Potential of Kaempferol Soursop Leaves as Inhibitor Raji Cancer Cell Proliferation

         

POTENSI

 

KAEMPFEROL

 

DAUN

 

SIRSAK

 

SEBAGAI 

PENGHAMBAT

 

PROLIFERASI

 

SEL

 

KANKER

 

RAJI 

                           

BAIQ

 

AYU

 

APRILIA

 

MUSTARIANI 

                                               

SEKOLAH

 

PASCASARJANA 

INSTITUT

 

PERTANIAN

 

BOGOR 

BOGOR 

2011 

         

   

PERNYATAAN

 

MENGENAI

 

TESIS

 

DAN

 

SUMBER

 

INFORMASI 

   

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Potensi Kaempferol Daun Sirsak  sebagai Penghambat Proliferasi Sel Kanker Raji adalah karya saya dengan arahan  dari  komisi  pembimbing  dan  belum  diajukan  dalam  bentuk  apa  pun  kepada  perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya  yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam  teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini. 

   

Bogor,   Juli 2011   

   

 

ABSTRACT

 

   

BAIQ  AYU  A.  MUSTARIANI.  Potential  of  Kaempferol  Soursop  Leaves  as  Inhibitor  Raji  Cancer  Cell  Proliferation.  Under  direction  of  SUMINAR  S.  ACHMADI, IRMA H. SUPARTO, and SILMI MARIYA. 

 

Leaves of soursop (Annona muricata) has been widely studied, particularly  as anti-cancer, but research on flavonoids as anticancer partion isolated from the  leaves of the soursop has not been found. Therefore, the purpose of this study is to  determine the effectiveness of flavonoids isolated from leaves of the soursop in  inhibiting cancer cell proliferation using Raji cells (ATCC CCL-86), Extraction  was done by maceration technique using successive solvents, i.e.  n-hexane,  CH2Cl2 and MeOH-H2O. Separation of active extract used preparative thin layer  chromatography. Methanolic activity assay extract was performed on normal cells  to  determination  initial  concentration  on  cancer  cells  showed,  that  the  lowest  inhibition was at concentrations of 1000 µg mL-1 − _500 µg mL-1 _{with percent}  inhibition 48% and 31%, respectively. The flavonoids produced a single spot on  thin layer chromatograph with Rf value of 0.87. Identification of flavonoids by  UV-Vis  spectrometer  and  high  performance  liquid  chromatography  confirmed  that the flavonoid was kaempferol. Kaempferol extract obtained wastested on Raji  cells and Vero cells. For Raji cells the methanolic extract inhibited 76% of the  cells at concentration of 250 µg mL-1 _{but for the normal cells it only inhibited}  20%. These results suggest that kaempferol from the soursop leaf can inhibit cell  proliferation of Raji cells but gives minimal toxic effect on Vero cells. 

 

Keywords: Annona muricata, flavonoids, kaempferol, cancer cell proliferation.   

                                                 

   

RINGKASAN

 

   

BAIQ  AYU  A.  MUSTARIANI.  Potensi  Kaempferol  Daun  Sirsak  sebagai  Penghambat   Proliferasi   Sel   Kanker   Raji.   Dibimbing   oleh   SUMINAR   S.  ACHMADI, IRMA H. SUPARTO, dan SILMI MARIYA. 

 

Sirsak  (Annona  muricata)  merupakan  salah  satu  tanaman  dari  famili  Annonaceae yang sangat potensial dalam mengobati penyakit kanker. Biji dan  daun sirsak sebagai antikanker secara empiris telah banyak digunakan, akan tetapi  senyawa yang lebih banyak diteliti sebagai agen antikanker pada sirsak adalah  senyawa asetogenin yang merupakan suatu poliketida, yaitu salah satu metabolit  sekunder dari famili Annonaceae. Penelitian tentang senyawa-senyawa lain dalam  tanaman ini yang diperkirakan aktif sebagai antikanker belum banyak ditelusuri di  antaranya  ialah  senyawa  flavonoid.  Beberapa  penelitian  melaporkan  bahwa  senyawa flavonoid dari genus sirsak memiliki aktivitas dalam menghambat sel  kanker. Senyawa flavonoid yang berpotensi menghambat sel kanker pada famili  Annonaceae di antaranya ialah kaempferol. Penelitian terhadap daun sirsak sendiri  lebih  banyak  dilaporkan  dalam  bentuk  ekstrak  kasarnya  sehingga  masih  perlu  dilakukan penelusuran lebih lanjut tentang aktivitas senyawa flavonoid dari daun  sirsak dengan menguji pada sel kanker. Oleh sebab itu tujuan penelitian ini ialah  ingin mengisolasi potensi senyawa flavonoid kaempferol dari daun sirsak yang  berpotensi  sebagai  antikanker  dengan  menguji  efektivitas  isolat  flavonoid  dari  daun sirsak dalam menghambat pertumbuhan sel kanker Raji. 

Metode isolasi flavonoid dari daun sirsak terdiri atas beberapa tahap, yaitu  pemilihan tumbuhan dan subjek uji, penentuan kadar air, uji flavonoid, ekstraksi  flavonoid  kaempferol,  pemilihan   eluen   terbaik,  fraksinasi  menggunakan  kromatografi  lapis  tipis  preparatif,  dan  uji  aktivitas  penghambatan  proliferasi  terhadap sel Vero (ATCC CCl-81) dan sel Raji (ATCC CCL 86). 

Kandungan  flavonoid  ditentukan  dalam  serbuk  daun  dan  dalam  ekstrak  kasar daun. Berdasarkan uji fitokimia secara kualitatif, serbuk daun dan ekstrak  kasar  daun  sirsak  positif  mengandung  flavonoid.  Proses  ekstraksi  senyawa  flavonoid dilakukan dengan metode maserasi dengan n-heksana dan metanol yang  dilanjutkan dengan partisi menggunakan diklorometana dan campuran metanol  air. Dari hasil ekstraksi ini diperoleh rendemen sebesar 10.62%. Ekstrak kasar  diujikan terlebih dahulu pada sel Vero untuk menentukan konsentrasi yang tepat  guna diujicobakan pada sel kanker yang tidak merusak sel normal. Berdasarkan  hasil pengujian ekstrak kasar, ekstrak hasil fraksinasi daun sirsak yang diujikan  adalah di bawah 500 µg mL-1 _{agar tidak menghambat proliferasi sel normal.} 

Pemilihan  eluen  terbaik  untuk  mengisolasi  senyawa  kaempferol  menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dan diperoleh spot tunggal dengan  eluen  HCO2H-H2O-MeOH.  Ekstrak  kasar  selanjutnya  dihidrolisis  dengan  HCl  untuk   melepaskan   ikan   glikosida   yang   terikat   dengan   flavonoid   menjadi  aglikonnya. Dari 5 g ekstrak kasar metanol yang dihidrolisis diperoleh rendemen  sebesar  34.61%.  Ekstrak  kasar  dipisahkan  melalui  kromatografi  lapis  tipis  preparatif (KLTP) menggunakan eluen dari hasil KLT. Hasil pemisahan dengan  KLTP  selanjutnya  diuapkan  hingga  pekat  dan  diperoleh  rendemen  sebesar  23.45%.  Hasil  identifikasi  dengan  spektrometer  UV-Vis  menunjukkan  satu   

 

puncak   serapan   maksimum   di   daerah   panjang   gelombang   250-280   nm.  Kaempferol merupakan salah satu jenis dari aglikon flavonoid flavonol. Aglikon  flavonoid,   yaitu   flavonol,   teridentifikasi   pada   serapan   di   daerah   panjang  gelombang 250-280 nm. Spektrum kromatografi cair kinerja tinggi menguatkan  bahwa senyawa yang dihasilkan merupakan senyawa kaempferol dengan waktu  retensi  yang  hampir  sama  antara  waktu  retensi  kaempferol  standar  dengan  kaempferol dari ekstrak hasil KLTP (kromatografi lapis tipis preparatif). 

Dari hasil uji pada sel Vero, kaempferol sampai dengan konsentrasi 250 µg  mL-1 _{minimal menghambat proliferasi sel sebesar 19.77% sedangkan konsentrasi}  di  bawah  100  µg  mL-1  _{tidak  menunjukkan  penghambatan.  Akan  tetapi  pada}  konsentrasi 250 µg mL-1 _{terjadi peningkatan hambatan proliferasi sel Raji sampai}  76.36%. Data penghambatan sel kanker tersebut menunjukkan bahwa kaempferol  dari daun sirsak toksisitasnya kecil terhadap sel Vero dan memberi penghambatan  yang besar pada pertumbuhan sel kanker Raji. Berdasarkan hasil perhitungan nilai  IC50, hasil uji penghambatan terhadap sel Vero memperlihatkan bahwa ekstrak  kasar, baru dapat menghambat sel normal di atas 500 µg mL-1 _{dengan nilai IC50}  922.88 µg mL-1._{. Dari uji  kaempferol hasil fraksinasi dengan KLTP pada sel Vero}  dan sel Raji terlihat bahwa persen penghambatan pada sel kanker Raji lebih besar  daripada  sel  Vero  bahkan  pada  sel  Vero  dapat  dikatakan  tidak  memiliki  IC50  karena  pada  konsentrasi  250  µg  mL-1  _{ekstrak  kaempferol  hanya  menghambat}  proliferasi  sel  sebesar  19.77%.  Dengan  demikian  dapat  disimpulkan  bahwa  aktivitas ekstrak kaempferol terhadap sel hanya spesifik menghambat proliferasi  sel kanker Raji akan tetapi tidak menghambat proliferasi sel Vero. 

