Transfer plasmid bakteri metanogenik asal tanah tempat pembuangan air kelapa ke dalam E. coli C600 untuk produksi biogas metan

(1)

@ Hak cipta rnilik IPB (Institut Pertanian Bogor)

Bogor Agricultural University

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber:

- a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.

(2)

rJ d

g a p E ABSTRAK

ARDl KAPAHANG. Tmsfer Plasnid Bakteri Metanogenik Asal Tanah Tempat Pembuangan Air Kelapa

ke

dalam E. coli C600 untuk Produksi Biogas Metan. Di bawah bimbingan MAFUA BINTANG sebagai Ketua Komisi dm MANSSUR HAWAB, DUD1 DJUHDLA SASTRAATMADJA dm DEDY DURYADI SOLIHiN sebagai Anggota Komisi.

Bakteri adalah mikroba yang dapat hidup di semua tempat dimma ada

kehidupan. Ada yang menguntmgkan, rnerugikan dan masih sebagian besar tidak diketahui manfinatnya karma belum diidentifikasi dm dikdtur. Bakteri metamgenik adalah salah satu bakteri yang menguntungkan. Bakteri ini

5

mauproduksi mtan yang w a d i p y u s u n utama biogas sebagai aItmtif bahan bakar di masa yang

akan

datang. K w a k a n bakteri metanogenik tidak bisa dikultur,

akan

tetapi beberap di autaranya dit-kan d a b tanah pcmbuangan limbpb air kelapa. Air kdapa di lndmesia Wususnya di Pmpinsi Sulawesi Utsra tadapat mliotpab dan pada urn-ya ma& meujadi limbah. 3 Q

Z

ltimbah air kelapa mudab terfi=rmentasi k m a magandung baharr-bahan orgaaik .m

EX

yang benosnfaat nomL pectmbuhan dan perkembmgan h b a tau[ama dari

3 3

5 k 2

3

cn golonganbakteri.

5 2 8 P rC T1@m pelitian ini adalah mengisoIasi

dm

mengkaeakterisasi serta

T

g z

Q

5

mengisolasi dan magid- DNA bakteri m e t a n o g d yang hidup dalam 9 3

2

_taoah_tempt_{pmbmgan limbah}_{air Icelapa}_{s e 1 a n . a}_dihdingkan_dmgm

'

C

_-.

Z P

3

2

W metanogenik dari dalam kotoran =pi; mengis01asi dan menhmsf~rmasi

2. , 9

i.

plasmid bakteri metanogenik ke dalam E. coli C600 dan mengidentifikasi p d u k

Q

i.

2

'

metaa dari E. coli forma an.

$

.=

m 0

'0 0 (L1 Penelitian ini

&lakukan

dengan metode fmentasi, andisis, kamkterisasi

5T

$ $

4

dan identifikasi bakteri metmogenik serta transfer plasmid. Tahap ~~IIIUIM,

$

$$

-

bakteri metanogeaik diisolasi dari tanah terngat pembuangau limbah

air

kelapa

T

Q Z E

-0 dengan fennentasi. Sam@ diambil dari empat tempat di Minahasa, yaitu: Rasi

0

c s

(I), Kdra (I[), Ammug (110 dm Lola (IV)

dan

satu dari pasar B o p

(V).

Tahap

p

8 3 kedua, produksi gas metan dari feamentasi dianalisis secara kualitatif den-

$

-9 membakmya dm secara W t a t i f dengan Kromatografi

Gas

(KG)

dan

Weri

8.

