IDENTIFIKASI MOLEKULER UNDUR-UNDUR LAUT
DARI PERAIRAN PANTAI CILACAP BERDASARKAN
MARKA GEN
Cytochrome Oxidase
Subunit I (COI)
AGUS ALIM HAKIM
DEPARTEMEN MANAJEMEN SUMBER DAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Molekuler Undur-Undur Laut dari Perairan Pantai Cilacap Berdasarkan Marka Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) adalah benar merupakan hasil karya saya dengan arahan dari dosen pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Semua sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Juni 2014
Agus Alim Hakim
ABSTRAK
AGUS ALIM HAKIM. Identifikasi Molekuler Undur-Undur Laut dari Perairan Pantai Cilacap Berdasarkan Marka Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI). Dibimbing oleh NURLISA A BUTET dan ALI MASHAR.
Undur-undur laut (Albunea symmysta) merupakan kepiting yang hidup pada sedimen pasir pantai yang masih terkena pasang surut air laut. Fenomena cryptic species dan complex species pada biota perairan seringkali menyebabkan kesalahan identifikasi secara morfologi. Awal penentuan genus Albunea
mengalami ketidakpastian disebabkan keragaman morfologi. Penelitian ini dirancang untuk mengidentifikasi dan menganalisis hubungan kekerabatan undur-undur laut A. symmysta yang berasal dari perairan pantai Cilacap berdasarkan marka molekuler gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI). Isolasi dan ekstraksi menghasilkan dua DNA total yang kemudian diamplifikasi dengan PCR, sekuensing gen COI, dan dihasilkan nukleotida dengan panjang 650 pb yang bersifat conserve. Gen COI A. symmysta disejajarkan dengan beberapa gen COI spesies lain yaitu ingroup dan outgroup (famili Hippidae) yang didapatkan dari
GenBank. Pensejajaran dilakukan dengan menggunakan software MEGA 5.0. Konstruksi pohon filogeni memperlihatkan perbedaan yang jelas antara famili Albuneidae dengan famili Hippidae. A. symmysta memiliki 158 situs nukleotida spesifik sebagai penciri spesies.
Kata kunci : A. symmysta, COI, identifikasi molekuler
ABSTRACT
AGUS ALIM HAKIM. Molecular Identification of Mole Crabs from Cilacap Coastal Waters Based on Cytochrome Oxidase Subunit I (COI). Supervised by NURLISA A. BUTET and ALI MASHAR.
Mole crab (Albunea symmysta) as an infaunal organism inhabits tidal-exposed sand sediment. Like other aquatic organisms, mole crab is destined to be
cryptic species and complex species often leading to morphologically misidentification. Taxonomic identification for genus Albunea was uncertain due to variation in morphology. This study was aimed at identifying and analizing the phylogenetic relationship A. symmysta from Cilacap coastal waters based on molecular genetic marker Cytochrome Oxidase subunit I (COI). Isolation and extraction resulted in two intact DNA product which were amplified using universal COI primer. There were 650 bp nucleotide sequences. COI gene
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan
pada
Departemen Manajemen Sumber Daya Perairan
IDENTIFIKASI MOLEKULER UNDUR-UNDUR LAUT
DARI PERAIRAN PANTAI CILACAP BERDASARKAN
MARKA GEN
Cytochrome Oxidase
Subunit I (COI)
AGUS ALIM HAKIM
DEPARTEMEN MANAJEMEN SUMBER DAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
Judul Skripsi : Identifikasi Molekuler Undur-Undur Laut dari Perairan Pantai Cilacap Berdasarkan Marka Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)
Nama : Agus Alim Hakim NIM : C24100031
Program Studi : Manajemen Sumber Daya Perairan
Disetujui oleh
Dr Ir Nurlisa A Butet, MSc Pembimbing I
Ali Mashar, SPi MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir M Mukhlis Kamal, MSc Ketua Departemen
PRAKATA
Puji syukur ke hadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat, hidayah, serta inayah yang diberikan, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini dengan judul Identifikasi Molekuler Undur-Undur Laut dari Perairan Pantai Cilacap Berdasarkan Marka Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI).
Penulis menyampaikan terima kasih kepada:
1. Institut Pertanian Bogor yang telah memberikan kesempatan untuk studi. 2. Beasiswa BIDIK MISI yang telah memberikan dana pendidikan selama
perkuliahan.
3. Direktur Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementrian Pendidikan dan Kebudayaan atas biaya penelitian melalui Biaya Operasional Perguruan Tinggi Negeri (BOPTN), Anggaran Pendapatan Belanja Negara (APBN), DIPA IPB Tahun Ajaran 2013, kode Mak : 2013. 089. 521219, Penelitian Dasar untuk Bagian, Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi, Lembaga Penelitan dan Pengabdian kepada Masyarakat, IPB.
4. Dr Ir Nurlisa A Butet, MSc sebagai ketua komisi pembimbing dan Ali Mashar, SPi MSi sebagai anggota komisi pembimbing yang telah memberi arahan dan masukan dalam penulisan karya ilmiah ini.
5. Dr Ir Yunizar Ernawati, MS selaku penguji tamu dan Dr Ir Niken Tunjung Murti Pratiwi, MSi selaku komisi pendidikan Departemen Manajemen Sumber Daya Perairan atas saran dan masukan yang sangat berarti.
6. Dr Ir Yonvitner, MSi sebagai dosen pembimbing akademik.
7. Keluarga: Bapak Mokh. Musodaq (Almarhum), Bapak Suhardi, Ibu Sulamah,
Mbak Rini (Almarhum), Mbak Nisa, Mas Anto, Mas Siswanto, In’am, Rizal,
dan Feri.
