratnya maupun situs-situs aktifnya pada domain polimerase dan RNase H.
Kerangka Pemikiran
Gambar 1.3 Kerangka pemikiran Pengembangan Enzim Rekombinan Reverse Transcriptase Simian Betaretrovirus Serotipe-2 (SRV-2) isolat Indonesia Asal Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis)
Simian betaretrovirus Serotipe-2 (SRV-2)
Secara alami menyerang populasi monyet Asia genus Macaca
khususnya di Indonesia
Merupakan patogen yang berbahaya yang dapat menyebabkan infeksi endemik
bagi populasi primata
Dapat menyebabkan penyakit Simian acquired immunodeficiency syndrome (SAIDS) pada beberapa satwa
primata genus Macaca
Agen patogen utama yang harus dieliminasi dalam penangkaran
satwa primata program SPF (Specific Pathogen Free)
SRV isolat Indonesia asal Macaca fascicularis telah berhasil diisolasi
dan diidentifikasi
Memiliki empat gen utama yaitu gag (group specific antigen), env (envelope), prt (protease), dan pol
(polymerase)
Gen pol merupakan gen penyandi enzim reverse transcriptase
Memungkinkan untuk dikembangkannya menjadi enzim rekombinan reverse transcriptase
asal SRV-2 isolat Indonesia
Potensi yang merugikan Potensi yang menguntungkan
Isolasi dan karakterisasi model
struktur 3D enzim RT dan RNaseH
SRV-2
Ekspresi pada sistem ekspresi Eschericia coli dengan Gateway
technology
Enzim rekombinan reverse transcriptase SRV-2
Model enzim untuk pengembangan
senyawa antiretrovirus Dapat
diaplikasikan dalam teknik
Gambar 1.4 Bagan alir rencana penelitian pengembangan enzim rekombinan reverse transcriptase simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) isolat Indonesia asal monyet ekor panjang (Macaca fascicularis).
Penentuan gen target RT/RNaseHSRV-2 dengan
teknik PCR
Pengklonaan terhadap pENTR/SD/TOPO
Ekspresi di dalam Escherichia coli BL21AI
Perbanyakan dan Pemurnian isolat protein rekombinan RT
SRV-2
•Analisis ekspresi protein:
SDS PAGE/Western blot
•Uji aktivitas enzim RT:
RT colorimetric Assay
•Aplikasi pada teknik RT PCR
SRV-2 Isolat Indonesia
Amplifikasi PCR gen pol SRV-2
Sekuensing
Analisis Bioinformatika Bioedit
ClustalW
Emboss Transeq/ ORF Finder
Konstruksi Pohon Filogenetik dengan MEGA5
Prediksi Struktur Tiga Dimensi
• I-TASSER • PyMol
Sub klonaan terhadap pDEST17
2 ISOLASI DAN MODEL STRUKTUR TIGA DIMENSI GEN
PENYANDI ENZIM
REVERSE TRANSCRIPTASE
SIMIAN
BETARETROVIRUS
SEROTIPE-2 (SRV-2) ASAL MONYET EKOR
PANJANG INDONESIA
Isolation and Three-Dimensional Structure Model of Gene Encoding Reverse Transcriptase of Simian Betaretrovirus Serotype-2 (SRV-2) Isolated from Indonesia
Cynomolgus Monkey
Abstract
In this study, we isolated the gene encoding reverse transcriptase enzyme of SRV-2 that infected Indonesian Cynomolgus monkey (SRV-2 RT Indo) and predicted the three dimensional structure model using I-TASSER computational program. The SRV-2 RT Indo consisted of 547 amino acids at nucleotide position 3284-4925 that has 25.5% similarity compared to HIV-1 RT. The polymerase active site located in the finger/palm subdomain characterized by three conserved catalytic aspartates (Asp90, Asp165, Asp166), and has a highly conserved YMDD motif as Tyr163, Met164, Asp165, and
Asp166. We estimated the SRV-2 RT Indo structure that has the accuracy of TM-score
0.90±0.06 and RMSD 4.7±3.1Å, indicating this model can be trusted and the accuracy can be seen from the appearance of protein folding in tertiary structure. The superpositionings between SRV-2 RT Indo and HIV-1 RT were performed to predict the structural in details and to optimize the best fits for illustrations. This SRV-2 RT Indo structure model has the highest homology to HIV-1 RT (2B6A.pdb) with estimated accuracy at TM-score 0.911, RMSD 1.85 Å, and coverage of 0.953. This preliminary study of SRV-2 RT Indo structure modeling is intriguing, given some information to explore the molecular characteristic and biochemical mechanism of this enzyme.