3

ymg didapat ddmakterisasi dengan metode Bergey's. Tahap ketiga adalah L identifikasi dengan jdan isolasi DNA, amplifikasi DNA dengao

PCR

B

$

Ia

z

menggunakan primer spesi6k prokariot 16s rRNA yaitu 63F (S-CAG GCC TAA

CAC ATG CAA GTC-3" d i ~ ~ 1387R (5'-CiGG CGG WGT GTA CAA GGC-3')

T _dan_primer_spesifik_metauogedc_(~naA)_yaihi _{F (5'-GGT GGT GTM}_GGA_T'TC

#

s ACA CAR TAY GCW ACA OC3')

dsn

R

(5'-TTC ATT GCR TAG TiW GGR

e

s

-. _Q

0

TAG TT-37, sehjutnya sequencing DNA dianalisis dengan BioEdit Sequence

E Aligment dan anelisis filogeni menggunakan program

MEGA

vasi 3.1. Isolat

9

E bakteri metanogenik dari kotoran sapi (kontrol positip) diperoleh seperti p m

3

isolasi dan iaentifdentifbsi pada tahq pertama dm tahap ke t i p Tahap ke empat 3

"

1. adalah tnuufbranasi plasmid isolat

P

ke E. cofi C600 menggunakan metode "Blint

t! 0

Test".

Tahap ke l i i fwmatasi air kelapa oleh E. coli transforman. yang

E

s menimbulkan gas dianailsis s e ~ a r a kualitatif dengan membakarnya dan

secara

ktmntitatif dengan KG

7 Hasil peditiau, smber isolat yang manproduksi gas metan terbanyak

dm stabil berasal dari Rasi (I) dan A m m g (In). Ciri-ciri W e i mnuut metode

(3)

" x p !

l a a a

; & & 3 =

, m X X m ~

* s s a

$ E g g "

-2

"s

5 3

g o

;%SIRRE

~

h

$

h

3 g n o ( D * S

= ' u Q p .

2 n m Z c 3%&,

Z J ~ S Q

_,,-"Q

C

5 . 3

5 9

* u n'?

~ Q ( D Q C Q 3 S

pz

gS

a

g a ~ e 9

,g E*; " 0 _-.

ZS. 2.

3 q p *

3 Q

E e g s

s ! = S Q

g 9 3

5 k 2

5 2 8

n

g s

Q

9

3

5

_g!J

5

-.

g g

2. = s

Q ;.

2

p

.= 3 %! &

P 3 5

$

k g

XT

Z e

w _n

;&

u

5 3 9

"Bergey's adalah koloni kmarna m d

(M)

dm koloni be- putih (P), bentuk koloni adalah bulat, Gram positic bentuk batang, mesofit, katalase dm sitrat psi* fkmentasi gula positif', hidmlisis gelatin, casein d m pati positif juga hidup dalam Nutien Brotl~ dengan pH 5.7-6.8. Badasarkan h a d di atas isolat P dan isolat M tergolong dalarn genus "Baccillus". Hasil PCR gen 16 S rRNA isolat P dm M mempuayai kesamaan kandungan basa yaitu sekitar 1088 bp, demilriaa juga dengan isolat A, 3 yang be& dari kotoran sapi. Hasil PCR gen maA pa& isolat

P, M

dan blat A, B mempunyai kesamaan kandungan basa

yaitu s e e 600bp. 8 e r m Sequensing amplifhsi gen 16s rRNA isolat P mmgbsilkan nukieotida dengin komposisi : G 31.25 %, C 20.58 %, A 27.1 1 %

dan

T

21.04 YO, sedan- isolat M komposisinya : G 3 1.34 %, C 20.3 2 %, A

27.02 %

dan

T

21.32 O/b. Zdentifikasi iwlat M sama den- C~Ios~ridium @mbu.ficwn (100 %) dm iisolat

P

hampir sama dengan Clostridium t y m ~ t i i c u m (99 %). Plasmid isolat P berdasarkan hasit PCR mengandung gen

mcrA dengan jumIah h a s e k h ₆₀₀_bp. _{Transformasi plasmid}_{isolat P}

ke

dalam E. coli

C600

menghash 8. coli tmnsforman yang dapat memproduksi gas metan setalah 3

hai

fewenbsi, lebih cepat 5 hari dari isolat

P.

(4)

rJ d

g a p E ABSTRACT

ARDl

KAPAHANG. Transk of Metanogenic Bacteria Plasnlid &om the Soil

Piace Sewage of Cownut Water to E. coli (300 to Produce Metan Biogas. Under the &redion of MARIA BINTANG

as

Head of C o d s i o n and MANSJUR HAWAB, DUD1 DJUHDLA SASTRAATMADJA and DEDY DURYADl SOLIHIN as members of Commision.