 

Kata kunci: Annona muricata, flavonoid, kaempferol, proliferasi sel kanker.   

                                                       

                                                 

©

 

Hak

 

Cipta

 

Milik

 

IPB,

 

tahun

 

2011 

Hak

 

Cipta

 

dilindungi

 

Undang-undang 

 

POTENSI

 

KAEMPFEROL

 

DAUN

 

SIRSAK

 

SEBAGAI

 

PENGHAMBAT

 

PROLIFERASI

 

SEL

 

KANKER

 

RAJI 

                               

BAIQ

 

AYU

 

APRILIA

 

MUSTARIANI 

                 

Tesis 

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar  Magister Sains pada 

Program Studi Kimia   

                         

SEKOLAH

 

PASCASARJANA 

INSTITUT

 

PERTANIAN

 

BOGOR 

BOGOR 

2011 

       

                                                         

 

HALAMAN

 

PENGESAHAN

 

 

Judul Tesis  :  Potensi  Kaempferol  Daun  Sirsak  sebagai  Penghambat  Proliferasi Sel Kanker Raji 

Nama  :  Baiq Ayu Aprilia Mustariani  NRP  :  G451090041 

Program Studi  :  Kimia   

       

Disetujui  Komisi Pembimbing   

       

Prof. Dr. Ir. Suminar S. Achmadi  Ketua 

         

 

Dr. dr. Irma H. Suparto, M.S  Silmi Mariya, S.Si, M.Si 

Anggota  Anggota 

       

Diketahui   

Ketua Program Studi  Dekan Sekolah Pascasarjana  Kimia 

         

Prof. Dr. Purwantiningsih Sugita, M.S  Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr.   

 

Tanggal Ujian: 14 Juli 2011  Tanggal Lulus:   

         

   

PRAKATA

 

     

Puji  dan  syukur  saya  panjatkan  ke  hadirat  Allah  SWT  atas  rahmat  dan  karunia-Nya  sehingga  karya  ilmiah  ini  dapat  diselesaikan.  Tema  yang  dipilih  dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember sampai Juni 2011 ini  ialah Potensi Kaempferol Daun Sirsak sebagai Penghambat Proliferasi Sel Kanker  Raji. 

Ucapan  terima  kasih  yang  tulus  kepada  Ibu  Prof.  Dr.  Ir.  Suminar  S.  Achmadi selaku Ketua Komisi Pembimbing, Ibu Dr. dr. Irma H. Suparto, M.S,  dan Ibu Silmi Mariya S.Si, M.Si selaku Anggota Komisi Pembimbing, atas segala  curahan  waktu,  bimbingan,  arahan,  serta  dorongan  moral  kepada  saya,  serta  kepada Ibu Dr. Laksmi Ambarsari, M.S. selaku penguji luar komisi yang telah  memberikan   banyak   saran   untuk   perbaikan   tesis   saya.   Di   samping   itu,  penghargaan penulis sampaikan pada Pusat Studi Satwa Primata Institut Pertanian  Bogor yang telah menyediakan sarana pengujian bahan. Ungkapan terima kasih  juga disampaikan kepada mamiq, mama serta seluruh keluarga, atas segala doa  dan kasih sayangnya serta kepada Kementerian Agama Republik Indonesia yang  telah  mendanai  pendidikan  penulis  selama  menjalani  Program  Pascasarjana  Kimia. 

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat   

 

Bogor, Juli 2011   

 

Baiq Ayu Aprilia Mustariani   

                                                 

 

RIWAYAT

 

HIDUP

 

   

Penulis dilahirkan di Darmaji pada tanggal 09 April 1984 dari pasangan  Bapak H. L. Mustajab AMa.Pd. dan Ibu Baiq Husnin AMa. Penulis merupakan  anak kedua dari dua bersaudara. 

Tahun 2002, penulis lulus dari MAN 2 Mataram dan pada tahun yang sama  lulus  seleksi  masuk  Universitas  Mataram  melalui  jalur  Seleksi  Penerimaan  Mahasiswa  Baru.  Pendidikan  sarjana  ditempuh  di  Program  Studi  Pendidikan  Kimia Universitas Mataram, lulus pada tahun 2007. Pada tahun 2009, penulis  mengikuti  seleksi  Beasiswa  Utusan  Daerah  (BUD)  yang  diselenggarakan  oleh  Kementerian Agama Republik Indonesia dan diterima di Program Studi Kimia  pada Program Pascasarjana IPB. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi  asisten mata kuliah Kimia Dasar pada tahun ajaran 2010/2011. 

                                                                                 

   

DAFTAR

 

ISI

 

   

Halaman 

DAFTAR TABEL ...xiv 

DAFTAR GAMBAR ...xiv 

DAFTAR LAMPIRAN ...xv 

PENDAHULUAN  ...1 

Latar Belakang ...1 

Tujuan Penelitian ...2 

Manfaat ...2 

BAHAN DAN METODE ...3 

Tempat Penelitian ...3 

Bahan Tumbuhan dan Subjek Uji ...3 

Penentuan Kadar Air  ...3 

Uji Flavonoid ...4 

Ekstraksi Flavonoid Kaempferol ...4 

Pemilihan Eluen Terbaik ...5 

Fraksionasi Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif ...5 

Uji Aktivitas Penghambatan Proliferasi terhadap Sel Vero dan Sel  Raji ...5 

  HASIL ...7 

Kadar Air ...7 

Kandungan Flavonoid ...7 

Ekstrak Flavonoid ...7 

Efektivitas Metanol Terhadap Proliferasi Sel Vero ...8 

Kaempferol Hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif ...8 

Identitas Flavonoid ...9 

Penghambatan Proliferasi Sel Vero dan Sel Raji ...11 

PEMBAHASAN ...15 

SIMPULAN DAN SARAN ...18 

DAFTAR PUSTAKA ...19 

LAMPIRAN ...21   

                   

 

DAFTAR

 

TABEL

 

   

Halaman  1  Penghambatan proliferasi ekstrak kasar daun sirsak terhadap sel 

Vero ...  ...  8   

2 

 

Nilai IC50  dari ekstrak kasar dan ekstrak keampferol terhadap sel  Vero dan Sel Raji ... 

    14   

         

DAFTAR

 

GAMBAR 

   

Halaman  1  Hasil uji fitokimia flavonoid pada serbuk daun dan ekstrak 

metanolik ...  7  2  Profil KLT eluen terbaik ekstrak kasar daun sirsak ...9 

3  Spektrum UV-Vis ekstrak daun sirsak dalam metanol ...        10  4  Kromatogram KCKT standar kaempferol dan ekstrak hasil KLTP ....10 

5  Kurva penghambatan proliferasi ekstrak hasil KLTP daun sirsak  terhadap sel Vero dan sel Raji ...11  6  Sel Raji tanpa pemberian ekstrak dan sel Raji yang diberi ekstrak 

kaempferol 250 µg mL-1 _...12  7  Sel Vero normal (kontrol) pada uji MTT dan sel Vero setelah 

pemberian ekstrak  ...12  8  Sel Raji normal (kontrol) pada uji  MTT dan sel Raji setelah 

pemberian ekstrak  ...  ...  13   

                         

   

DAFTAR

 

LAMPIRAN

 

     

Halaman 

1  Hasil determinasi tanaman sirsak ...21 

2  Bagan alir penelitian ...  22 

3  4  Bagan alir metode MTT ...         23 

Data hasil uji penghambatan ekstrak kasar terhadap sel Vero ...         24 

5  Kromatogram standar kaempferol pada konsentrasi 10 µg mL-1 _...25 

6  Kromatogram hasil KLTP daun sirsak ...26 

7  Penentuan kadar kaempferol dalam daun sirsak hasil KLTP  ...  8  Data hasil penghambatan flavonoid kaempferol dari daun sirsak  terhadap proliferasi sel Vero ...  27    28  9  Data hasil penghambatan flavonoid kempferol dari daun sirsak  terhadap proliferasi sel Raji ...39 

10   Gambar sel Vero ...30   

                                                             

 

PENDAHULUAN 

 

Latar Belakang 

 

Sirsak  (Annona  muricata)  merupakan  salah  satu  tanaman  famili  dari  Annonaceae yang sangat potensial dalam mengobati penyakit kanker. Biji dan  daun sirsak sebagai antikanker secara empiris telah banyak digunakan, akan tetapi  senyawa yang lebih banyak diteliti sebagai agen antikanker pada sirsak adalah  senyawa  annonaceous asetogenin yang merupakan suatu  poliketida, salah  satu  metabolit sekunder dari famili Annonaceae (Etcheverry et al.1994, Coloma et  al.  2002).   Penelitian   tentang   senyawa-senyawa   lain   dalam   tanaman   ini   yang  diperkirakan aktif sebagai antikanker belum banyak ditelusuri di antaranya ialah  senyawa flavonoid. 