Keywords: reverse transcriptase, SRV-2 Indo, I-TASSER, 3D structure model
Pendahuluan
RNA-DNA. Aktivitas polimerase dan RNase H keduanya berperan sangat penting dalam proses replikasi virus (Coté dan Roth 2008; Telesnitsky dan Goff 1997). Genom retrovirus mengandung gen penyandi domain gag, pol dan env, dimana gen pol mengkodekan prekursor protein Pol yang mengandung enzim RT/RNase H dan integrase (Telesnitsky dan Goff 1997; Goff 2001; Coffin et al. 1997). Enzim RT dari berbagai kelompok retrovirus yang berbeda memiliki kesamaan aktivitas fungsi katalitik. Namun demikian, terdapat beberapa perbedaan dalam hal struktur dan komposisi subunit, berat molekul, sifat-sifat katalitik, karakteristik biofisika dan biokimia serta sensitivitas terhadap inhibitor (Herschhorn dan Hizi 2010).
Enzim RT asal virus HIV-1 (human immunodeficiency virus) merupakan enzim yang paling banyak dipelajari dalam bidang biomedis pada beberapa dekade ini (Herschhorn dan Hizi 2010). Enzim RT HIV-1 menjadi sasaran utama dalam pengembangan senyawa obat antiretrovirus untuk terapi akibat infeksi HIV-1 yang dapat menyebabkan terjadinya sindroma penurunan kekebalan tubuh (acquired immunodeficiency syndrome, AIDS). Lebih dari setengah obat anti HIV-1 yang disetujui FDA (food and drug administration) mempunyai target kerja untuk menghambat aktivitas enzim RT virus HIV tersebut (Ilina et al. 2012; Sarafianos et al. 2009). Enzim RT HIV-1 menjadi obyek penelitian yang dilakukan secara intensif melalui penentuan struktur kristal tiga dimensi dan uji-uji biokimia (Sarafianos et al. 2009). Penelitian yang telah dilakukan terkait karakteristik struktur enzim RT HIV-1 adalah antara lain penentuan kompleks struktur enzim RT dengan DNA utas ganda (Ding et al. 1998); interaksi dengan nukleotida (Huang et al. 1998) dan interaksi dengan hibrid RNA-DNA (Sarafianos et al. 2001).
Simian betaretrovirus serotipe-2 (SRV-2) merupakan agen penyebab terjadinya sindroma penurunan kekebalan tubuh dan bertanggung jawab terhadap terjadinya morbiditas dan mortalitas pada satwa primata monyet Asia genus Macaca baik di fasilitas penelitian maupun di penangkaran (Marx et al. 1984; Gardner et al. 1988; Lerche 2010). Infeksi SRV-2 pada Macaca dapat menjadi faktor pengganggu (confounding) dalam penelitian biomedis yang menggunakan satwa-satwa ini sebagai subyek penelitian (Lerche dan Osborn 2003). Mengingat potensi infeksi aktif atau laten dan abnormalitas kekebalan yang terkait pada infeksi ini, maka SRV-2 merupakan salah satu target agen patogen yang harus dieliminasi dalam program penangkaran satwa primata genus Macaca bebas patogen tertentu (specific pathogen free, SPF) (Morton et al. 2008). Namun demikian, terdapat potensi menguntungkan yang dapat dieksplorasi dengan mempelajari retrovirus lainnya terutama terhadap HIV/AIDS melalui pemahaman mekanisme interaksi dengan inangnya dan efek imunosupresi, mekanisme infeksi, struktur virus, serta pengembangan antiretrovirus dan vaksinnya (Montiel et al. 2010; Lerche dan Osborn 2003).