8. Sahabat Terbaik: Rizham, Dea, Dewi, Yuyun, Siska, Miftah, Wahyu, Bani, Nia, Mbok e, Merry, Akrom, Ria, Theo, Rinrin, Hesvi, Tari, Ita, Fanny, Ayu, Sari, Nina, Anis, Rivany, Febi, Hilmy, Lita, Noor, Mega, Anggun, Ajeng, Annisa, Irza, Kiky, Aji, Runi, Wida, Ninda, Ruri, Raisha, Nunuh, Lulu, Dwi, Laras, Serly, Nurul, Deni, Oci, Lufi, Sifa, Tiwi, Rifqi, Susi, Dana, Hendra, Rana, Oka, Ohang, Dhito, Andini, Apri, Tya, Dhini, Inggar, Dinta, Maida, bang Wahyu, bang Panji, ningsih, bang Genta, MSP 46, MSP 48, dan MSP 49.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2014
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR v
DAFTAR TABEL v
DAFTAR LAMPIRAN v
DARTAR ISTILAH vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
METODE
Waktu dan Lokasi Penelitian 2
Prosedur Penelitian 3
Analisis Data 5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil 5
Pembahasan 9
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan 12
Saran 12
DAFTAR PUSTAKA 12
LAMPIRAN 15
DAFTAR TABEL
1 Nilai rata-rata pada pengukuran morfologi Albunea symmysta jantan
dan betina 6
2 Klasifikasi Albunea symmysta, Hippa pacifica, Emerita
austroafricana, dan Emerita emeritus berdasarkan karakteristik
morfologi 6
3 Matriks jarak genetik fragmen gen COI pada Albunea symmysta, Hippa pacifica, Emerita austroafricana, dan Emerita emeritus
berdasarkan metode pairwise distance 8
DAFTAR GAMBAR
1 Undur-undur laut (Albunea symmysta) 3
2 Lokasi pengambilan contoh di perairan pantai Cilacap 3 3 Pengujian hasil isolasi DNA total otot kaki Albunea symmysta pada
gel agarosa 1,2%, (kolom kiri) sampel 1; (kolom kanan) sampel 2 7 4 Elektroforesis DNA hasil pre-test produk PCR pada gel agarosa 1%,
kolom kiri sampai kanan : marker 1kb; sampel 1; sampel 2 7
5 konstruksi pohon filogeni berdasarkan gen COI pada Albunea symmysta, Hippa pacifica, Emerita austroafricana, dan Emerita
emeritus 9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil blast n gen COI Albunea symmysta 15
2 Situs nukleotida spesifik gen COI mitokondria Albunea symmysta
berdasarkan sekuen 457 pb yang dibandingkan dengan outgroup 17
3 Situs nukleotida mutasi gen COI Albunea symmysta 1 dan
DAFTAR ISTILAH
barcode molekuler : urutan pendek dari basa nukleotida DNA yang dapat digunakan untuk mengenali suatu spesies
BLAST n : (Basic Local Alignment Search Tool-nucleotide) pilihan menu dari situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) yang digunakan untuk memastikan kebenaran suatu spesies dan mengetahui kedekatan dengan spesies lain complex species : satu spesies diklasifikasikan dalam beberapa nama spesies
akibat keragaman morfologi yang kompleks
conserve : basa nukleotida yang bersifat tetap dari setiap spesies dalam satu situs hasil pensejajaran
cryptic species : dua atau lebih spesies yang berbeda diklasifikasikan dalam satu nama spesies akibat karakteristik morfologi yang samar delesi : suatu jenis mutasi di mana satu atau lebih nukleotida yang
hilang dari suatu genom
DNA barcoding : metode identifikasi molekuler yang didasarkan pada urutan pendek basa nukleotida, segmen standar genom yang dapat memberikan barcode biologis yang memungkinkan identifikasi ditingkat spesies
GenBank : situs NCBI yang memuat informasi dasar mengenai bioteknologi (termasuk informasi dasar DNA)
gen conserve : gen yang berevolusi sangat lambat, sedikit mengalami delesi, dan insersi dalam sekuennya, serta variasi yang sedikit
insersi : suatu jenis mutasi di mana satu atau lebih nukleotida yang masuk ke dalam genom
origin species : pusat penyebaran spesies yang menunjukkan asal spesies pada lokasi berbeda
sekuensing : sebuah prosedur untuk menentukan urutan nukleotida dalam sampel DNA yang berguna dalam taksonomi, identifikasi, dan karakterisasi
singleton : satu basa nukleotida yang berbeda dari spesies lain dalam satu situs hasil pensejajaran
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Undur-undur laut (Mole Crab) merupakan kepiting dari ordo Decapoda yang hidup pada sedimen pasir di perairan pantai yang masih terkena pasang surut air laut (Boyko 2002). Undur-undur laut ditemukan di berbagai perairan Indo-pasifik (Boyko and Harvey 1999), seperti pantai Jawa, Bengkulu, dan Maluku (Boyko 2002). Undur-undur laut juga ditemukan di perairan pantai Cilacap. Undur-undur laut dengan nama lokal yutuk, memiliki potensi ekonomi bagi masyarakat sekitar berupa olahan makanan khas bagi pariwisata pantai di Kabupaten Cilacap. Penangkapannya dilakukan oleh warga setempat dengan alat tangkap tradisional berupa sorok bambu dan jaring sodo. Terdapat tiga jenis yutuk hasil tangkapan nelayan di perairan pantai Cilacap, yaitu Emerita emeritus
dan Hippa adactyla yang dominan ditemukan, serta Albunea symmysta yang ditemukan dalam jumlah sedikit.