Hasil penelitian Vega et al. (2007) menunjukkan bahwa golongan flavonoid  daun A. dioca, salah satu genus dari sirsak memiliki aktivitas dalam menghambat  pertumbuhan  sel  kanker  karsinoma  Ehrlich.  Hasil  ini  membuktikan  bahwa  senyawa flavonoid famili Annonaceae memiliki aktivitas farmakologis sebagai  antikanker.   Penelitian   yang   dilakukan   oleh   Santos   &   Salatino   (2000)  menunjukkan  bahwa  kandungan  golongan  flavonoid  daun  genus  Annona  di  antaranya adalah kuersetin dan kaempferol. Kedua senyawa ini diduga berpotensi  sebagai antikanker sebagaimana diindikasikan oleh Liu et al. (2005), Vega et al.  (2007), Yoshida et al. (2008),  dan, Luo et al. (2010). 

   

Tujuan Penelitian 

Penelitian ini bertujuan menguji efektivitas isolat flavonoid dari daun sirsak  dalam menghambat pertumbuhan sel kanker Raji secara in vitro. 

   

Manfaat Penelitian 

 

BAHAN DAN METODE 

   

Tempat Penelitian 

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Organik, Departemen Kimia,  Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahun Alam, Institut Pertanian Bogor (IPB).  Uji penghambatan proliferasi terhadap sel secara in vitro dilakukan di Pusat Studi  Satwa Primata (PSSP) IPB. 

   

Bahan Tumbuhan dan Subjek Uji 

Bahan yang digunakan adalah daun sirsak tua yang diperoleh dari kebun  Pusat  Studi  Biofarmaka  IPB.  Untuk  keperluan  identifikasi  tumbuhan,  sampel  dikirim   ke   Herbarium   Bogoriense,   Bogor.   Pada   tahap   awal   daun   sirsak  dibersihkan dengan air. Selanjutnya daun dikeringkan dalam oven dengan suhu  40 ºC selama 72 jam, lalu dijadikan serbuk untuk kemudian diekstraksi. Subjek uji  yang digunakan adalah penghambatan aktivitas sel Vero (ATCC CCL-81) dan sel  Raji (ATCC CCL-86). Kedua jenis sel ini diperoleh dari PSSP 

       

Penentuan Kadar Air 

Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105 °C dalam oven selama 30 menit,  kemudian didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Sebanyak 5 g serbuk daun  sirsak dimasukkan ke dalam cawan dan dipanaskan dalam oven pada suhu 105 °C  selama 3 jam, kemudian cawan diangkat dan didinginkan dalam eksikator selama  30  menit.  Cawan  dengan  sampel  ditimbang  hingga  diperoleh  bobot  konstan  (AOAC 2006). Persen kadar air dihitung dengan persamaan: 

 

% Kadar air =         100%   

Dengan: 

   

Uji Flavonoid 

Uji   kualitatif   flavonoid   dilakukan   mengacu   pada   Harborne   (1987).  Sebanyak  1  g  sampel  berupa  serbuk  kering  ditambahkan  10  mL  air  panas  kemudian  dididihkan  selama  5  menit  dan  disaring.  Sebanyak  10  mL  filtrat  ditambahkan  0.5  gram  serbuk  Mg,  1  mL  HCl  pekat,  dan  1  mL  amil  alkohol  kemudian  dikocok  dengan  kuat.  Uji  positif  ditandai  dengan  munculnya  warna  merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol. 

   

Ekstraksi Flavonoid Kaempferol 

Ekstraksi flavonoid  (Lampiran 1) mengacu pada Vega et al. (2007). Serbuk  daun sirsak kering diekstraksi dengan maserasi menggunakan pelarut n-heksana  dan  metanol.  Ekstraksi  diawali  dengan  menggunakan  pelarut  n-heksana  untuk  menghilangkan kandungan lemak, selanjutnya sampel disaring dan dipisahkan.  Ekstrak  n-heksana  dibuang  dan  residu  dari  hasil  maserasi  dengan  n-heksana  dikeringkan  dengan  diangin-anginkan  di  udara  terbuka.  Ekstraksi  dilanjutkan  dengan menggunakan pelarut metanol. Residu dari pelarut n-heksana dimaserasi  dengan metanol dan selanjutnya ekstrak metanol dipartisi dengan diklorometana  dan   campuran   metaol   air   dengan   nisbah   2:1   untuk   memberikan   fraksi  hidroalkohol   dan   diklorometana.   Fraksi   diklorometana   dibuang   dan   yang  digunakan adalah fraksi metanolik. Sebagian fraksi metanolik dipisahkan untuk  uji hayati dan uji flavonoid, dan sebagian lain dihidrolisis dengan HCl 1.8 N.  Larutan yang dihasilkan diekstraksi dengan amil alkohol. Selanjutnya fase organik  diambil dan dicuci dengan air sampai pH fase organik konstan. Hasil hidrolisis  diuapkan dengan penguap putar pada suhu 40 ºC dan dilakukan uji flavonoid dan  uji  penghambatannya  terhadap  sel  kanker.  Rendemen  ekstrak  dihitung  dengan  persamaan: 

% Rendemen ekstrak =  × 100 %   

dengan 

 

Pemilihan Eluen Terbaik 

Eluen   terbaik   untuk   mengisolasi   senyawa   kaempferol   dipilih   dengan  menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Pelat KLT yang digunakan adalah  jenis  silika  G60F254.  Ekstrak  pekat  ditotolkan  pada  pelat  KLT,  setelah  kering,  langsung  dielusi  dalam  ruang  elusi  yang  telah  dijenuhkan  oleh  uap  eluen  pengembang. Eluen yang digunakan yaitu HCO2H-H2O-MeOH. Noda hasil elusi  diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. 

   

Fraksionasi Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 

Ekstrak  metanol  hasil  hidrolisis  dipisahkan  dengan  menggunakan  kromatografi  lapis  tipis  preparatif  (KLTP).  Fraksi   yang  diperoleh  selanjutnya  dikerok,  dilarutkan,  dan  didekantasi  dengan  pelarut  awalnya,  yaitu  metanol,  kemudian  disaring  lalu  diuapkan.  Hasil  fraksinasi  dengan  KLTP  kemudian  diidentifikasi  kandungan  senyawa  flavonoidnya  dengan  spekrofotometer  kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan diuji aktivitas antikankernya pada sel  kanker secara in vitro. 

   

Uji aktivitas Penghambatan Proliferasi terhadap Sel Vero dan Sel Raji 

 

(Sigma, USA) sebanyak 10 µL/sumur selama 4 jam hingga terbentuk formazan  berwarna   ungu   pada   sel   hidup.   Selanjutnya   ditambahkan   HCl   ke   dalam  isopropanol 0.1 N sebanyak 100 µL/sumur kemudian diinkubasi kembali selama  10 menit dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer ELISA  reader  dengan  panjang  gelombang  595  nm.  Penghambatan  pertumbuhan  sel  kanker dihitung menggunakan rumus berikut: 

 

% penghambatan = Serapan kontrol – serapan  perlakuan 

Serapan kontrol  × 100 %   

Dari % penghambatan yang diperoleh selanjutnya ditentukan penghambatan  sel kanker dari setiap konsentrasi senyawa flavonoid yang diujikan dan ditentukan  aktivitas penghambatan yang terbesar dari senyawa flavonoid yang diperoleh.   

 

HASIL 

   

Kadar Air 

Kadar air sampel daun sirsak adalah, 5.24 %. Kadar air dalam suatu bahan yang  dapat mengurangi aktivitas mikrob 3-7%. Kadar air pada kisaran tersebut juga  lebih stabil dan terhindar dari enzim oksidasi. 