Pada penelitian ini, dilakukan isolasi gen penyandi enzim RT asal SRV-2 yang menginfeksi monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) Indonesia dan dilakukan prediksi model struktur tiga dimensinya (3D) menggunakan program komputer I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement). I-TASSER merupakan metode komputasi yang telah berhasil secara akurat dalam melakukan pemodelan struktur protein (Zhang 2008; Roy et al. 2010). I-TASSER menggunakan pendekatan kombinasi dalam melakukan pemodelan struktur melalui tiga metode konvensional yaitu: comparative modeling, threading, dan ab initio modeling (Roy et al. 2010). Sampai saat ini belum tersedia informasi mengenai struktur 3D enzim RT SRV-2, sehingga prediksi model struktur ini akan memberikan informasi awal yang berguna untuk memahami struktur dan karakteristik fungsional dari enzim ini. Tersedianya struktur protein akan memberikan informasi molekuler secara detail yang akan memudahkan penelitian mengenai karakteristk dan fungsi suatu protein atau enzim. Perkembangan dan validasi metode komputasi dapat memprediksi struktur protein dengan tingkat akurasi yang relatif tinggi sehingga memungkinkan untuk mempelajari fungsi anotasi, analisis biokimia, dan karakteristik biologis. Dalam penelitian ini, model yang kami kembangkan menjadi suatu inisiator untuk memahami struktur enzim RT SRV-2 baik dari segi fungsi domain, situs aktif, maupun interaksi hibrid RNA-DNA dengan enzim.
Bahan dan Metode
Amplifikasi PCR Gen RT SRV-2 dan Perunutan Nukleotida
Sel darah tepi berinti tinggal (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) yang diisolasi dari monyet ekor panjang yang positif terinfeksi SRV-2 diekstraksi menggunakan QiaAmp DNA blood minikit (Qiagen, Hilden, Jerman). Amplifikasi PCR terhadap 5 µl DNA dilakukan menggunakan enzim DNA polimerase Pfx 2U
(Invitrogen, CA, USA) di dalam total reaksi 25 µl yang mengandung 2 mM MgCl2 (Applied Biosystems, CA, USA), 1x PCR buffer (Applied Biosystems), dan 1 mM dNTPs (Applied Biosystems). Primer yang digunakan didesain menggunakan program Primer3 (http://primer3.wi.mit.edu/) yaitu SRV-2 RT 3284F (5’-CCTGTTTGGGTTGA TC-3’) dan SRV-2 RT 4925R (5’-GTGATTACCTTGAGATAAAGGTCC-3’). Amplifikasi PCR dijalankan selama 35 siklus melalui tahapan: denaturasi suhu 94oC selama 30 detik, annealing pada suhu 55oC selama 30 detik, dan ekstensi pada suhu 68oC selama 2 menit. Sebanyak 12.5 µl amplikon dijalankan dalam elektroforesis
Analisis Pohon Filogenetik
Sekuen nukleotida yang diperoleh selanjutnya dianalisis dengan program Bioedit (Ibis Biosciences) dan disejajarkan dengan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) dari NCBI (National Center for Biotechnology Information). Translasi nukleotida penyandi asam amino dilakukan menggunakan program EMBOSS Transeq (http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/ transeq/index. html). Sekuens asam amino disejajarkan menggunakan programa ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/clustalW) yang selanjutnya dikonstruksi pohon filogenetiknya menggunakan program MEGA 5 dengan metode Neighbor-Joining. Jarak genetik diestimasi menggunakan metode Kimura’s two parameter dan análisis bootstrap dilakukan 1000 kali ulangan (Tamura et al. 2011). Sekuen asam amino RT dari retrovirus lainnya digunakan sebagai referensi yaitu sebagai berikut: Avian myeloblastosis virus (AMV, AAB31929.1), Baboon endogenous virus (BaEV, BAA89659.1), Feline leukemia virus (FeLV, BAL04139.1), Feline immunodeficiency virus (FIV, ABO69501.1), Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1, ADN28092.1), Human immunodeficiency virus-2 (HIV-2, AAB01352.1), Moloney murine leukemia virus (MoMLV, NP_955591.1), Mason-Pfizer monkey virus (MPMV, AAA47711.1), Simian foamy virus (SPF, YP_001961122.1), Simian endogenous retrovirus (SERV, AAC97565.1), Simian immunodeficiency virus (SIV, AAA74707.1), Simian retrovirus-1 1, AAA47732.1), Simian retrovirus-2 (SRV-2, AAD43256.1), Simian retrovirus-2 (SRV-2, AAA47562.1), Simian retrovirus-4 (SRV-4, YP_003864102.1), Human T-lymphotropic virus-2 (HTLV-2, AAB59885.1), Simian T-lymphotropic virus-1 (STLV-1NP_049560.1) and Mouse mammary tumor virus (MMTV, BAA03767).