Penelitian mengenai undur-undur laut di dunia telah banyak dilakukan meliputi aspek pertumbuhan (Fusaro 1978; Sastre 1991), kandungan logam berat (Perez 1999), reproduksi (Kanagalakshmi 2011), kebiasaan makan (Wenner 1977), dinamika populasi (Defeo and Cardoso 2002; Petracco et al. 2003), komposisi spesies (Phasuk and Boonruang 1975), distribusi (Boyko and Harvey 1999), dan filogenetik molekuler (Haye et al. 2002). Di Indonesia, penelitian mengenai undur-undur laut belum banyak dilakukan. Fenomena cryptic species dan
complex species yang umumnya terjadi pada biota perairan sering kali menyebabkan kesalahan identifikasi secara morfologi (Bickford et al. 2006), seperti fenomena cryptic species pada ikan pari (Arlyza et al. 2013) dan fenomena
complex species pada kerang raksasa (Su et al. 2014). Oleh karena itu diperlukan metode yang lebih akurat untuk menghindari kesalahan identifikasi.
Teknik DNA barcoding dapat digunakan dalam identifikasi suatu organisme mulai spesies hingga subspesies secara akurat terhadap berbagai spesies yang sulit dibedakan secara morfologi (Tudge 2000). Hasil DNA barcoding berupa sebuah
barcode molekuler dari sekuen pendek DNA untuk mengenali suatu spesies (Hajibabaei et al. 2007). Gen Cythocrome Oxsidase subunit I (COI) pada DNA mitokondria dapat dijadikan sebagai marka molekuler untuk penentuan spesies.
COI pada mitokondria merupakan gen yang berevolusi sangat lambat (Solihin 1994). Gen tersebut sedikit mengalami delesi dan insersi dalam sekuennya, serta variasi yang sedikit sehingga dapat digunakan sebagai DNA barcoding (Hebert et al. 2003). Hubungan kekerabatan antarspesies dapat dianalisis secara filogenetik menggunakan DNA mitokondria (Avise et al. 1987).
Penentuan genus Albunea pada awal tahun 1800-an mengalami ketidakpastian disebabkan adanya keragaman morfologi pada periopod (Boyko and McLaughlin 2010). Permasalahan taksonomi berdasarkan morfologi tersebut telah dapat diselesaikan dan diklasifikasikan Albunea dalam famili Albuneidae (Boyko 2002). Pendekatan molekuler belum pernah membuktikan bahwa genus
Albunea berasal dari famili yang berbeda dari famili Hippidae, sehingga diperlukan kajian mengenai molekuler untuk spesies A. symmysta. Hasil DNA
2
A. symmysta. Sekuen nukleotida A. symmysta dari perairan pantai Cilacap dapat dijadikan pedoman untuk mengidentifikasi situs-situs nukleotida yang bermutasi dan spesifik pada spesies yang sama di lokasi berbeda. Data tersebut dapat memberi informasi mengenai spesies origin dari A. symmysta.
Perumusan Masalah
Fenomena cryptic species dan complex species pada biota akuatik seringkali dapat mengakibatkan kesalahan dalam identifikasi berdasarkan karakter morfologi. Kepastian taksonomi (taxonomy certainty) sangat diperlukan dalam menentukan pengelolaan suatu sumber daya. Pendekatan molekuler menjadi salah satu cara untuk mengatasi masalah tersebut. DNA barcoding merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi spesies secara cepat dan akurat, dengan menggunakan fragmen sekuen nukleotida.
Habitat undur-undur laut (mole crab) ditemukan di pantai Cilacap yang terletak di pesisir selatan Jawa Tengah dengan salah satu spesies yang ditemukan adalah Albunea symmysta. Penentuan klasifikasi genus Albunea berdasarkan karakteristik morfologi pernah mengalami ketidakpastian. Saat ini sudah dipastikan bahwa genus Albunea berasal dari famili yang berbeda dari famili Hippidae, tetapi pendekatan molekuler belum pernah membuktikan hal tersebut. Oleh sebab itu, diperlukan adanya kajian DNA barcoding untuk mengetahui situs nukleotida spesifik spesies A. symmysta di daerah pantai Cilacap.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi nukleotida spesifik Albunea symmysta yang berasal dari perairan pantai Cilacap dan menganalisis hubungan kekerabatan dengan undur-undur laut lainnya dari superfamily Hippoidea berdasarkan marka molekuler gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI).
METODE
Waktu dan Lokasi Penelitian
3
Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan pada bulan November 2014. Undur-undur laut (Albunea symmysta) (Gambar 1) diambil dari perairan pantai Cilacap (Gambar 2) menggunakan alat tangkap tradisional yaitu sorok bambu dan jaring sodo.
Gambar 1 Undur-undur laut (Albunea symmysta)
4
Sampel undur-undur laut kemudian dimasukkan ke dalam tabung koleksi berukuran 100 ml yang berisi alkohol 96% dan dibawa ke Laboratorium Biologi Molekuler Departemen Manajemen Sumber Daya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan untuk analisis molekuler.
Identifikasi Morfologi
Identifikasi morfologi meliputi beberapa parameter, seperti bobot, panjang total, panjang lurus, panjang karapas, panjang telson, lebar karapas, lebar telson, serta panjang kaki depan kiri dan kanan dari undur-undur laut. Karakteristik morfologi undur-undur laut diamati dan disamakan dengan karakteristik yang terdapat di buku identifikasi kepiting genus Albunea (Boyko 2002). Karakteristik yang disamakan berupa morfometrik dan meristik undur-undur laut yang menjadi ciri khas spesies.
Isolasi dan Ekstraksi DNA
Lima belas sampel undur-undur laut yang telah diawetkan dalam alkohol 96% diambil otot periopod pertama dengan bobot 30 mg dan dicuci untuk menghilangkan kandungan alkohol. Sempel otot tersebut kemudian dikeringkan dan dimasukkan kedalam microtube untuk dilakukan proses isolasi dan ekstraksi DNA. Isolasi dan ekstraksi DNA dilakukan menggunakan kit komersil (Gene Aid) berdasarkan manual pabrik dengan beberapa modifikasi.