   

Kandungan Flavonoid 

Kandungan flavonoid ditentukan dalam dua tahap, yaitu pada serbuk daun  dan ekstrak metanolik daun. Berdasarkan uji flavonoid dengan uji fitokimia secara  kualitatif,  serbuk  daun  dan  ekstrak  metanolik  daun  sirsak  positif  mengandung  flavonoid. Secara kualitatif dapat dilihat dari intensitas warna ekstrak metanolik  dan  serbuk  yang  tidak  berbeda  dari  intensitas  warna  serbuk  daun.  Hal  ini  menunjukkan bahwa pelarut metanol yang telah dipartisi dengan diklorometana  dan air efektif dalam mengekstrak flavonoid dari daun sirsak. Intensitas warna  flavonoid yang terkandung dalam daun sirsak dapat dilihat pada Gambar 1.   

 

A  B 

             

Gambar 1  Hasil uji fitokimia flavonoid pada serbuk daun (A) dan ekstrak  metanol (B). 

   

Ekstrak Flavonoid 

   

Efektivitas Ekstrak Metanol terhadap Proliferasi sel Vero 

Ekstrak   metanolik   diujikan   terlebih   dahulu   pada   sel   normal.   Uji  pendahuluan ini dilakukan untuk menentukan konsentrasi yang diperlukan guna  diujicobakan pada sel kanker yang tidak merusak sel normal. 

Uji  pendahuluan  dari  ekstrak  metanolik  pada  sel  Vero  menggunakan  berbagai konsentrasi, mulai dari 25000 µg mL-1 _{sampai 500 µg mL}-1_. Hasilnya  dapat dilihat pada Tabel 1. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak semakin besar pula  penghambatannya  pada  proliferasi  sel  Vero.  Penghambatan  ekstrak  metanolik  daun sirsak menurun pada konsentrasi 1000 µg mL-1 _{dan 500 µg mL}-1 _dengan  penghambatan masing-masing 47.65% dan 31.49%. Berdasarkan hasil ini, ekstrak  hasil fraksinasi daun sirsak yang diujikan adalah di bawah 500 µg mL-1 _agar tidak  menghambat proliferasi sel normal. 

   

Tabel 1  Penghambatan proliferasi ekstrak kasar daun sirsak terhadap sel Vero.   

Konsentrasi ekstrak  µg mL-1 

  Rata-rata 

serapan 

 

% Penghambatan  proliferasi 

25000  0.032  80.37 

15000  0.037  77.1 

10000  0.033  79.96 

5000  0.042  74.03 

1500  0.046  71.98 

1000  0.085  47.65 

500  0.112  31.49 

   

Kaempferol Hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 

LT  A) 

T.  KT 

H,  Vis 

30  a  b 

  A 

  B 

                                 

 

Gambar 2   Profil KL   eluen terbaik ekstraak kasar dauun sirsak (A  menggunnakan  eluen HCCO2H:H2O:MeOH dan profil KLT setelah hidrolisis (B).   

 

Eksstrak  kasar  dipisahkann  menggunnakan  KLTPP  dengan  eluen  dari  hasil  KLT, yaittu HCO2H:H2O:MeOH untuk meemperoleh senyawa kaaempferol. Hasil  pemisahan  dengan  KLTP  selaanjutnya  diiuapkan  hinngga  pekat  dan  dipeeroleh  rendemen sebanyak 223.45%. 

   

Iddentitas Flaavonoid 

                                           

Gambar 3  Spektrum UV-Vis  ekstrak daun sirsak dalam metanol.   

 

Hasil analisis menunjukkan bahwa ekstrak yang diperoleh memiliki waktu  retensi yang hampir sama dengan standar kaempferol (≥ 90%) yang diperoleh dari  Sigma-Aldrich,   USA,   sehingga   diyakini   bahwa   senyawa   yang   diperoleh  merupakan senyawa kaempferol (Gambar 4). Gambar hasil KCKT menunjukkan  bahwa  waktu  retensi  yang  diperoleh  dari  ekstrak  hasil  KLTP  ialah  3.395  dan  standar kaempferol memiliki waktu retensi 3.384. 

A  B 

mV  DetectorACh2:370nm  45  40  35  mV  DetectorACh2:370nm  15.0    12.5  30  10.0  25  20  15  10  5  0  -5  -10 

0.0   0.5   1.0   1.5   2.0   2.5   3.0   3.5   4.0   4.5   5.0   5.5  min 

7.5    5.0    2.5    0.0   

0.0   0.5   1.0   1.5   2.0   2.5   3.0   3.5   4.0   4.5   5.0   5.5  min 

 

%Pengham

batan

 

 

Penghambatan Proliferasi sel Vero dan sel Raji 

Hasil  pemisahan  ekstrak  daun  sirsak  dengan  KLTP  diuji  daya  hambat  proliferasinya pada sel Vero dan Raji. Konsentrasi ekstrak yang digunakan ialah  3, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 125, dan 250 µg mL-1_{. Konsentrasi tertinggi pada 250}  µg mL-1 _{dipilih berdasarkan hasil} uji in vitro _{pada ekstrak kasar terhadap sel Vero.}  Hasil   pada   konsentrasi   tersebut   ialah   konsentrasi   tertinggi   yang   minimal  toksisitasnya terhadap sel Vero. 

   

100 

 

80 

 

60 

 

40 

 

20 

 

0 

  ‐20 

  ‐40 

           

0      50      100         150      200         250 

 

Konsentrasi (µg/mL) 

 

Sel Vero  Sel Raji 

 

 

Gambar  5  Kurva  penghambatan  proliferasi  ekstrak  hasil  KLTP  daun  sirsak  terhadap sel Raji (A) dan sel Vero (B). 

   

Dari  hasil  uji  pada  sel  Vero  (Gambar  5),  diperoleh  bahwa  kaempferol  sampai  dengan  konsentrasi  250  µg  mL-1  _{minimal  menghambat  proliferasi  sel}  sebesar  19.77%  sedangkan  konsentrasi  di  bawah  100  µg  mL-1  _tidak  ada  penghambatan. Akan tetapi, pada uji sel Raji pada konsentrasi di atas 100 µg mL-1  mengalami   peningkatan   hambatan   proliferasi   sampai   dengan   76.36%   pada  konsentrasi 250 µg mL-1 _. 

 

A  B 

                               

Gambar 6  Sel Raji tanpa pemberian ekstrak (A) dan sel Raji yang diberi ekstrak  kaempferol 250 µg mL-1 _{(B) (Perbesaran 8×10).} 

   

Berdasarkan hasil uji MTT, secara makroskopis (Gambar 7) pada sel Vero  menghasilkan  warna  ungu  yang  hampir sama  dengan  kontrol  sel  normal  yang  tidak diberi ekstrak. 

A  B 

                               

Gambar  7  Sel  Vero  (kontrol)  pada  uji  MTT  (A)  dan  sel  Vero  setelah  pemberian ekstrak (B). 

   

dibandingkan   dengan   kontrol,   namun   tidak   dapat   dihitung   berapa   jumlah  penurunan  sel  yang  mati,  karena  metode  MTT  tidak  dapat  digunakan  untuk  menghitung jumlah sel yang mati, hanya dapat menentukan persen penghambatan  saja. 

A  B 

                               

Gambar  8  Sel  Raji  (kontrol)  pada  uji  MTT  (A)  dan  sel  raji  setelah  pemberian ekstrak (B) (perbesaran 8×10). 

   

Berdasarkan hasil perhitungan nilai IC50, hasil uji penghambatan terhadap  sel Vero memperlihatkan bahwa ekstrak kasar baru dapat menghambat sel normal  di atas 500 µg mL-1 _{dengan nilai IC}50 _{922.88 µg mL}-1._{. Dari uji kaempferol hasil}  fraksinasi  dengan  KLTP  pada  sel  normal  dan  sel  kanker  Raji,  terlihat  bahwa  persen penghambatan pada sel kanker Raji lebih besar daripada sel Vero bahkan  pada sel Vero dapat dikatakan tidak memiliki IC50 karena pada konsentrasi 250 µg  mL-1 _{ekstrak kaempferol hanya menghambat proliferasi sel sebesar 19.77%.} 

 

Tabel 2. Nilai IC50 dari ekstrak kasar dan ekstrak kaempferol terhadap sel  Vero dan sel Raji 

Perlakuan  Persamaan garis  R2  _IC50  Ekstrak  metanolik  pada  sel 

Vero 

Ekstrak kaempferol pada sel  Vero 

Ekstrak kaempferol pada sel  Raji 

y=11.13 Ln x-25.99      0.759      922.86   

y=7.52 Ln x-29.04       0.763       -   

 

PEMBAHASAN 

   

Uji   fitokimia   pada   serbuk   daun   dan   ekstrak   daun   sirsak   bertujuan  mendeteksi keberadaan flavonoid pada sampel awal daun sirsak sebelum tahap  ekstraksi,  sedangkan  uji  pada  ekstrak  kasar  dilakukan  untuk  mengevaluasi  efektivitas pelarut dalam mengekstrak flavonoid. Hasil uji fitokimia flavonoid,  baik  serbuk  daun  maupun  ekstrak  metanol,  menyatakan  kandungan  flavonoid  pada  sampel,  hal  ini  sesuai  dengan  penelitian  Santos  &  Salatino  (2000)  yang  melaporkan 31 spesies dari famili Annonaceae memiliki kandungan flavonoid di  antaranya  adalah  kaempferol  dan  kuersetin.  Namun,  penelitian  Pathak  et  al.  (2010) melaporkan bahwa dari uji fitokimia tidak terdeteksi flavonoid dalam daun  sirsak. Perbedaan laporan ini kemungkinan disebabkan perbedaan tempat tumbuh  sehingga isolat yang dihasilkan juga berbeda-beda. 