Model Struktur Tiga Dimensi RT SRV-2
Prediksi struktur dua dimensi berdasarkan sekuens asam amino dan motif struktur dibuat menggunakan program I-TASSER (http://zhang. bioinformatics.ku.edu/ I-TASSER). Sekuen lestari (conserve sequences) dan posisi situs aktif asam amino ditentukan secara manual berdasarkan pada hasil prediksi struktur dua dimensi dan pensejajaran sekuen ganda dengan mengacu pada sekuens HIV-1 1HYS (Sarafianos et al. 2001) dan SRV-2 pol AAD43256 (Marracci et al. 1999). Program I-TASSER digunakan untuk menentukan struktur 3D dan fungsi suatu protein query yang diperoleh dengan mencocokkannya terhadap struktur dan fungsi dari protein-protein yang ada di Protein Data Bank (PDB). Fungsi analog dari hasil pencarian global diurutkan berdasarkan pola struktur yang lestari (conserved structure patern) yang ada dalam model dan diukur menggunakan skema skor dengan mengkombinasikan template modeling (TM-score), root-mean-squared deviation (RMSD), sequence identity, dan coverage of the structure alignment. TM-skor didefinisikan untuk menilai kesamaan topologi dari pasangan struktur protein dengan nilai dalam kisaran (0,1), dimana skor yang lebih tinggi menunjukkan kecocokkan struktural yang lebih baik. Hasil dari pencarian global dan lokal digabungkan untuk menyajikan daftar lengkap analog fungsional (Zhang 2008; Roy et al. 2010). Struktur yang cocok dianalisis menggunakan program PyMOL (http://www. pymol.org) yang memungkinkan kita untuk mengevaluasi lebih lanjut mengenai struktural dan fungsi domain dari protein RT SRV-2.
1650 bp
Hasil dan Pembahasan
Isolasi Karakterisasi Gen RT SRV-2 Asal Isolat Indonesia
Baru-baru ini telah berhasil diisolasi dan dikarakterisasi virus SRV-2 asal monyet ekor panjang Indonesia. Hasil analisis urutan nukleotida daerah gen envelope menunjukan 96% kesamaan dengan SRV-2 (Iskandriati et al. 2010). Dalam penelitian ini, dilakukan isolasi dan analisis gen penyandi RT SRV-2 isolat Indonesia (RT SRV-2 Indo), karena sampai saat ini belum ada penelitian yang mengeksplorasi RT SRV-2. Oleh karena itu, sebagai langkah awal, penelitian ini diharapkan akan membantu dalam mendukung pemahaman yang lebih baik mengenai struktur dan mekanisme retrovirus RT SRV-2. Hasil amplifikasi DNA terhadap RT SRV-2 Indo ini menghasilkan 1641 bp amplikon (Gambar 2.1) yang menyandikan 547 asam amino sebagai enzimatik RT. Berdasarkan kesamaan runutan asam aminonya, isolat ini memiliki kesamaan identitas 99% terhadap RT SRV-2 isolat D2/RHE/OR dengan kode akses di Genbank yaitu AAD43256.1. Terdapat enam perbedaan asam amino yaitu pada posisi 307 (Leu terhadap Phe), 329 (Ile terhadap Val), 478 (Gln terhadap His), 521 (Tyr terhadap Cys), 540, 541 (Gly, Pro terhadap Arg, Thr).
Gambar 2.1 Hasil amplifikasi PCR terhadap gen RT SRV-2 isolat Indonesia, M) 1kb DNA ladder (Invitrogen), 1-2) produk PCR dari RT SRV-2 menghasilkan 1641 bp, 3) kontrol pereaksi.
Runutan asam amino selanjutnya disejajarkan secara majemuk (multiple-aligned) terhadap enzim RT asal retrovirus lainnya yang ada di data Genbank dan dikonstruksi pohon filogenetiknya untuk menentukan hubungan kekerabatan antara enzim RT retrovirus lainnya (Gambar 2.2). Hasil filogenetik menunjukkan bahwa sekuens target (RT SRV-2 Indo) mempunyai hubungan kekerabatan terdekat dengan SRV-2 isolat D2/RHE/OR asal Oregon Amerika Serikat (AAD43256.1). RT SRV-2 Indo juga mempunyai hubungan kekerabatan yang berada dalam satu kelompok (cluster) subfamili betaretrovirus adalah dengan SRV endogen (SERV), SRV-1, MPMV (SRV-3), SRV-4 dan MMTV. Subfamili betaretrovirus mempunyai kedekatan dengan subfamili deltavirus (HTLV-1), dimana kedua subfamili ini merupakan hasil percabangan dari subfamili alfaretrovirus (AMV). Ketiga subfamili ini merupakan hasil percabangan dari subfamili lentivirus dimana RT HIV-1 sebagai anggota virusnya merupakan virus yang paling banyak dipelajari dalam bidang biomedis. Subfamili-subfamili tersebut merupakan hasil percabangan dari spumavirus dan gamaretrovirus
M 1 2 3
1641 bp
yang terdapat MMLV sebagai anggota retrovirusnya yaitu enzim RT yang paling banyak diaplikasikan dalam teknik RT-PCR.