Uji Kualitas DNA
Kualitas DNA diuji pada gel agarosa 1,2% dengan menggunakan larutan buffer TAE1x. Cetakan DNA total yang dipakai sebanyak 2,5 μl. Visualisasi DNA total dilakukan dengan menggunakan mesin ultraviolet (Butet 2013).
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Gen COI
DNA yang memiliki kualitas yang baik layak dijadikan sebagai cetakan untuk amplifikasi fragmen DNA gen COI dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan kit komersial Kapa Extra Hot Start. Primer yang digunakan adalah primer universal untuk beberapa biota akuatik yang didisain oleh Butet (2013, unpublish data). Amplifikasi dilakukan pada suhu predenaturasi 94 0C selama 5 menit, suhu denaturasi 94 0C selama 45 detik, suhu
annealing 53 0C selama 1 menit, suhu elongasi 72 0C selama 1 menit, suhu pascaelongasi 72 0C selama 5 menit, dan suhu penyimpanan 15 0C selama 10 menit. Produk PCR kemudian divisualisasi menggunakan gel agarosa 1,2% pada mesin ultraviolet.
Pengurutan Produk PCR (Sekuensing) DNA A. symmysta Gen COI
5
Analisis Data
Pensejajaran Sekuen Nukleotida Gen COI A. symmysta
Sekuen nukleotida hasil sekuensing disejajarkan dengan menggunakan metoda Clustal W yang terdapat pada software MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011). Sekuen nukleotida gen COI A. symmysta dengan primer forward dan reverse
diedit dan dianalisis untuk mendapatkan sekuen DNA dari gen COI tersebut. Sebagai ingroup, sekuen gen COI A. symmysta hanya disejajarkan antara sampel 1 dan sampel 2 karena sekuens gen COI untuk spesies lain dalam genus Albunea
maupun famili Albuneidae tidak ditemukan di GenBank. Sebagai outgroup, sekuen gen COI A. symmysta disejajarkan dengan beberapa spesies dari famili selain Albuneidae, yaitu famili Hippidae yang meliputi Hippa pacifica
(AF246161.1), Emerita austroafricana (AF246160.1), dan Emerita emeritus
(AF246159.1). Sekuen gen COI spesies-spesies dari famili Hippidae tersebut diunduh dari data GenBank.
Jarak Genetik
Jarak genetik sekuen gen COI antara A. symmysta dan spesies lain dari famili Hippidae dihitung menggunakan metode pairwise distance yang terdapat pada program MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011). Hasil perhitungan jarak genetik disajikan dalam bentuk matriks data yang dapat digunakan untuk analisis hubungan kekerabatan antarspesies berdasarkan pohon filogeni.
Analisis Filogeni
Analisis filogeni A. symmysta dikonstruksi antara gen COI A. symmysta
dengan H. pacifica, E. austroafricana, dan E. emeritus. Konstruksi pohon filogeni menggunakan metode bootstrapped Neighbour-Joinning (NJ) dengan 1000 kali pengulangan yang terdapat pada program MEGA 5.0 (Tamura et al.
2011).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Taksonomi Berdasarkan Morfologi
Identifikasi secara morfologi dilakukan dengan mengukur beberapa parameter karakteristik morfologi undur-undur laut A. symmysta. Perbedaan spesies A. symmysta jantan dan betina terlihat dari bentuk telson. Nilai rata-rata hasil pengukuran disajikan pada Tabel 1.
6
sehingga didapatkan nama spesies dari tingkatan paling umum, yaitu mulai dari tingkat kingdom hingga tingkat spesies.
Tabel 1 Nilai rata-rata pada pengukuran morfologi Albunea symmysta jantan dan betina
Identifikasi secara morfologi dapat membuktikan kepastian taksonomi dari suatu organisme. Hasil identifikasi secara morfologi menunjukkan bahwa spesies yang diamati adalah benar bernama Albunea symmysta. Perbandingan klasifikasi
A. symmysta dengan beberapa spesies dari undur-undur laut lain yang masih dalam satu ordo Decapoda dapat diketahui hubungan kekerabatan berdasarkan karakteristik morfologi (Tabel 2).
Tabel 2 Klasifikasi Albunea symmysta, Hippa pacifica, Emerita austroafricana, dan Emerita emeritus berdasarkan karakteristik morfologi
Kingdom Animalia Genus Albunea Hippa Emerita
Spesies
Beberapa klasifikasi spesies yang masih dalam satu ordo Decapoda ditentukan berdasarkan kemiripan morfologi, yaitu Albunea symmysta, Hippa pacifica, Emerita austroafricana, dan Emerita emeritus. Spesies pada genus
Emerita memiliki kemiripan dengan spesies dalam genus Hippa sehingga memiliki hubungan kekerabatan yang lebih dekat secara morfologi. Ketiga spesies tersebut memiliki hubungan kekerabatan yang jauh dari A. symmysta
karena berbeda famili.
DNA Total
Isolasi dan ekstraksi DNA dari 15 sampel undur-undur laut (Albunea symmysta) menghasilkan 2 sampel dengan kualitas DNA yang baik. Penentuan kualitas tersebut telah dilakukan melalui pengujian terhadap DNA total pada agarosa 1,2% (Gambar 3).
Sampel 1 dan sampel 2 memiliki kualitas DNA yang baik. Kualitas DNA yang baik ditunjukkan dengan pita DNA yang terang. DNA yang memiliki kualitas baik tersebut layak dijadikan sebagai cetakan untuk amplifikasi gen COI dengan menggunakan teknik PCR.