Bacteria are microbes which have an ability to live wherever there is a Life. Some of the bacteria are saprophyte and some are parasitic. But most of the

bacteria

have

not been identified or

cultnred;

therefore the benefits are still unknown. Methanogenic bacteria ire one ofthe saprophyte bacteria. This bacteria

% 2 5

=

produces methane, a biogas as an alternative

fUeI

in the W e . Most of ~ E . Q

Q s s r c

g

y

&

metfianogeoic bacteria are uncultured, however a few of them are f o d in the b t D Q c Q s S

r z

&S

2

$

sewage of cocanut water.

We

have excess coconut water in Indonesia, especially

(D s B

-

Q

G

in North Sulawesi area and most of the coconut water turned out to be sewage.

W C Q r c s

8 E*g

" 0 _-.

5 . 2.

2

The

savage of cocanut water is easily kmented because it confains organic

s s p *

3 Q 3i' substance which besleM in the growth and development of microbes, especially

#=EL;

c " E Q thebacteria

3 3

=

The

purpose of tfds research

is

to isolate and characterize,

and

also to

5 k 2 3 cn isolate and identify the metanogenic bacteria DNA that lives in the sewage of 5 2 8 c.

-

r

g z

coconut water, which then compared to the metamgenic bacteria in the cow's

3

9 3

f-; to isolate and to transl7onn the plasmid of metamgenic bacteria to E. coli

*

iT$

3

C600

a d

to identify the metan product &oxn E. coli transforman

C

$ a PI

-.

2. , 9 2.

This

rescan% of the

m

&

fixmentation, analysis of characteristic, and

Q

i.

2

metisnogenic bacteria idedfication The first step is the isolation of Metanogenic

$

'0

.=

0

$

bacteria from the sewage of coconut water with famentation. The samples are 0- fi-om four places

in

Minahasa, which are Rasi (I), Koka (lI),

Amarang

(HI) and

(D 0

$

i g

"

Lola (N) and one place in Bogor

0.

The second step is the analyze of metan gas

r

Q Z E prodaction with three method, which are the burning for analyzing the quality,

w 0

c s

Gas Chromatography

(GC)

Em

analyzing the quantity and &rgty's method for

%

8 %

anaIy;cing the bacteia that has beeo able to charactesize. The third step is the

$

-9

identification by DNA isohtion, the DNA amplification with PCR using specific

8.

S

prohyote primer 16s rRNA wfiich is 63F (5'-CAG

GCC

TAA CAC ATG CAA

2

L GTC-3') and 1387R (5'-

CGG

WGT GTA CAA GGC-3') and specific B

$'

rnetanogenic primer mcrA which are F (5'-GGT

GGT

GTM GGA 'ITC ACA

"

3

"

CAR

TAY GCW ACA GC-3') and

R

(5'-TTC ATT

GCR

TAG TIW

GGR

TAG

r IT-3'), imd next the DNA sequencing is anatyzed by BioEdit Sequence

2

Q

c Alignment and the analysis of phylogenic using the MEGA program version 3.1.

"

s

*

The isolate of metanogenic baa& fkom cow's f- (positive umtrol) gaimd by -.

Q

E the isolation and identification of the

first

and tbird step. The fourth step is the

9

t r a m f o d m of isolate P plasmid to E. coli C600 using "Blind Test" method

.

E

>

_{The fifth}_{step, fermentation ofcoconut water by}E. coli transforman that yield gas

3

was quali~y-analy~ed by lxlming and guanti~y-analyzed by

GC.

3 1.

t! 0 The m l t of &is research are: Largest metan gas was produced from the

g

samples fiom Rasi (I) and Amurang ('HI), The bacteria's specification according

s _{to the Bergey's method}_are_redcoloured_colony

(M)

_{and whitecoloured colony}

f

p),

the shape of the colony is round, Grum p s i l i v e , b a d shape, mssofi1e,

(5)

starch hydrolysis positive also live in the Nutrien Broth with pH 5.7-6.8. According to these results, isolate P

and

isolate

M

are in the 'Badus' category.