Proses  ekstraksi  senyawa  flavonoid  dilakukan  dengan  metode  maserasi.  Ekstraksi  awal  dilakukan  dengan  pelarut  n-heksana  yang  bersifat  nonpolar.  Tujuan  penggunaan  pelarut  ini  adalah  untuk  menghilangkan  kandungan  lemak  yang ada dalam daun sirsak. Selain itu untuk memudahkan perolehan senyawa  flavonoid   yang   pada   umumnya   bersifat   polar.   Oleh   karena   itu   dengan  menggunakan  pelarut  n-heksana,  ekstrak  terbebas  dari  lemak.  Partisi  dengan  diklorometana  yang  bersifat  semipolar  dilakukan  untuk  memisahkan  senyawa-  senyawa  yang  bersifat  semipolar,  sedangkan  campuran  metanol-air  bertujuan  memperoleh senyawa flavonoid yang lebih banyak karena sebagian besar senyawa  flavonoid di alam ditemukan dalam bentuk glikosida, yaitu satu unit flavonoid  terikat  pada  suatu  gula.  Adanya  gula  yang  terikat  pada  flavonoid  cenderung  menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air, dengan demikian campuran  pelarut metanol dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk melarutkan  glikosida (Harborne 1987). 

 

senyawa yang dihasilkan merupakan senyawa kaempferol dengan waktu retensi  yang hampir sama antara waktu retensi kaempferol standar dengan kaempferol  dari ekstrak hasil KLTP. Bila dibandingkan dengan standar kaempferol dengan  konsentrasi 90%, hasil yang diperoleh sedikit sekitar 0.22 µg mL-1 _{dalam 10 µg}  mL-1  _{hasil  KLTP.  Penelitian}  Vega  et  al.  _{(2007)  tidak  melaporkan  rendemen,}  kaempferol namun dari dosis ekstrak kaempferol yang diberikan pada sel kanker  karsinoma  Erlich  dapat  diketahui,  kadar  kaempferol  sebanyak  0.022  µg  mL-1_.  Berdasarkan  perbandingan  perolehan  kaempferol  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  kaempferol yang diperoleh pada daun A.muricata lebih banyak daripada A. dioca. 

Berdasarkan pengamatan secara makroskopis, bentuk dan ukuran sel lebih  besar daripada sel normal. Kemungkinan senyawa kaempferol masuk ke dalam  mitokondria dari sel kanker dan merusak sel sehingga ukuran sel menjadi besar  yang menyebabkan sel menjadi mati. Dari Gambar 6 disimpulkan, kemungkinan  kematian   sel   terjadi   melalui   proses   nekrosis.   Nekrosis   merupakan   proses  kerusakan sel yang dapat ditandai dengan meningkatnya volume sel (Nursid et al.  2006). Sel yang mengalami nekrosis akan terlihat membengkak untuk kemudian  mengalami lisis. Nekrosis disebabkan oleh faktor eksternal di antaranya, yaitu  infeksi, toksiksitas, trauma sel, dan kematian prematur pada sel (Prasetyo 2008). 

Nilai IC50 akibat pemberian ekstrak kaempferol pada sel kanker Raji sangat  berbeda dengan ekstrak kaempferol hasil penelitian Vega et al. (2007) yang diuji  pada sel kanker karsinoma Erlich dengan IC50 0.022 µg mL-1_. IC50 _{pada sel kanker}  Raji sebesar 110.82 µgmL-1_. Nilai IC50 _ekstrak daun A. dioca _{yang diperoleh Vega}  et al. (2007), lebih rendah daripada ekstrak A.muricata yang berarti ekstrak daun  A.  dioca  lebih  toksik  dibandingkan  daun  sirsak.  Hal  tersebut  kemungkinan  disebabkan beberapa hal diantaranya karena perbedaan sel kanker yang diuji, dan  perbedaan sampel tanaman meskipun masih satu genus. Kemungkinan yang lain  juga  disebabkan  flavonoid  yang  dihasilkan  mempunyai  aktivitas  yang  berbeda  terhadap berbagai jenis sel kanker. 

   

SIMPULAN

 

DAN

 

SARAN 

   

Simpulan 

Berdasarkan  hasil  isolasi  senyawa  flavonoid  dari  daun  sirsak,  dikuatkan  dengan  spektrum  KCKT,  diperoleh  senyawa  flavonoid  kaempferol.  Ekstrak  kaempferol dari daun sirsak memiliki daya hambat proliferasi terhadap sel Raji  sekitar 76% pada konsentrasi 250 µg mL-1 _{dan pada sel Vero mendekati 20% pada}  konsentrasi yang sama. Kaempferol dari daun sirsak memberi efek toksik yang  kecil pada sel normal dibandingkan dengan sel kanker. 

   

Saran 

 

DAFTAR

 

PUSTAKA

   

   

Adewole SO, Ojewole JAO. 2009. Protective effects of Annona muricata Linn.  (Annonaceae) leaf aqueous extract on serum lipid profiles and oxidative  stress in hepatocytes of streptozotocin-treated diabetic rats. African Journal  Traditional CAM 6:30-41. 

 

[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2006. Official method   of 

analysis  of  the  association  of  official  analytical  chemist.  Edisi  ke-18. 

Washington DC: AOAC. 

 

Coloma AG, Guadano A, Ines CD, Diaz RM, Cortes D. 2002. Selective action of  acetogenin mitochondrial complex I inhibitors. Zeitschrift Für Naturforsh  57:1028-1034. 

 

De Sousa OV, Del-Vechio VD, Pinho JRG, Yamamoto CH, Alves MS. 2010.  Antinociceptive  and  anti-inflamatory  activities  of  the  ethanol  extract  of  Annona  muricata  L.  leaves  in  animal  models.  International  Journal  Molecules Science 11:2067-2078. 

 

Etcheverry  S,  Shapaz  S,  Fall  D,  Laurens  A,  Cave  A.  1994.  Annoglaucin,  an  acetogenin from Annona glauca. Phytochemistry 38:1423-1426. 

 

Harborne  JB.  1987.  Metode  Fitokimia:  Penuntun  cara  modern  menganalisis  tumbuhan.  Terbitan  ke-2.  K  Padmawinata  &  I  Soediro,  penerjemah;  Bandung: ITB. Terjemahan dari Phytochemical Methods. 

 

Kim  GS,  et  al.  1998.  Muricoreacin  and  murihexocin  C,  monotetrahydrofuran  acetogenins, from the leaves of Annona muricata. Phytochemstry 49:565-  571. 

 

Liu RH, Liu J, Chen B. 2005. Apples prevent mammary tumors in rats. Journal  Agriculture Food Chemistry 53:2342-2343. 

 

Luo  H,  Daddysman  M,  Rankin  GO,  Jiang  B,  Chen  YC.  2010.  Kaempferol  enhances cisplatin’s effect on ovarians cancer through promoting apoptosis  caused by down regulation of cMyc. Cancer Cell International 10:1-9.   

Markham   KR.   1988.   Cara   mengidentifikasi   flavonoid.   Padmawinata   K,  penerjemah. Bandung: ITB. 

 

Miller AL. 1996. Antioxidant flavonoids: structure, function, and clinical usage.  Alternative Medicine Review 1:103-111. 

 

 

Nursid  M,  Wikanta  T,  Fajarningsih  ND,  Marraskuranto  E.  2006.  Aktivitas  sitotoksik,  induksi  apoptosis,  dan  ekspresi  gen  p53  fraksi  metanol  spons  Petrosia  cf.nigricans  terhadap  sel  tumor  HeLa.  Jurnal  Pascapanen  dan  Bioteknologi Kelautan dan Perikanan 1:103-110. 

 

Olawale AD, Aderibigde KO, Stephen AO, Martins OE, Kehinde AT. 2009. Anti  hyperglycemic   activities   of   Annona   muricata   Linn.   African   Journal  Traditional CAM  6:62-69. 

 

Pathak P, Vora S, Savai J. 2010. In vitro antimicrobial activity and phytochemical  analysis of the leaves of Annona muricata. International Journal of Pharma  Reseach & Development 2:1-6. 

 

Presetyo  AA.  2008.  Beda  apoptosis  dan  nekrosis.  http://afie.staff.uns.ac.id/2008/12/25/beda-apoptosis-dan-nekrosis/. 