7
Gambar 3 Pengujian hasil isolasi DNA total otot kaki Albunea symmysta pada gel agarosa 1,2%, (kolom kiri) sampel 1; (kolom kanan) sampel 2
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Gen COI
Amplifikasi fragmen DNA gen COI dilakukan dengan penempelan primer pada suhu optimum sebesar 53ºC. Gen COI target amplifikasi berukuran antara 500-750 pb (Gambar 4). Selanjutnya 2 sampel DNA dimurnikan dan disekuensing sehingga diperoleh kualitas sekuen nukleotida yang baik.
Gambar 4 Elektroforesis DNA hasil pre-test produk PCR pada gel agarosa 1%, kolom kiri sampai kanan : marker 1kb; sampel 1; sampel 2
Sekuensing DNA dan Pensejajaran Sekuen Nukleotida Gen COI A. symmysta
Berdasarkan hasil sekuensing gen COI A. symmysta dan hasil pensejajaran dengan primer forward dan reverse, didapatkan panjang nukleotida yang dihasilkan sampel 1 dan 2, masing-masing 642 dan 630 bp. Kedua sekuen nukleotida tersebut kemudian disejajarkan sehingga didapatkan nukleotida sepanjang 650 bp.
Hasil analisis menggunakan program MEGA 5.0 (Tamura et al. 2011) diperoleh komposisi basa nukleotida yang terdiri dari 28,7% basa timin (T), 32,8% basa adenin (A), 15,6% basa sitosin (C) dan 22,9% basa guanin (G). Komposisi basa nukleotida purin (guanin dan adenin) memiliki jumlah yang lebih tinggi dari pada basa nukleotida purimidin (sitosin dan timin) yaitu sebesar 55,7%.
Sekuen nukleotida gen COI A. symmysta diunggah pada BLAST n (Basic Local Alignment Search Tool- nucleotide) pada situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) untuk memastikan kebenarannya dan mengetahui
pita DNA
8
kedekatannya dengan spesies lain. Sampel A. symmysta memiliki kedekatan dengan Emerita emeritus (GenBank: AF246159.1) sebesar 96% (Lampiran 1). Data dari GenBank menunjukkan bahwa belum ada sekuen gen COI dari spesies yang terdapat di dalam famili Albuneidae, sehingga untuk analisis filogeni digunakan ingroup spesies A. symmysta sendiri.
Pensejajaran sekuen nukleotida gen COI dengan spesies dari famili Hippidae menghasilkan nilai conserved, variabel, dan singleton, masing-masing sebesar 31,5% (144/457), 68,05% (311/457), dan 23,4% (107/457). Nilai variabel menunjukkan bahwa terdapat variasi basa nukleotida antara A. symmysta dengan spesies outgroup yang merupakan karakteristik pembeda dari masing-masing spesies.
Analisis Filogeni Gen COI A. symmysta
Jarak genetik fragmen gen COI antara A. symmysta dengan spesies lain dari famili Hippidae berkisar antara 0,576-0,613. Jarak genetik menggambarkan hubungan kekerabatan antarspesies (Tabel 3).
Tabel 3 Matriks jarak genetik fragmen gen COI pada Albunea symmysta, Hippa pacifica, Emerita austroafricana, dan Emerita emeritus berdasarkan metode pairwise distance
Perbandingan antara A. symmysta dengan spesies outgroup, didapatkan nilai jarak genetik terendah antara A. symmysta sampel 1 dan 2 yaitu sebesar 0,165. Jarak genetik tertinggi antara A. symmysta dengan Hippa pacifica sebesar 0,613.
Data dari matriks tersebut digunakan untuk analisis hubungan kekerabatan berdasarkan pohon filogeni. Konstruksi pohon filogeni ini menunjukkan bahwa famili Albuneidea terpisah nyata dari famili Hippidae dengan nilai jarak genetik sebesar 0,597 (Gambar 5).
Pohon filogeni A. symmysta, H. pacifica, E. austroafricana, dan E. emeritus
dikonstruksi berdasarkan jarak genetik pairwise distance dari basa-basa nukleotida COI yang menunjukkan hubungan kekerabatan antar spesies. Ingroup
9
Gambar 5 Konstruksi pohon filogeni berdasarkan gen COI pada Albunea symmysta, Hippa pacifica, Emerita austroafricana, dan Emerita emeritus
Nukleotida Spesifik Gen COI A. symmysta
Pensejajaran sekuen nukleotida gen COI dengan spesies dari famili Hippidae didapatkan situs spesifik dari A. symmysta (Lampiran 2). Situs spesifik tersebut merupakan basa nukleotida spesifik dari A. symmysta sebagai penciri yang dapat membedakan dengan spesies dari famili Hippidae. Terdapat 158 situs nukleotida yang spesifik dari spesies A. symmysta yang menunjukkan adanya evolusi spesifik pada A. symmysta.
Situs Mutasi Gen COI A. symmysta
Pensejajaran sekuen nukleotida gen COI A. symmysta sampel 1 dan sampel 2 didapatkan situs mutasi dari A. symmysta (Lampiran 3). Situs mutasi tersebut merupakan basa nukleotida A. symmysta yang mengalami perubahan berupa insersi dan delasi. Terdapat 40 situs nukleotida mutasi pada spesies A. symmysta
yang terdiri dari 20 situs nukleotida yang mengalami insersi dan 20 situs nukleotida yang mengalami delesi.