Gambar 2.2 Pohon filogenetik dari runutan asam amino RT SRV-2 terhadap retrovirus lainnya. RT SRV-2 isolat Indonesia ditandai dengan warna merah
Tingginya tingkat kelestarian (conserved region) dari gen pol ini menyebabkan daerah gen ini biasa digunakan dalam studi filogenetik baik berdasarkan runutan asam nukleat maupun asam aminonya (Li et al. 1995). Berdasarkan hasil runutan asam amino RT SRV-2 Indo yang meliputi daerah RT dan RNase H menunjukkan bahwa isolat ini masuk ke dalam kelompok SRV-2. Kemungkinan isolat ini merupakan nenek moyang dari isolat SRV-2 yang pertama kali ditemukan asal monyet resus (Marracci et al. 1999). Hasil filogenetik ini mempunyai kesamaan korelasi dengan yang pernah dilaporkan oleh Li et al. (1995) dalam penelitian mengenai filogenetik daerah pol retrovirus dari 55 retroelements dimana SRV-1 mempunya kedekatan dengan MPMV (SRV-3) dan berevolusi setelah SRV-2.
Prediksi Struktur Sekunder RT SRV-2 Isolat Indonesia
Pada penelitian ini, kami mencoba melakukan perkiraan perbandingan struktur fungsional dari RT SRV-2 dengan RT HIV-1. Perbandingan ini didasarkan atas data-data yang telah tersedia di dalam genbank yaitu data-data struktur kristal RT HIV-1 p66 pada basis data protein (PDB) dengan kode akses 2B6A dan 1HYS serta data pembanding pol SRV-2 dalam genbank dengan kode akses AAD43256.1. Runutan asam amino RT SRV-2 pada posisi 1-547 dan RT HIV-1 pada posisi 1-553 disejajarkan menggunakan program ClustalW dan I-TASSER (Gambar 2.3). Hasil perbandingan antara RT SRV-2 Indo dengan RT HIV-1 menunjukkan adanya kesamaan subdomain finger/palm sebesar 32% dari 237 residu, subdomain thumb mempunyai kesamaan 25.6% dari 82 residu, subdomain connection mempunyai kesamaan 12% dari 133 residu, dan
Deltaretrovirus Alpharetrovirus
Gammaretrovirus Lentivirus
[image:30.612.108.464.134.349.2]subdomain RNase H mempunyai kesamaan 27% dari 118 residu. Secara keseluruhan, perbandingan runutan penuh (full length) antara RT SV-2 Indo dengan RT HIV-1 RT mempunyai kesamaan sebesar 25.5% dari 553 residu, namun jika perbandingan melibatkan asam amino yang sangat lestari (misalnya Ala vs. Val, Leu vs. Ile, dan lain-lain) maka perbandingan ini menghasilkan kesamaan sebesar 43%.
Situs aktif polimerase yang berlokasi di subdomain finger/palm dicirikan oleh adanya tiga aspartat katalitik lestari yaitu Asp90, Asp165, Asp166 untuk RT SRV-2 Indo, dan Asp110, Asp185, Asp186 untuk RT HIV-1 (Tabel 2.1). Ketiga aspartat ini (dua aspartat terakhir berada dalam motif YXDD) berperan penting sebagai katalitik enzimatik dari RT HIV-1 melalui pengikatan terhadap kofaktor enzim yaitu kation divalen Mg2+ (Sharma et al. 2005). Hal ini mengantarkan pada suatu asumsi bahwa situs aktif katalitik RT SRV-2 Indo juga berkoordinasi dengan kation divalent Mg2+. Motif
YXDD, dimana X berupa asam amino variabel merupakan motif yang sangat lestari dan
berperan penting dalam berbagai enzim retrovirus RNA dependent DNA polymerases.