 

Sajuthi D. 2001. Ekstraksi, fraksinasi, dan uji hayati in vitro senyawa bioaktif  daun dewa (Gynura pseudochina (Linn.) DC.) sebagai antikanker, tahap II.  Buletin Kimia 1:75-79. 

 

Santos DYAC, Salatino MLF. 2000. Foliar flavonoids of annonaceae from Brazil:  taxonomic significance. Phytochemistry 55:567-573. 

 

Vega MRG, et al. 2007. Flavonoids from Annona dioica leaves and their effects  in  Erlich  carcinoma  cells,  DNA-topoisomerase  I  and  II.  Journal  Brazzil  Chemistry Society 18:1554-1559. 

 

Xiao ZP et al. 2006. Kaempferol and quercetin flavonoids from Rosa rugosa.  Chemistry of Natural Compounds 42:736-737. 

 

Wang Y et al. 2009. Screening antitumor compounds psoralen and isopsoralen  from Psoralea coryfolia L. seeds. eCAM Advance Access 1-7. 

 

Yoshida  T  et  al.  2008.  Kaempferol  sensitizes  colon  cancer  cells  to  TRAIL-  induceed apoptosis. Biochemistry Biophysics Commun 375:129-133.   

Lapisan MeOH : H2O   

Lampiran 2 Bagan alir penelitian 

Metode ekstraksi kaempferol (Vega et al. 2007)   

Serbuk daun sirsak   

 

dimaserasi (n-heksana); disaring              Ekstrak n-heksana              Residu   

CH2Cl2   

MeOH : H2O = 2 : 1   

 

 

diuji flavonoid  Lapisan CH2Cl2 

     

Fraksinasi KLTP, eluen  HCO2H-H2O-MeOH 

      Uji aktivitas penghambatan 

proliferasi pada sel normal             

Fraksi 1 

           

Fraksi 2       Fraksi n             

Uji flavonoid   

 

Identifikasi flavonoid UV, KCKT   

 

Lampiran 3  Bagan alir metode MTT   

Uji aktivitas antikanker menggunakan metode MTT (Wang et at. 2009)   

   

Penumbuhan sel   

     

Dinkubasi sel pada suhu 37 °C selama 24 jam   

     

Ditambah senyawa flavonoid dengan konsentrasi  3, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 125, 250 ppm   

     

Diinkubasi pada suhu 37 °C selama 48 jam   

     

+ 10 µL MTT 5   

     

Diinkubasi 37 °C selama  4   

     

+ 100 µL HCl 0,1 N dalam isopropanol 10%   

     

Diinkubasi selama 10 menit   

     

 

k t k ( L ) S

 

(b) ( b)/ %

Serapan 1  Serapan 2  Serapan 3  Rata-rata   

Lampiran 4  Data hasil uji penghambatan ekstrak kasar terhadap sel Vero    Konsentrasi      1    Serapan  2    Serapan  3    rata-rata      penghambatan  Kontrol sel 

25000  0.157  0.035  0.154  0.025  0.177  0.036  0.163  0.032  0  0.804  0  80.37  15000  0.029  0.047  0.036  0.037  0.771  77.10  10000  0.027  0.038  0.033  0.033  0.800  79.96  5000  0.031  0.058  0.038  0.042  0.740  74.03  1500  0.031  0.051  0.055  0.046  0.720  71.98  1000  0.048  0.072  0.136  0.085  0.476  47.65  500  0.062  0.109  0.164  0.112  0.315  31.49   

 

Kontrol sel   

 

(a)  0.157  0.154  0.177  0.163   

 

 

Contoh perhitungan % penghambatan sel   

% penghambatan = Rerata serapan kontrol sel-Rerata serapan sampel 

Rerata serapan kontrol sel  × 100 %   

 

=  (0.804-0.163)  0.804  = 80.37% 

K ae m pf er ol /3 .4 21 /7 89 45 8   K ae m pfer ol/ 3.3 84/ 790 638   K a em pf e rol /3 .4 21 /7 8 9 4 5 8  

Lampiran 5  Kromatogram standar kaempferol pada konsentrasi 10 µg mL-1   

mV 

45 Detector A Ch2:370nm 

40  35  30  25  20  15  10  5  0  -5   

0.0  0.5  1.0  1.5  2.0  2.5  3.0  3.5  4.0  4.5  5.0  5.5  min 

 

mV 

Detector A Ch2:370nm  45  40  35  30  25  20  15  10  5  0  -5  -10 

0.0  0.5  1.0  1.5  2.0  2.5  3.0  3.5  4.0  4.5  5.0  5.5  min 

 

mV 

45 Detector A Ch2:370nm 

40  35  30  25  20  15  10  5  0  -5   

Ka emp fe rol /3 .395 /171 37   Ka em pf er ol /3 .318 /170 47    

Lampiran 6  Kromatogram  hasil KLTP daun sirsak   

   

mV 

Detector A Ch2:370nm 

15.0    12.5    10.0    7.5    5.0    2.5    0.0   

0.0  0.5  1.0  1.5  2.0  2.5  3.0  3.5  4.0  4.5  5.0  5.5  min 

       

mV 

17.5 Detector A Ch2:370nm    15.0    12.5    10.0    7.5    5.0    2.5    0.0   

Lampiran 7  Penentuan kadar kaempferol dalam daun sirsak hasil KLTP dengan  metode KCKT 

 

A.  Standar kaempferol   

Ulangan  Waktu retensi  Luas puncak  Konsentrasi (%) 

1  3.421  789458  90 

2  3.384  790638  90.067 

3  3.421  789458  89.955 

Rerata  3.408  789851  90.007  % RSD  0.621  0.086  0.063   

 

B.  Ekstrak hasil KLTP   

Ulangan  Waktu retensi  Luas puncak  Konsentrasi (%) 

1  3.395  17137  1.953 

2  3.318  17047  1.942 

Rerata  3.357  17093  1.948   

 

( L ) S S

 

(b) ( b)/ %

 

Lampiran  8  Data  hasil  penghambatan  flavonoid  kaempferol  dari  daun  sirsak  terhadap proliferasi sel Vero 

 

Konsentrasi 

 

  1      2 

 

Serapan  3 

 

Rata-rata 

 

 

Penghambatan  Kontrol sel 

250 

0.119  0.047 

0.118  0.094 

0.115  0.14 

0.117  0.094 

0  0.198 

0  19.77  125  0.08  0.091  0.157  0.109  0.064  6.35  100  0.096  0.101  0.132  0.110  0.061  6.07  50  0.131  0.119  0.14  0.130  -0.113  -11.35  25  0.116  0.116  0.148  0.127  -0.085  -8.49  12.5  0.141  0.133  0.101  0.125  -0.071  -7.07  6.25  0.149  0.127  0.098  0.125  -0.068  -6.78  3  0.149  0.167  0.117  0.144  -0.236  -23.63   

   

Kontrol sel   

Serapan 1  Serapan 2  Serapan 3  Rata-rata (a)  0.119  0.118  0.115  0.117   

 

Contoh   perhitungan   %   penghambatan   sel   Vero   oleh   senyawa   falvonoid  kaempferol sama seperti perhitungan % penghambatan ekstrak kasar daun sirsak.   

 

 

( L ) S

 

(b) ( b)/b %

Lampiran  9  Data  hasil  penghambatan  flavonoid  kaempferol  dari  daun  sirsak  terhadap proliferasi sel Raji 

    Konsentrasi        1      Serapan  2      Serapan  3      Rata-rata        penghambatan  Kontrol  media  250  0.109  0.044  0.109  0.04  0.109  0.038  0.109  0.041  0  0.026  0  76.36  125  0.082  0.072  0.062  0.072  0.057  48.18  100  0.077  0.07  0.076  0.074  0.059  46.06  50  0.089  0.102  0.1  0.097  0.082  25.45  25  0.108  0.094  0.097  0.100  0.085  23.03  12.5  0.099  0.1  0.099  0.099  0.084  23.33  6.25  0.111  0.115  0.11  0.112  0.097  11.82  3  0.119  0.118  0.123  0.120  0.105  4.55   

     

Kontrol Media   

Serapan 1  Serapan 2  Serapan 3  Rata-rata (a)  0.109  0.109  0.109  0.109   

 

 

Contoh perhitungan % penghambatan sel   

% penghambatan = Rerata serapan kontol media-Rerata serapan sampel 

Serapan kontrol media  ×  100 %   

 

=  (0.109-0.026)  0.109  = 76.36% 

 

Lampiran 10 Gambar sel Vero (sel normal)   

                               

Sel Lestari Vero Normal   

                             

   

BAIQ AYU A. MUSTARIANI. Potential of Kaempferol Soursop Leaves as

Inhibitor Raji Cancer Cell Proliferation. Under direction of

SUMINAR S.