The result of gen 16 S rRNA analysis by PCR, there is a h i l a r i t y of nucleotide around 1088bp, which is the same as isolate A and B fiom cow's feces. The result of s n mcrA's

PCR

on

isolate

P, M

and

isolate A

and

B have the similarity of nucieotide which is around 600bp. The

sequencing

of gen 16s rRNA isolate P yielded nucleotide with the composition: G 3 1.2596, C 20.58%/6, A 27.1 1% and T 21.04% while the isolate M with the composition: G 31.34% C 20.31% A 27.02% and T 21 -32%- The identification of isolate

M

is similar with Clostridiurn @obu&ricum (100%) and isolate

P is

almost similar with Clostridium tyrobuty&um (99%). The plasmid of i s o b

P

is accord'ig to the PCR result contains mcrA gen witSl nucleotide amount of 600bp. The transformation of pl-d isolate P to E. coii C600 yielded E. colz transfonnan which able to yield metan gas after

three

days of fixinentation, faster than isolate P wbich

produce

the

gas &r eight days.

Keywords: Bacteria, Metan,

Coconut

Water.

g

-9

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

(19)

(20)

(21)

(22)

(23)

(24)

(25)

(26)

(27)

(28)

(29)

(30)

(31)

(32)

(33)

(34)

(35)

(36)

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

(42)

(43)

(44)

(45)

(46)

(47)

(48)

(49)

(50)

(51)

(52)

(53)

(54)

(55)

(56)

(57)

(58)

(59)

(60)

(61)

(62)

(63)

(64)

(65)

(66)

(67)

(68)

(69)

(70)

(71)

(72)

(73)

(74)

(75)

(76)

(77)

(78)

(79)

(80)

(81)

(82)

(83)

(84)

(85)

(86)

(87)

(88)

(89)

(90)

(91)

(92)

(93)

(94)

(95)

(96)

(97)

(98)

(99)

(100)

(101)

(102)

(103)

(104)

(105)

(106)

(107)

(108)

(109)

(110)

(111)

(112)

(113)

(114)

(115)

(116)

(117)

(118)

(119)

(120)

(121)

(122)

(123)

(124)

(125)

(126)

(127)

(128)

(129)

(130)

(131)

(132)

(133)

(134)

(135)

(136)

(137)

(138)

(139)

(140)

(141)

(142)

(143)

(144)

(145)

(146)

(147)

(148)

(149)

(150)

(151)

(152)

(153)

(154)

(155)

(156)

(157)

(158)

(159)

(160)

(161)

(162)

(163)

(164)

(165)

@ Hak cipta rnilik IPB (Institut Pertanian Bogor)

Bogor Agricultural University

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan dan menyebutkan sumber:

- a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.

(166)

rJ d

g a p E ABSTRAK

ARDl KAPAHANG. Tmsfer Plasnid Bakteri Metanogenik Asal Tanah Tempat Pembuangan Air Kelapa

ke

dalam E. coli C600 untuk Produksi Biogas Metan. Di bawah bimbingan MAFUA BINTANG sebagai Ketua Komisi dm MANSSUR HAWAB, DUD1 DJUHDLA SASTRAATMADJA dm DEDY DURYADI SOLIHiN sebagai Anggota Komisi.

Bakteri adalah mikroba yang dapat hidup di semua tempat dimma ada

kehidupan. Ada yang menguntmgkan, rnerugikan dan masih sebagian besar tidak diketahui manfinatnya karma belum diidentifikasi dm dikdtur. Bakteri metamgenik adalah salah satu bakteri yang menguntungkan. Bakteri ini

5

mauproduksi mtan yang w a d i p y u s u n utama biogas sebagai aItmtif bahan bakar di masa yang

akan

datang. K w a k a n bakteri metanogenik tidak bisa dikultur,

akan

tetapi beberap di autaranya dit-kan d a b tanah pcmbuangan limbpb air kelapa. Air kdapa di lndmesia Wususnya di Pmpinsi Sulawesi Utsra tadapat mliotpab dan pada urn-ya ma& meujadi limbah. 3 Q

Z

ltimbah air kelapa mudab terfi=rmentasi k m a magandung baharr-bahan orgaaik .m

EX

yang benosnfaat nomL pectmbuhan dan perkembmgan h b a tau[ama dari

3 3

5 k 2

3

cn golonganbakteri.