Pembahasan
Identifikasi morfologi terhadap spesies yang diamati menunjukkan bahwa spesies ini termasuk dalam genus Albunea dengan nama spesies Albunea symmysta. Nama spesies dapat ditentukan secara jelas dengan adanya buku identifikasi genus Albunea yang mencantumkan secara detail karakteristik morfologi dari masing-masing spesies (Boyko 2002). Fenomena cryptic species
pada udur-undur laut yang memiliki keberagaman morfologi yang kompleks berupa bentuk periopod, mengakibatkan ketidakpastian dalam penentuan genus
Albunea pada awal tahun 1800-an (Boyko and McLaughlin 2010). Klasifikasi spesies undur-undur laut berdasarkan karakteristik morfologi dapat memungkinkan terjadinya kesalahan dengan adanya fenomena tersebut.
10
famili Albuneidae dengan famili lain pada bentuk kaki pertama subchelate dengan struktur seperti penjepit (capit) (FAO 1998). Pembuktian bahwa genus Albunea
berasal dari famili yang berbeda dengan famili Hippidae belum pernah dilakukan dengan pendekatan molekuler.
Identifikasi molekuler dari A. symmysta dengan menggunakan sekuen gen COI telah dipastikan kebenaran dan kedekatannya dengan spesies lain berdasarkan pengunggahan pada BLAST n (Basic Local Alignment Search Tool-nucleotide) pada situs NCBI (National Center for Biotechnology Information). Sampel A. symmysta memiliki kedekatan dengan Emerita emeritus sebesar 96%. Menurut Herbert et al. (2003), perbedaan jarak genetik antara A. symmysta dengan spesies lainnya yang diperoleh dari GenBank sebesar ± 4% menunjukkan bahwa secara molekuler dipastikan A. symmysta berbeda spesies dengan Emerita emeritus dan Hippa adactyla dari famili Hippidae.
15 sampel undur-undur diisolasi dan dihasilkan 2 sampel DNA yang memiliki kualitas baik sehingga layak dilanjutkan hingga tahap sekuensing. Pengujian kemiripan dan kedekatan dilakukan dengan mengunggah basa nukleotida hasil penelitian pada situs NCBI. Hasil tersebut menunjukkan bahwa spesies yang dimati berbeda dengan undur-undur laut spesies lainnya. 2 sampel yang diteliti telah dapat mewakili dalam identifikasi A. symmysta secara molekuler.
Konstruksi pohon filogeni A. symmysta dengan outgroup menunjukkan bahwa terjadi pemisahan secara jelas antara famili Albuneidea dengan famili Hippidae dengan nilai jarak genetik sebesar 0,597. Penelitian ini berhasil membuktikan bahwa terjadi suatu pemisahan secara jelas antara famili Albuneidae dengan famili Hippidae berdasarkan konstruksi pohon filogeni tersebut. Selain itu, dapat menguatkan identifikasi morfologi mengenai pengklasifikasikan Albunea
dalam famili Albuneidae. Penggunaan gen COI dalam identifikasi secara molekuler berhasil mengidentifikasi A. symmysta karena gen tersebut bersifat conserve (Herbert et al. 2003).
Menurut FAO (1998), secara morfologi, famili Albuneidae lebih tua dari familli Hippidae. Hal tersebut dikuatkan dengan bentuk konstruksi pohon filogeni pada penelitian ini. Kemungkinan awal evolusi undur-undur laut dimulai dari famili Albuneidae yang terpisah dan hidup di lokasi yang berbeda. Fragmentasi habitat menyebabkan terjadinya perubahan genetik (Moreira 2009). Fragmentasi habitat tersebut dapat disebabkan oleh proses-proses geologis yang dapat merubah keanekargaman hayati. Akibat fragmentasi, dalam kurun waktu yang relatif lama, famili Albuneidae tersebut berevolusi menjadi famili lain yang diakibatkan oleh tekanan lingkungan.
Hasil DNA barcoding undur-undur laut (A. symmysta) yang berasal dari perairan pantai Cilacap ini dapat dijadikan sebagai informasi dasar untuk menentukan status taksonomi A. symmysta dari perairan lainnya. Situs nukeotida pada A. symmysta memiliki ciri yang berbeda dari spesies outgroup. Menurut Maddison (1984), penggunaan outgroup berfungsi sebagai faktor koreksi dalam penentuan karakter diantara ingroup yang ada.
11 Sekuen nukleotida gen COI A. symmysta mengalami mutasi berupa insersi dan delasi. Terdapat 40 situs nukleotida mutasi pada spesies A. symmysta. Mutasi yang terjadi antara kedua basa nukleotida gen COI A. symmysta tersebu bersifat
silent. Menurut Simon (1994), silent mutation adalah gen yang mengalami banyak substitusi pada sekuen nukleotida tetapi tidak berpengaruh pada identitas asam amino. Jika identitas asam amino tersebut berubah, maka terjadi perubahan dalam pembentukan enzim yang dapat berpengaruh pada morfologi. Mutasi yang terjadi pada A. symmysta bersifat silent sehingga tidak merubah bentuk morfologi dari A. symmysta.
Komposisi basa nukleotida A. symmysta didominasi oleh basa purin (guanin dan adenin) sebesar 55,7%. Basa nukleotida A. symmysta juga didominasi oleh ikatan basa A (adenin) dan basa T (timin). Ikatan hidrogen A-T terdiri dari 2 ikatan hidrogen yang bersifat lebih lemah dibandingkan dengan ikatan hidrogen G-C yang memiliki 3 ikatan hidrogen (Jusuf 2001). Komposisi basa nukleotida A. symmysta tersebut menunjukkan bahwa ikatan tersebut mudah terpisah sehingga kemungkinan terjadinya mutasi pada spesies A. symmysta lebih tinggi.