ACHMADI, IRMA H. SUPARTO, and SILMI MARIYA.

Leaves of soursop (

Annona muricata

) has been widely studied, particularly

as anti-cancer, but research on flavonoids as anticancer partion isolated from the

leaves of the soursop has not been found. Therefore, the purpose of this study is to

determine the effectiveness of flavonoids isolated from leaves of the soursop in

inhibiting cancer cell proliferation using Raji cells (ATCC CCL-86), Extraction

was done by maceration technique using successive solvents, i.e.

n

-hexane,

CH

2

Cl

2

and MeOH-H

2

O. Separation of active extract used preparative thin layer

chromatography. Methanolic activity assay extract was performed on normal cells

to determination initial concentration on cancer cells showed, that the lowest

inhibition was at concentrations of 1000 µg mL

-1

−

500 µg mL

-1

with percent

inhibition 48% and 31%, respectively. The flavonoids produced a single spot on

thin layer chromatograph with Rf value of 0.87. Identification of flavonoids by

UV-Vis spectrometer and high performance liquid chromatography confirmed

that the flavonoid was kaempferol. Kaempferol extract obtained wastested on Raji

cells and Vero cells. For Raji cells the methanolic extract inhibited 76% of the

cells at concentration of 250 µg mL

-1

but for the normal cells it only inhibited

20%. These results suggest that kaempferol from the soursop leaf can inhibit cell

proliferation of Raji cells but gives minimal toxic effect on Vero cells.

Latar Belakang

Sirsak (

Annona

muricata

) merupakan salah satu tanaman famili dari

Annonaceae yang sangat potensial dalam mengobati penyakit kanker. Biji dan

daun sirsak sebagai antikanker secara empiris telah banyak digunakan, akan tetapi

senyawa yang lebih banyak diteliti sebagai agen antikanker pada sirsak adalah

senyawa

annonaceous

asetogenin yang merupakan suatu poliketida, salah satu

metabolit sekunder dari famili Annonaceae (Etcheverry

et al.

1994, Coloma

et al.

2002). Penelitian tentang senyawa-senyawa lain dalam tanaman ini yang

diperkirakan aktif sebagai antikanker belum banyak ditelusuri di antaranya ialah

senyawa flavonoid.

Hasil penelitian Vega

et al

. (2007) menunjukkan bahwa golongan flavonoid

daun

A

.

dioca,

salah satu genus dari sirsak memiliki aktivitas dalam menghambat

pertumbuhan sel kanker karsinoma Ehrlich. Hasil ini membuktikan bahwa

senyawa flavonoid famili Annonaceae memiliki aktivitas farmakologis sebagai

antikanker. Penelitian yang dilakukan oleh Santos & Salatino (2000)

menunjukkan bahwa kandungan golongan flavonoid daun genus Annona di

antaranya adalah kuersetin dan kaempferol. Kedua senyawa ini diduga berpotensi

sebagai antikanker sebagaimana diindikasikan oleh Liu

et al.

(2005), Vega

et al

.

(2007), Yoshida

et al.

(2008), dan, Luo

et al.

(2010).

Penelitian ini bertujuan menguji efektivitas isolat flavonoid dari daun sirsak

dalam menghambat pertumbuhan sel kanker Raji secara

in vitro

.

Manfaat Penelitian

Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Organik, Departemen Kimia,

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahun Alam, Institut Pertanian Bogor (IPB).

Uji penghambatan proliferasi terhadap sel secara

in vitro

dilakukan di Pusat Studi

Satwa Primata (PSSP) IPB.

Bahan Tumbuhan dan Subjek Uji

Bahan yang digunakan adalah daun sirsak tua yang diperoleh dari kebun

Pusat Studi Biofarmaka IPB. Untuk keperluan identifikasi tumbuhan, sampel

dikirim ke Herbarium Bogoriense, Bogor. Pada tahap awal daun sirsak

dibersihkan dengan air. Selanjutnya daun dikeringkan dalam oven dengan suhu

40 ºC selama 72 jam, lalu dijadikan serbuk untuk kemudian diekstraksi. Subjek uji

yang digunakan adalah penghambatan aktivitas sel Vero (ATCC CCL-81) dan sel

Raji (ATCC CCL-86). Kedua jenis sel ini diperoleh dari PSSP

Penentuan Kadar Air

Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105 °C dalam oven selama 30 menit,

kemudian didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Sebanyak 5 g serbuk daun

sirsak dimasukkan ke dalam cawan dan dipanaskan dalam oven pada suhu 105 °C

selama 3 jam, kemudian cawan diangkat dan didinginkan dalam eksikator selama

30 menit. Cawan dengan sampel ditimbang hingga diperoleh bobot konstan

(AOAC 2006). Persen kadar air dihitung dengan persamaan:

% Kadar air =

×

100%

Dengan:

Uji kualitatif flavonoid dilakukan mengacu pada Harborne (1987).

Sebanyak 1 g sampel berupa serbuk kering ditambahkan 10 mL air panas

kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 10 mL filtrat

ditambahkan 0.5 gram serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol

kemudian dikocok dengan kuat. Uji positif ditandai dengan munculnya warna

merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol.

Ekstraksi Flavonoid Kaempferol

Ekstraksi flavonoid (Lampiran 1) mengacu pada Vega

et al

. (2007). Serbuk

daun sirsak kering diekstraksi dengan maserasi menggunakan pelarut

n

-heksana

dan metanol. Ekstraksi diawali dengan menggunakan pelarut

n

-heksana untuk

menghilangkan kandungan lemak, selanjutnya sampel disaring dan dipisahkan.

Ekstrak

n

-heksana dibuang dan residu dari hasil maserasi dengan

n

-heksana

dikeringkan dengan diangin-anginkan di udara terbuka. Ekstraksi dilanjutkan

dengan menggunakan pelarut metanol. Residu dari pelarut

n

-heksana dimaserasi

dengan metanol dan selanjutnya ekstrak metanol dipartisi dengan diklorometana

dan campuran metaol air dengan nisbah 2:1 untuk memberikan fraksi

hidroalkohol dan diklorometana. Fraksi diklorometana

dibuang dan yang

digunakan adalah fraksi metanolik. Sebagian fraksi metanolik dipisahkan untuk

uji hayati dan uji flavonoid, dan sebagian lain dihidrolisis dengan HCl 1.8 N.

Larutan yang dihasilkan diekstraksi dengan amil alkohol. Selanjutnya fase organik

diambil dan dicuci dengan air sampai pH fase organik konstan. Hasil hidrolisis

diuapkan dengan penguap putar pada suhu 40 ºC dan dilakukan uji flavonoid dan

uji penghambatannya terhadap sel kanker. Rendemen ekstrak dihitung dengan

persamaan:

% Rendemen ekstrak =

× 100 %

dengan

Eluen terbaik untuk mengisolasi senyawa kaempferol dipilih dengan

menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Pelat KLT yang digunakan adalah

jenis silika G

60

F

254

. Ekstrak pekat ditotolkan pada pelat KLT, setelah kering,

langsung dielusi dalam ruang elusi yang telah dijenuhkan oleh uap eluen

pengembang. Eluen yang digunakan yaitu HCO

2

H-H

2

O-MeOH. Noda hasil elusi

diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm.

Fraksionasi Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Ekstrak metanol hasil hidrolisis dipisahkan dengan menggunakan

kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP). Fraksi yang diperoleh selanjutnya

dikerok, dilarutkan, dan didekantasi dengan pelarut awalnya, yaitu metanol,

kemudian disaring lalu diuapkan. Hasil fraksinasi dengan KLTP kemudian

diidentifikasi kandungan senyawa flavonoidnya dengan spekrofotometer

kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan diuji aktivitas antikankernya pada sel

kanker secara

in vitro

.

Uji aktivitas Penghambatan Proliferasi terhadap Sel Vero dan Sel Raji

Uji aktivitas penghambatan kanker dari sel Raji dilakukan merujuk pada Sajuthi

(2001) dan Wang

et al

. (2009). Sel Vero dan sel Raji ditumbuhkan terlebih

dahulu. Media tumbuh yang digunakan ialah DMEM (Dulbecco’s Modified

Eagle’s Medium) untuk sel Vero dan RPMI (Roswell Park Memorial

Institute)-1640 untuk sel Raji dengan penambahan masing-masing 10% FBS dan 1%

penisilin-streptomisin. Sel didistribusikan ke dalam pelat kultur jaringan 96 sumur

dengan konsentrasi sel yang digunakan ialah 2×10

3

sel/mL per sumur. Selanjutnya

sel diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO

2

dengan konsentrasi 5% pada

berwarna ungu pada sel hidup. Selanjutnya ditambahkan HCl ke dalam

isopropanol 0.1 N sebanyak 100 µL/sumur kemudian diinkubasi kembali selama

10 menit dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer ELISA

reader

dengan panjang gelombang 595 nm. Penghambatan pertumbuhan sel

kanker dihitung menggunakan rumus berikut:

% penghambatan = Serapan kontrol – serapan perlakuan

× 100 %

× 100 %

Serapan

kontrol

Dari % penghambatan yang diperoleh selanjutnya ditentukan penghambatan

sel kanker dari setiap konsentrasi senyawa flavonoid yang diujikan dan ditentukan

aktivitas penghambatan yang terbesar dari senyawa flavonoid yang diperoleh.