RT SRV-2 Indo dan RT HIV-1 mempunyai motif YMDD untuk asam amino Tyr, Met, Asp, Asp masing-masing pada posisi 163-166 untuk RT SRV-2 Indo dan 183-186 untuk
RT HIV-1. Motif asam amino YMDD juga dimiliki oleh SIV, dan FIV, namun berbeda
dengan MMLV dan FeLV yang memiliki motif YVDD (Sharma et al. 2005). Belakangan ini, banyak penelitian enzim RT yang difokuskan dalam mempelajari motif YXDD karena berhubungan dengan resistensi NRTI (nucleoside reverse transcriptase inhibitor), RT fidelity, proses polimerase dan replikasi virus (Sharma et al. 2005).
Situs pengikatan dNTPs yang juga berlokasi dalam situs aktif polimerase mempunyai residu lestari yaitu Lys64, Arg72, Asp110, Asp113, Gln151, dan Asp186 untuk RT HIV-1, sedangkan RT SRV-2 Indo memiliki asam amino Lys45, Arg52, Asp90, Asp93, Gln131, dan Asp166. Sementara itu, situs aktif RNase H yang berinteraksi dengan hibrid DNA/RNA mengandung motif lestari DED yang berupa asam amino Asp, Glu, dan Asp pada posisi 443, 478, dan 498 untuk RNase H HIV-1 dan 436, 465, 486 untuk RNase H SRV-2 RT Indo.
Pemodelan Struktur Tersier (Tiga Dimensi) RT SRV-2 Isolat Indonesia
Gambar 2.3 Penyejajaran runutan asam amino dan prediksi motif struktur sekunder RT SRV-2 Indo dan RT HIV-1. Runutan asam amino RT SV-2 Indo pada posisi 1-547 dan RT HIV-1 pada posisi 18-553. Motif dicirikan oleh heliks- (H) lembaran- (S), dan coils (C). Asam amino yang berperan dalam situs aktif ditandai huruf merah dan bayangan merah, huruf hijau untuk runutan yang berikatan dengan DNA, huruf biru untuk berikatan dengan dNTPs, dan huruf ungu/bayangan ungu adalah hibrid RNA-DNA (RNase H).
Finger/Palm
HIV-1 RT PISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPV 60
SRV-2 RT Indo ---PVWVDQWPLTQEKLAAAQQLVQEQLQAG--HIIESNSPWNTPI 41
Prediksi CCCCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHCC--CCCCCCCCCCCCS
Finger/Palm
HIV-1 RT FAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPL 120
SRV-2 RT Indo FVIKKK-SGKWRLLQDLRAVNATMVLMGALQPGLPSPVAIPQGYFKIVIDLKDCFFTIPL 100
Prediksi SSSSCC-CCCCHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCHCHCCCCCCSSSSSCCCSSSSCCC
Finger/Palm
HIV-1 RT DEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFKKQNPDIVI 180
SRV-2 RT Indo QPVDQKRFAFSLPSTNFKQPIKRYQWKVLPQGMANSPTLCQKYVAAAIEPIRKSWAQMYI 160
Prediksi CCCCCCCCSSCCCCCCCCCCCCCSSSSSCCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCSS
Finger/Palm
HIV-1 RT YQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWT 240
SRV-2 RT Indo IHYMDDILIAGKIG-EQVLQCFAQLKQALTTTGLQIAPEKVQLQDPYTYLGFQLNGPKIT 219
Prediksi SSSCCCSSSSCCCH-HHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCHHHCCCCCCSSSSSSSSCCSSS
Tumb
HIV-1 RT VQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIK--VRQLSKLLRGTKALTEVIPLTEE 298
SRV-2 RT Indo NHKAVIRRDKLQTLNDFQKLLGDINWLRPYLHLTTGDLKPLFDILKGDSNPNSPRFLSEA 279
Prediksi SCCSSSCCCCCCCHHHHHHHHCHHHHHCCCCCCCHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCHH
Connection
HIV-1 RT AELELAENR-EILKEPVHGVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTG--- 352
SRV-2 RT Indo ALTSLKKVETAIAEQFVTQIDYTQPLTFLIFNTTLTPTGLFWQNNPVMWVHLPASPKKVL 339
Prediksi HHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCHHHHHHCCCCCCSSSSSSCCCSSSSCCCCCCCCCC
Connection
HIV-1 RT --KYARMRGAHTNDVKQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQ--A 408
SRV-2 RT Indo FPYYDAIADLIILGRDNSKKYFGLEPSTIIQPYSKSQIHWLMQNTETWPIACASYAGNID 399
Prediksi CCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCSSSSCCCHHHHHHHHHHCHHHHHHHCCCCCCSS
RNaseH
HIV-1 RT TWIPEWEFVNTPPLVKLWYQ--LEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNKGRQKV 466
SRV-2 RT Indo NHYPPNKLIQFCKLHAVVFPRIISKTPLDNALLVFTDGSS---TGIAAYTFEKTTVKF 454
Prediksi SCCCCHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCCCCCCSSSSCCCC---CCCSSSSSCCCSSSS
RNaseH
HIV-1 RT VPLTNTTNQKTELQAIYLALQDS-GLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDKSESELVNQIIEQL 525
SRV-2 RT Indo K-TSHTSAQLVELQALIAVLSAFPHRALNIYTDSAYLAHSIPLLETVSQIKHISDTAKLF 513
Prediksi S-SCCCCHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCSSSSSCHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCHHHHH
RNaseH
HIV-1 RT IKKEK---VYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVS 553
SRV-2 RT Indo LQCQQLICNRSIPFYLGHIRAHSGLPRTLSQGNH-- 547
[image:32.612.84.528.73.730.2]Tabel 2.1 Perbandingan asam amino yang berperan dalam pembentukan motif dari RT SRV-2 Indo terhadap RT HIV-1.