Kepastian taksonomi (taxonomy certainty) sangat diperlukan dalam menentukan pengelolaan suatu sumber daya. Suatu spesies yang memiliki taksonomi secara morfologi yang sudah jelas, perlu dilakukan identifikasi secara molekuler guna mengetahui urutan basa nukleotida. Hasil urutan basa nukleotida ini dapat digunakan untuk mengetahui perkembangan evolusi dan mutasi dari spesies tersebut.
Komposisi hasil tangkapan undur-undur laut yang ditemukan di Cilacap memiliki kesamaan dengan komposisi undur-undur laut yang ditemukan di Thailand. Perairan Provinsi Phuket dan Phangnga memiliki 3 jenis undur-undur laut sama seperti yang ada di Cilacap, yaitu Emerita emeritus, Hippa adactyla,
dan Albunea symmysta (Phasuk and Boonruang 1975). Hal tersebut merupakan penemuan baru. Lokasi yang memiliki komposisi 3 spesies sekaligus, jarang ditemukan di lokasi lain. Indonesia dan Thailand memiliki kesamaan iklim yaitu negara beriklim tropis yang memiliki perbedaan komposisi dari negara yang beriklim subtropis. Negara subtropis biasanya hanya ditemukan satu jenis undur-undur laut.
Identifikasi molekuler dari penelitian ini telah menunjukan kepastian taksonomi (taxonomy certainty) dari Albunea symmysta, sehingga dapat ditentukan pengelolaan yang tepat. Basa nukleotida A. symmysta hasil penelitian ini dapat dibandingkan dengan penelitian lain di lokasi yang berbeda, sehingga akan terlihat perbedaan sekuen basa nukleotida yang muncul (insersi) dan hilang (delesi) dan dapat diketahui spesies asal atau pusat penyebaran spesies. Penurunan keragaman genetik bisa terjadi secara alami melalui penghanyutan gen. Penghanyutan gen (random genetic drift) menggambarkan perubahan secara acak di dalam suatu populasi yang mengakibatkan penurunan keragaman genetik dari generasi ke generasi yang bukan disebabkan oleh tekanan lingkungan tetapi karena adanya mutasi secara murni (Singleton and Sainsbury 2006). Selain itu, informasi genetik ini dapat digunakan sebagai dasar penentuan genetika populasi dan pengkajian stok dari A..symmysta. Jika suatu kawasan memiliki keragaman genetik yang rendah dari undur-undur laut (A..symmysta) akibat tekanan
12
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Albunea symmysta memiliki 158 situs spesifik yang dapat membedakan dengan undur-undur laut spesies lain pada famili Hippidae, sehingga basa nukleotida A. symmysta ini dapat digunakan sebagai acuan identifikasi untuk populasi undur-undur laut dari lokasi yang berbeda.
Saran
Informasi genetik A. symmysta harus dikaji lebih lanjut dengan menggunakan gen penanda lainnya sehingga didapatkan genom utuh A. symmysta. Selain itu, sekuen basa nukleotida tersebut dapat digunakan untuk merancang primer gen COI spesifik untuk A. symmysta.
DAFTAR PUSTAKA
Avise JC, Arnold J, Ball AM, Bermingham E, Lamb T, Neigel JE, Reeb CA, Saunders NC. 1987. Intraspecific phylogeography: the mitochondrial DNA bridges I between population genetics and systematics. Ann. Rev. Ecol. Syst. 18:489-522.
Arlyza IS, Shen KN, Solihin DD, Soedharma D, Berrebi P, Borsa P. 2013. Species boundaries in the Himantura uarnak species complex (Myliobatiformes: Dasyatidae). Mol. Phyl. Evol. 66:429–435.
Bickford D, Lohman DJ, Sodhi NS, Ng PKL, Meler R, Winker K, Ingram KK, Das I. 2006. Cryptic species as a window on diversity and conservation.
Ecology and Evolution. 22:148-155.
Boyko CB, Harvey AW. 1999. Crustacea Decapoda: Albuneidae and Hippidae of the tropical Indo-West Pacific region, in Crosnier A. (ed.), Résultats des Campagnes MUSORSTOM. Volume 20. Mémoires du Muséum national
d’Histoire naturelle. 180:379-406.
Boyko CB. 2002. A worldwide revision of the recent and fossil sand crabs of the Albuneidae Stimpson and Blepharipodidae, new family (Crustacea: Decapoda: Anomura: Hippoidea). Bulletin of the American Museum of Natural History. 272–396.
Boyko CB, McLaughlin PA. 2010. Annotated checklist of anomuran Decapod Crustaceans of the world (exclusive of the Kiwaoidea and families Chirostylidae and Galatheidae of the Galatheoidea) part VI–Hippoidea.
The Raffles Bulletin Of Zoology. 23:139–151.
13 Defeo O, Cardoso RS. 2002. Macroecology of population dynamics and life history traits of the mole crab Emerita brasiliensis in Atlantic sandy beaches of South America. Mar Ecol Prog Ser. 239:169–179.
FAO. 1998. The Living Marine Resources Of The Western Central Pacific :Volume 2. Cephalopods, Crustaceans, Holothurians And Sharks.
Carpenter KE, Niem VH, editor. Rome (IT): FAO.
Fusaro C. 1978. Growth rate of the sand crab, Emerita analoga, (Hippidae) in two different environments. Fishery Bulletin. 76(2):369-375.
Hajibabaei M, Singer GAC, Hebert PDN, Hickey DA. 2007. DNA barcoding: how it complements taxonomy, molecular phylogenetics and population genetics. TRENDS in Genetics. 23(4):167-172.
Haye PA, Tam YK, Kornfield I. 2002. Molecular phylogenetics of mole crabs (Hippidae : Emerita). Crustacean Biology. 22 (4):903-915.
Hebert PDN, Ratnasingham S, De Waard JR. 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species.
Proc R Soc. 270:96–99.