Nilai IC

50

ditentukan dari grafik persen sel hidup vs log konsentrasi sampel

uji (Wang

et al.

2009). Nilai IC

50

ditentukan dengan menggunakan persamaan

Kadar Air

Kadar air sampel daun sirsak adalah, 5.24 %. Kadar air dalam suatu bahan yang

dapat mengurangi aktivitas mikrob 3-7%. Kadar air pada kisaran tersebut juga

lebih stabil dan terhindar dari enzim oksidasi.

Kandungan Flavonoid

Kandungan flavonoid ditentukan dalam dua tahap, yaitu pada serbuk daun

dan ekstrak metanolik daun. Berdasarkan uji flavonoid dengan uji fitokimia secara

kualitatif, serbuk daun dan ekstrak metanolik daun sirsak positif mengandung

flavonoid. Secara kualitatif dapat dilihat dari intensitas warna ekstrak metanolik

dan serbuk yang tidak berbeda dari intensitas warna serbuk daun. Hal ini

menunjukkan bahwa pelarut metanol yang telah dipartisi dengan diklorometana

dan air efektif dalam mengekstrak flavonoid dari daun sirsak. Intensitas warna

flavonoid yang terkandung dalam daun sirsak dapat dilihat pada Gambar 1.

A

B

Gambar 1 Hasil uji fitokimia flavonoid pada serbuk daun (A) dan ekstrak

metanol (B).

Ekstrak Flavonoid

Ekstrak metanolik diujikan terlebih dahulu pada sel normal. Uji

pendahuluan ini dilakukan untuk menentukan konsentrasi yang diperlukan guna

diujicobakan pada sel kanker yang tidak merusak sel normal.

Uji pendahuluan dari ekstrak metanolik pada sel Vero menggunakan

berbagai konsentrasi, mulai dari 25000 µg mL

-1

sampai 500 µg mL

-1

. Hasilnya

dapat dilihat pada Tabel 1. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak semakin besar pula

penghambatannya pada proliferasi sel Vero. Penghambatan ekstrak metanolik

daun sirsak menurun pada konsentrasi 1000 µg mL

-1

dan 500 µg mL

-1

dengan

penghambatan masing-masing 47.65% dan 31.49%. Berdasarkan hasil ini, ekstrak

hasil fraksinasi daun sirsak yang diujikan adalah di bawah 500 µg mL

-1

agar tidak

menghambat proliferasi sel normal.

Tabel 1 Penghambatan proliferasi ekstrak kasar daun sirsak terhadap sel Vero.

Konsentrasi ekstrak

µg mL-1

Rata-rata

serapan

% Penghambatan

proliferasi

25000 0.032

80.37

15000 0.037

77.1

10000 0.033

79.96

5000 0.042

74.03

1500 0.046

71.98

1000 0.085

47.65

500 0.112

31.49

Kaempferol Hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

[image:54.595.105.496.66.821.2]

Gambar 2

Eks

KLT, yait

pemisahan

rendemen

Flav

gambaran

flavonoid

spektrome

C18, pada

asam fosf

satu punca

(Gambar 3

Profil KL

eluen HC

strak kasar

tu HCO

2

H:

n dengan K

sebanyak 2

vonoid yang

yang jela

yang terka

eter UV-Vis

a laju alir 1

fat 0.5%. H

ak serapan m

3).

A

LT eluen te

CO

2

H:H

2

O

dipisahkan

H

2

O:MeOH

KLTP sela

23.45%.

Id

g dicari, yai

as tentang

andung di d

s dan KCKT

1ml/menit,

Hasil identif

maksimum

rbaik ekstra

:MeOH dan

n menggun

H untuk me

anjutnya di

dentitas Fla

itu kaempfe

struktur

dalam daun

T. Kondisi

detektor UV

fikasi denga

di daerah p

ak kasar dau

n profil KLT

nakan KLTP

emperoleh

iuapkan hin

avonoid

erol, diiden

senyawa y

sirsak dide

untuk KCK

V 370 nm,

an spektrom

panjang gelo

B

un sirsak (A

T setelah hi

A) menggun

drolisis (B)

nakan

.

P dengan

senyawa ka

ngga pekat

eluen dari

aempferol.

t dan dipe

hasil

Hasil

eroleh

ntifikasi unt

yang diingi

eteksi denga

KT dilakuka

dengan elu

meter Uv-V

ombang 250

tuk mendap

inkan. Sen

an menggun

an dengan k

uen MeOH

Vis menunju

0 sampai 30

[image:55.595.75.484.67.789.2]

Gambar 3 Spektrum UV-Vis ekstrak daun sirsak dalam metanol.

Hasil analisis menunjukkan bahwa ekstrak yang diperoleh memiliki waktu

retensi yang hampir sama dengan standar kaempferol (

≥

90%) yang diperoleh dari

Sigma-Aldrich, USA, sehingga diyakini bahwa senyawa yang diperoleh

merupakan senyawa kaempferol (Gambar 4). Gambar hasil KCKT menunjukkan

bahwa waktu retensi yang diperoleh dari ekstrak hasil KLTP ialah 3.395 dan

standar kaempferol memiliki waktu retensi 3.384.

A B

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 mV

Detector A Ch2:370nm

K ae m pf er o l/ 3. 38 4 /79 0 6 3 8

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 mV

Detector A Ch2:370nm

K a em p fe ro l/ 3 .3 95 /1 71 3 7

[image:55.595.176.385.87.314.2]

Hasil pemisahan ekstrak daun sirsak dengan KLTP diuji daya hambat

proliferasinya pada sel Vero dan Raji. Konsentrasi ekstrak yang digunakan ialah

3, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 125, dan 250 µg mL

-1

. Konsentrasi tertinggi pada 250

µg mL

-1

dipilih berdasarkan hasil uji

in vitro

pada ekstrak kasar terhadap sel Vero.

Hasil pada konsentrasi tersebut ialah konsentrasi tertinggi yang minimal

toksisitasnya terhadap sel Vero.

‐40

‐20 0 20 40 60 80 100

0 50 100 150 200 250

%

Penghambatan

Konsentrasi (µg/mL)

Sel Vero

Sel Raji

Gambar 5 Kurva penghambatan proliferasi ekstrak hasil KLTP daun sirsak

terhadap sel Raji (A) dan sel Vero (B).

Dari hasil uji pada sel Vero (Gambar 5), diperoleh bahwa kaempferol

sampai dengan konsentrasi 250 µg mL

-1

minimal menghambat proliferasi sel

sebesar 19.77% sedangkan konsentrasi di bawah 100 µg mL

-1

tidak ada

penghambatan. Akan tetapi, pada uji sel Raji pada konsentrasi di atas 100 µg mL

-1

mengalami peningkatan hambatan proliferasi sampai dengan 76.36% pada

konsentrasi 250 µg mL

-1

.

[image:57.595.51.486.51.842.2]

Gambar 6 Sel Raji tanpa pemberian ekstrak (A) dan sel Raji yang diberi ekstrak

kaempferol 250 µg mL

-1

(B) (Perbesaran 8×10).

Berdasarkan hasil uji MTT, secara makroskopis (Gambar 7) pada sel Vero

menghasilkan warna ungu yang hampir sama dengan kontrol sel normal yang

tidak diberi ekstrak.

A B

Gambar 7 Sel Vero (kontrol) pada uji MTT (A) dan sel Vero setelah

pemberian ekstrak (B).

penurunan sel yang mati, karena metode MTT tidak dapat digunakan untuk

menghitung jumlah sel yang mati, hanya dapat menentukan persen penghambatan

saja.

A

B

[image:58.595.117.511.171.362.2]

Gambar 8 Sel Raji (kontrol) pada uji MTT (A) dan sel raji setelah

pemberian ekstrak (B) (perbesaran 8×10).

Berdasarkan hasil perhitungan nilai IC

50

, hasil uji penghambatan terhadap

sel Vero memperlihatkan bahwa ekstrak kasar baru dapat menghambat sel normal

di atas 500 µg mL

-1

dengan nilai IC

50

922.88 µg mL

-1.

. Dari uji kaempferol hasil

fraksinasi dengan KLTP pada sel normal dan sel kanker Raji, terlihat bahwa

persen penghambatan pada sel kanker Raji lebih besar daripada sel Vero bahkan

pada sel Vero dapat dikatakan