5 2 8 P rC T1@m pelitian ini adalah mengisoIasi

dm

mengkaeakterisasi serta

T

g z

Q

5

mengisolasi dan magid- DNA bakteri m e t a n o g d yang hidup dalam 9 3

2

_taoah_tempt_{pmbmgan limbah}_{air Icelapa}_{s e 1 a n . a}_dihdingkan_dmgm

'

C

_-.

Z P

3

2

W metanogenik dari dalam kotoran =pi; mengis01asi dan menhmsf~rmasi

2. , 9

i.

plasmid bakteri metanogenik ke dalam E. coli C600 dan mengidentifikasi p d u k

Q

i.

2

'

metaa dari E. coli forma an.

$

.=

m 0

'0 0 (L1 Penelitian ini

&lakukan

dengan metode fmentasi, andisis, kamkterisasi

5T

$ $

4

dan identifikasi bakteri metmogenik serta transfer plasmid. Tahap ~~IIIUIM,

$

$$

-

bakteri metanogeaik diisolasi dari tanah terngat pembuangau limbah

air

kelapa

T

Q Z E

-0 dengan fennentasi. Sam@ diambil dari empat tempat di Minahasa, yaitu: Rasi

0

c s

(I), Kdra (I[), Ammug (110 dm Lola (IV)

dan

satu dari pasar B o p

(V).

Tahap

p

8 3 kedua, produksi gas metan dari feamentasi dianalisis secara kualitatif den-

$

-9 membakmya dm secara W t a t i f dengan Kromatografi

Gas

(KG)

dan

Weri

8.

3

ymg didapat ddmakterisasi dengan metode Bergey's. Tahap ketiga adalah L identifikasi dengan jdan isolasi DNA, amplifikasi DNA dengao

PCR

B

$

Ia

z

menggunakan primer spesi6k prokariot 16s rRNA yaitu 63F (S-CAG GCC TAA

CAC ATG CAA GTC-3" d i ~ ~ 1387R (5'-CiGG CGG WGT GTA CAA GGC-3')

T _dan_primer_spesifik_metauogedc_(~naA)_yaihi _{F (5'-GGT GGT GTM}_GGA_T'TC

#

s ACA CAR TAY GCW ACA OC3')

dsn

R

(5'-TTC ATT GCR TAG TiW GGR

e

s

-. _Q

0

TAG TT-37, sehjutnya sequencing DNA dianalisis dengan BioEdit Sequence

E Aligment dan anelisis filogeni menggunakan program

MEGA

vasi 3.1. Isolat

9

E bakteri metanogenik dari kotoran sapi (kontrol positip) diperoleh seperti p m

3

isolasi dan iaentifdentifbsi pada tahq pertama dm tahap ke t i p Tahap ke empat 3

"

1. adalah tnuufbranasi plasmid isolat

P

ke E. cofi C600 menggunakan metode "Blint

t! 0

Test".

Tahap ke l i i fwmatasi air kelapa oleh E. coli transforman. yang

E

s menimbulkan gas dianailsis s e ~ a r a kualitatif dengan membakarnya dan

secara

ktmntitatif dengan KG

7 Hasil peditiau, smber isolat yang manproduksi gas metan terbanyak

dm stabil berasal dari Rasi (I) dan A m m g (In). Ciri-ciri W e i mnuut metode

(167)

" x p !

l a a a

; & & 3 =

, m X X m ~

* s s a

$ E g g "

-2

"s

5 3

g o

;%SIRRE

~

h

$

h

3 g n o ( D * S

= ' u Q p .

2 n m Z c 3%&,

Z J ~ S Q

_,,-"Q

C

5 . 3

5 9

* u n'?