Jusuf M. 2001. Genetika I: Struktur dan Ekspresi Gen. Jakarta (ID): Sagung Seto. Kanagalakshmi K. 2011. Fluctuation of protein level in Haemolymph, ovary and
Hepatopancreas during non-reproductive and reproductive Molt Cycle of
Albunea symmista. Journal of research in Biology. 2: 68-72
Maddison WP, Donoghue MJ, Maddison DR. 1984. Outgroup analysis and parsimony. Syst Zool. 33:83-103.
Moreira PA, Fernandes GW, Collevatti RG. 2009. Fragmentation and spatial genetic structure in Tabebuia ochracea (Bignoniaceae) a seasonally dry Neotropical tree. Forest Ecology and Management. 258:2690–2695. Perez D. 1999. Mercury levels in mole crab Hippa cubensis, Emerita brasiliensis,
E. portoricensis, and Lepidopa richmondi (Crustacea: Decapoda: Hippidae) from a Sandy Beach at Venezuela. Environmental Contamination and Toxicology. 63:320-326.
Petracco M, Valeria GV, Ricardo SC. 2003. Population dynamics and secondary production of Emerita brasiliensis (Crustacea : Hippidae) at Prainha Beach, Brazil. Marine Ecology. 24(3):231-245.
Phasuk B, Boonruang P. 1975. Species composition and abundance distribution of anumuran sand crabs and population bionomic of Emerita emeritus (L) along the Indian Ocean Coast of Thailand (Decapoda : Hippidae).
Research buletin. 8:1-17.
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. 1977. DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 74:5463-5467.
Sastre MP. 1991.S ex-specific growth and survival in the mole crab Emerita portoricensis (Schmitt) Journal of Crustacean Biology, 11(1):103-112. Simon C, Frati F, Beckenbach A, Crespi B, Liu H, Flook P. 1994. Evolution,
weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequence and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers.
Entomological Society of America. 87(6):651-701.
Singleton P, Sainsbury D. 2006. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Third Edition. England (GB): Wiley & Sons Ltd.
14
Su Y, Hung JH, Kubo H, Liu LL. 2014. Tridacna noae (Röding, 1798) – a valid giant clam species separated from T. maxima (Röding, 1798) by morphological and genetic data. Raffles Bulletin Of Zoology. 62:124–135 Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2011. Mega 5: molecular evolutionary
genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. J Mol Biol Evol. 28(10):2731–2739.
Tudge C. 2000. The Variety Of Life. New York (US): Oxford University Press. Wenner AM. 1977. Food supply, feeding habits, and egg production in pacific
15
LAMPIRAN
Lampiran 1 Hasil blast n gen COI Albunea symmysta
BLAST ®
Basic Local Alignment Search Tool
Nucleotide Sequence (630 letters)
Query ID lcl|35979 Query Length 630
Description None Database Name nr
Molecule type nucleic acid Description Nucleotide collection (nt)
Program BLASTN 2.2.27+
Graphic Summary
16
Emerita emeritus cytochrome oxidase subunit I (COI) gene, partial cds; mitochondrial gene for mitochondrial product
769 769 74% 0.0 96% AF246159.1
Emerita benedicti (isolate Port Aransas, Texas) mitochondrial cytochrome oxidase subunit I gene, partial cds
598 598 93%
2,00E-167 85% L43102.1
Emerita rathbunae (isolate El Salvador) mitochondrial cytochrome oxidase subunit I gene, partial cds
556 556 94%
1,00E-154 84% L43103.1
Emerita talpoida (isolate Panacea, Florida) mitochondrial cytochrome
17 Lampiran 2 Situs nukleotida spesifik gen COI mitokondria Albunea symmysta
berdasarkan sekuen 457 pb yang dibandingkan dengan outgroup
18
Lampiran 3 Situs nukleotida mutasi gen COI Albunea symmysta 1 dan Albunea symmysta 2
Spesies
Situs nukleotida ke -
1 1 1 1 6 6 6 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 3 7 9 1 1 3 4 3 3 4 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 4 5 6 7 4 5 3 5 8 9 0 1 Albunea symmysta 1 G T C T G G G T A G T C T G A G T A T - - - G - - - - Albunea symmysta 2 - - - A T T G T T T – T G T T
Situs nukleotida ke
19
RIWAYAT HIDUP
Penulis bernama lengkap Agus Alim Hakim, lahir di Kendal 12 Maret 1992, merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara dari ibu bernama Sulamah dan ayah Mokh Musodaq (Almarhum). Penulis mulai mengikuti pendidikan sekolah dasar di SDN 1 Sukomulyo lulus pada tahun 2004.
Melanjutkan di SMPN 1 Kaliwungu lulus pada tahun 2007 dan dilanjutkan sekolah di SMAN 1 Kendal lulus pada tahun 2010. Penulis lulus menjadi mahasiswa di Institut Pertanian Bogor dengan mendapatkan beasiswa Bidikmisi, melalui jalur Ujian Seleksi Masuk IPB (USMI) pada tahun 2010 sebagai mahasiswa Departemen Sumber Daya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Kegiatan di luar akademik, penulis aktif dalam organisasi BEM FPIK IPB tahun 2011-2012 sebagai anggota Departemen Sosial dan Lingkungan, Himpunan Mahasiswa Manajemen Sumber Daya Perairan (HIMASPER) tahun 2012-2013 sebagai anggota divisi HRD. Selain itu, penilis aktif sebagai anggota dalam organisasi Kementrian Humas pada Himpunan Mahasiswa Manajemen Sumber Daya Perairan Se Indonesia (HIMASUPERINDO) tahun 2013-2015. Ketua
pelaksana “Water Festival 2013”. Penulis mengajar pada bimbingan belajar mata