Motif Domain/
Subdomain Asam Amino RT SRV Indo a
Asam Amino RT HIV-1b
Finger/Palm 1-216 1-237
Thumb 217-297 238-316
Connection 298-430 317-437
RNase H 431-547 438-553
Situs aktif Polimerase Trp7, Pro8, Phe42, Lys46, Arg52, Leu54, Gln55, Asp56, Arg58, Asn61, Ala69, Gln71, Pro72, Leu74, Asp90, Leu91, Lys92, Asp93, Cys94, Phe95, Gln131, Gly132, Ala134, Pro137, Tyr163, Asp165, Asp166, Leu209, Gly210
Trp24, Pro25, Phe61, Lys65, Arg72, Leu74, Val75, Asp76, Arg78, Asn81, Glu89, Gln91, Leu92, Ile94, Asp110, Val111, Gly112, Asp113, Ala114, Tyr115, Gln151, Gly152, Lys154, Pro157, Tyr183, Asp185, Asp186, Met230, Gly231 Hibrid RNA/DNA Ser438, Ser439, Thr440,
Ala461, Ala488, His531, Arg533, Ala534
Ala446, Arg448, Glu449, Thr473, Asn474, Gln475, Gln500, Hi539
Situs aktif RNase Asp436, Glu465, Asp486 Asp443, Glu478, Asp498, Situs pengikatan
dNTPs Lys45, Arg52, Asp90, Leu91, Lys92, Asp93, Cys94, Phe95, Gln131, Asp166
Lys64, Arg72, Asp110, Val111, Gly112, Asp113, Ala114, Tyr115, Gln151, Asp186
Motif YXDD Tyr163, Met164, Asp165,
Asp166 Tyr183, Met184, Asp185, Asp186
a RT SRV-2 Indo disejajarkan berdasarkan hasil I-TASSER dan mengacu pada SRV-2 pol (genbank
AAD43256.1)
bHIV-1 RT berdasarkan pada PDB 2B6A,1HYS dan mengacu pada pol HIV-1 (genbank ADN28092.1)
Superposisi antara RT SRV-2 Indo dengan RT HIV-1 dilakukan untuk memprediksi motif struktur secara lebih detail dan untuk mengoptimasi kecocokan ilustrasi yang terbaik. Tabel 2.1, Gambar 2.3 dan Gambar 2.5 memperlihatkan motif struktur yang digunakan dalam perbandingan superposisi antara RT SRV-2 Indo terhadap RT HIV-1. Struktur RT HIV-1 mempunyai struktur yang paling konsisten dan memberikan motif yang paling cocok dalam penelitian ini yaitu 1HYS (Sarafianos et al. 2001), 2HMI (Ding et al. 1998) dan 2B6A (Roth et al. 1997). Model struktur RT SRV-2 Indo mempunyai nilai homologi tertinggi terhadap RT HIV-1 (2B6A) dengan nilai estimasi akurasi pada TM-score 0.911, RMSD 1.85 Ao, dan coverage 0.953 yang diukur dengan menggunakan program TM-align dari Zhang Lab (Zhang dan Skolnick 2005).