~ Q ( D Q C Q 3 S

pz

gS

a

g a ~ e 9

,g E*; " 0 _-.

ZS. 2.

3 q p *

3 Q

E e g s

s ! = S Q

g 9 3

5 k 2

5 2 8

n

g s

Q

9

3

5

_g!J

5

-.

g g

2. = s

Q ;.

2

p

.= 3 %! &

P 3 5

$

k g

XT

Z e

w _n

;&

u

5 3 9

"Bergey's adalah koloni kmarna m d

(M)

dm koloni be- putih (P), bentuk koloni adalah bulat, Gram positic bentuk batang, mesofit, katalase dm sitrat psi* fkmentasi gula positif', hidmlisis gelatin, casein d m pati positif juga hidup dalam Nutien Brotl~ dengan pH 5.7-6.8. Badasarkan h a d di atas isolat P dan isolat M tergolong dalarn genus "Baccillus". Hasil PCR gen 16 S rRNA isolat P dm M mempuayai kesamaan kandungan basa yaitu sekitar 1088 bp, demilriaa juga dengan isolat A, 3 yang be& dari kotoran sapi. Hasil PCR gen maA pa& isolat

P, M

dan blat A, B mempunyai kesamaan kandungan basa

yaitu s e e 600bp. 8 e r m Sequensing amplifhsi gen 16s rRNA isolat P mmgbsilkan nukieotida dengin komposisi : G 31.25 %, C 20.58 %, A 27.1 1 %

dan

T

21.04 YO, sedan- isolat M komposisinya : G 3 1.34 %, C 20.3 2 %, A

27.02 %

dan

T

21.32 O/b. Zdentifikasi iwlat M sama den- C~Ios~ridium @mbu.ficwn (100 %) dm iisolat

P

hampir sama dengan Clostridium t y m ~ t i i c u m (99 %). Plasmid isolat P berdasarkan hasit PCR mengandung gen

mcrA dengan jumIah h a s e k h ₆₀₀_bp. _{Transformasi plasmid}_{isolat P}

ke

dalam E. coli

C600

menghash 8. coli tmnsforman yang dapat memproduksi gas metan setalah 3

hai

fewenbsi, lebih cepat 5 hari dari isolat

P.

(168)

rJ d

g a p E ABSTRACT

ARDl

KAPAHANG. Transk of Metanogenic Bacteria Plasnlid &om the Soil

Piace Sewage of Cownut Water to E. coli (300 to Produce Metan Biogas. Under the &redion of MARIA BINTANG

as

Head of C o d s i o n and MANSJUR HAWAB, DUD1 DJUHDLA SASTRAATMADJA and DEDY DURYADl SOLIHIN as members of Commision.

Bacteria are microbes which have an ability to live wherever there is a Life. Some of the bacteria are saprophyte and some are parasitic. But most of the

bacteria

have

not been identified or

cultnred;

therefore the benefits are still unknown. Methanogenic bacteria ire one ofthe saprophyte bacteria. This bacteria

% 2 5

=

produces methane, a biogas as an alternative

fUeI

in the W e . Most of ~ E . Q

Q s s r c

g

y

&

metfianogeoic bacteria are uncultured, however a few of them are f o d in the b t D Q c Q s S

r z

&S

2

$

sewage of cocanut water.

We

have excess coconut water in Indonesia, especially

(D s B

-

Q

G

in North Sulawesi area and most of the coconut water turned out to be sewage.

W C Q r c s

8 E*g

" 0 _-.

5 . 2.

2

The

savage of cocanut water is easily kmented because it confains organic

s s p *

3 Q 3i' substance which besleM in the growth and development of microbes, especially

#=EL;

c " E Q thebacteria

3 3

=

The

purpose of tfds research

is

to isolate and characterize,

and

also to

5 k 2 3 cn isolate and identify the metanogenic bacteria DNA that lives in the sewage of 5 2 8 c.

-

r

g z

coconut water, which then compared to the metamgenic bacteria in the cow's

3

9 3

f-; to isolate and to transl7onn the plasmid of metamgenic bacteria to E. coli

*

iT$

3

C600

a d

to identify the metan product &oxn E. coli transforman

C

$ a PI

-.