Model RT SRV-2 Indo yang membentuk kompleks dengan substrat nukleotida mer-18/19 DNA-RNA dari posisi situs aktif polimerase sampai situs aktif RNase H terdapat pada Gambar 2.6. RT SRV-2 bersuperposisi dengan RT HIV-1 (1N6Q) (Sarafianos et al. 2002) berdasarkan hasil dari I-TASSER yang menunjukkan adanya kesamaan situs pengikatan. Pemeriksaan terhadap model ini dilakukan menggunakan server TM-align (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ TM-align) dengan nilai TM-score 0.838, kesamaan identitas 0.258, dan BS-TM-score 1.48. BS-TM-score menggambarkan hasil pengukuran berdasarkan kesamaan sekuens maupun struktur lokal (local similarity) antara situs pengikatan cetakan (template binding site) dengan situs pengikatan struktur sampel yang akan diprediksi. Berdasarkan hasil analisis pembandingan ini, diperoleh nilai BS-score >1.1 merefleksikan keselarasan lokal yang sangat baik antara sampel struktur yang diprediksi dengan situs pengikatan (Roy et al. 2010).
[image:34.612.112.486.414.604.2]
Gambar 2.6 Diagram pita d substrat dupleks domain enzim d dari DNA polim kuning.
Model interaksi antar dikembangkan berdasarkan s (Huang et al. 1998) (Gambar HIV-1 dengan dNTP yang ma Gln151 (Huang et al. 1998), yaitu Lys45, Arg52, Asp93 digantikan dengan Cys94 dan Phe tidak menyebabkan efek berinteraksi langsung dengan
Kami memprediksi nu cetakan yang akan berpasanga rantai samping Leu54 dan terh dan ketiga akan berinteraksi langsung dari basa dalam mi Leu74, dan Tyr163. dNTP ya dimana residu trifosfat akan Sementara itu, 3'-OH dari dN dan tulang punggung peptida a
dari dari RT SRV-2 Indo yang terikat pada m eks oligonukleotida RNA/DNA 18-19-basa. Berba m diwarnai seperti pada Gambar 2.4. Situs aktif as limerase dan RNase H digambarkan dalam bula
tara situs aktif RT SRV-2 Indo dengan asam struktur kristal RT HIV-1 yang telah tersedi 2.7). Asam amino yang terlibat dalam interaksi masuk adalah Lys65, Arg72, Asp113, Ala114, T
, memiliki kesamaan asam amino dengan RT SR 93, dan Gln131. Ala114 dan Tyr115 pada R Phe95 pada RT SRV-2 Indo. Penggantian Tyr1 ek yang signifikan dalam aktivitas katalitik enz
deoksiribosa dari trifosfat yang masuk (Boyer et nukleotida pertama yang tidak berpasangan (over gan dengan dNTP yang baru masuk dan berintera erhadap tulang punggung Gly132. Cetakan overh si dengan residu Trp7, Pro8, dan Phe42. Intera minor groove terjadi pada asam amino Pro137 yang baru masuk akan berpasangan dengan bas n berinteraksi dengan Lys45, Arg52, Asp93, d TP akan sejajar dengan sisi rantai Asp93, Phe9 a antara residu 93 dan 95.
model stick bagai variasi asam amino ulatan warna
Gambar 2.7 Interaksi antara polimerase pad RNA/DNA. DN biru, sedangkan dan ditandai de menggantung d dalam permuka Asp165, Gln13 hijau). (B) digambarkan da
Studi awal mengenai p Indo dibandingkan dengan he beberapa informasi mengenai keduanya sehingga dapat Menggunakan model struktu mekanisme biokimia dari R enzimatik telah memberikan struktur RT yang dieksplorasi RT yang tersedia telah me mengeksplorasi struktur RT S Hal ini akan memperluas pen virus HIV dan pengembangan
A
B
ara asam amino yang berperan penting dalam ada RT SRV-2 Indo dengan bagian terminal da DNA diindikasikan dengan model stick berwarna an RNA dicirikan dengan stick warna merah, puti dengan -1, -2, dan -3 sebagai dupleks, sedangkan
ditandai dengan +1. A) situs RT SRV-2 dig kaan berwarna hijau dengan asam amino lest 131, Gly132, dan Arg58 (ditunjukkan dalam st ) Interaksi situs aktif asam amino RT SR dalam model stick warna hijau.
Simpulan
pemodelan struktur tiga dimensi dari monomer heterodimer RT HIV-1 sangat menarik, yang me ai persamaan dan perbedaan sekuens asam amin at diprediksi fungsi masing-masing subd tural untuk mengeksplorasi karakteristik mole RT SRV-2 Indo dan memahami mekanisme n informasi yang berharga. Baru-baru