2. , 9 2.

This

rescan% of the

m

&

fixmentation, analysis of characteristic, and

Q

i.

2

metisnogenic bacteria idedfication The first step is the isolation of Metanogenic

$

'0

.=

0

$

bacteria from the sewage of coconut water with famentation. The samples are 0- fi-om four places

in

Minahasa, which are Rasi (I), Koka (lI),

Amarang

(HI) and

(D 0

$

i g

"

Lola (N) and one place in Bogor

0.

The second step is the analyze of metan gas

r

Q Z E prodaction with three method, which are the burning for analyzing the quality,

w 0

c s

Gas Chromatography

(GC)

Em

analyzing the quantity and &rgty's method for

%

8 %

anaIy;cing the bacteia that has beeo able to charactesize. The third step is the

$

-9

identification by DNA isohtion, the DNA amplification with PCR using specific

8.

S

prohyote primer 16s rRNA wfiich is 63F (5'-CAG

GCC

TAA CAC ATG CAA

2

L GTC-3') and 1387R (5'-

CGG

WGT GTA CAA GGC-3') and specific B

$'

rnetanogenic primer mcrA which are F (5'-GGT

GGT

GTM GGA 'ITC ACA

"

3

"

CAR

TAY GCW ACA GC-3') and

R

(5'-TTC ATT

GCR

TAG TIW

GGR

TAG

r IT-3'), imd next the DNA sequencing is anatyzed by BioEdit Sequence

2

Q

c Alignment and the analysis of phylogenic using the MEGA program version 3.1.

"

s

*

The isolate of metanogenic baa& fkom cow's f- (positive umtrol) gaimd by -.

Q

E the isolation and identification of the

first

and tbird step. The fourth step is the

9

t r a m f o d m of isolate P plasmid to E. coli C600 using "Blind Test" method

.

E

>

_{The fifth}_{step, fermentation ofcoconut water by}E. coli transforman that yield gas

3

was quali~y-analy~ed by lxlming and guanti~y-analyzed by

GC.

3 1.

t! 0 The m l t of &is research are: Largest metan gas was produced from the

g

samples fiom Rasi (I) and Amurang ('HI), The bacteria's specification according

s _{to the Bergey's method}_are_redcoloured_colony

(M)

_{and whitecoloured colony}

f

p),

the shape of the colony is round, Grum p s i l i v e , b a d shape, mssofi1e,

(169)

starch hydrolysis positive also live in the Nutrien Broth with pH 5.7-6.8. According to these results, isolate P

and

isolate

M

are in the 'Badus' category.

The result of gen 16 S rRNA analysis by PCR, there is a h i l a r i t y of nucleotide around 1088bp, which is the same as isolate A and B fiom cow's feces. The result of s n mcrA's

PCR

on

isolate

P, M

and

isolate A

and

B have the similarity of nucieotide which is around 600bp. The

sequencing

of gen 16s rRNA isolate P yielded nucleotide with the composition: G 3 1.2596, C 20.58%/6, A 27.1 1% and T 21.04% while the isolate M with the composition: G 31.34% C 20.31% A 27.02% and T 21 -32%- The identification of isolate

M

is similar with Clostridiurn @obu&ricum (100%) and isolate

P is

almost similar with Clostridium tyrobuty&um (99%). The plasmid of i s o b

P

is accord'ig to the PCR result contains mcrA gen witSl nucleotide amount of 600bp. The transformation of pl-d isolate P to E. coii C600 yielded E. colz transfonnan which able to yield metan gas after

three

days of fixinentation, faster than isolate P wbich

produce

the

gas &r eight days.

Keywords: Bacteria, Metan,

Coconut

Water.

g

-9

(170)

(171)

(172)

(173)

(174)

(175)

(176)

(177)

(178)

(179)

(180)

(181)

(182)

(183)

(184)

(185)

(186)

(187)

(188)

(189)

(190)

(191)

(192)

(193)

(194)

(195)

(196)

(197)

(198)

(199)

(200)