PENGARUH EKSTRAK KAYA SAPONIN DARI DAUN
PEPAYA (
Carica papaya
L) TERHADAP MEMBRAN
Staphylococcus aureus
DAN SPORA
Aspergillus niger
DINA FITHRIYANI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Pengaruh Ekstrak Kaya Saponin dari Daun Pepaya (Carica papaya L) terhadap Membran Staphylococcus aureus dan Spora Aspergillus niger adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2017
Dina Fithriyani
RINGKASAN
DINA FITHRIYANI. Pengaruh Ekstrak Kaya Saponin dari Daun Pepaya (Carica papaya L) terhadap Membran Staphylococcus aureus dan Aspergillus niger. Dibimbing oleh HARSI DEWANTARI KUSUMANINGRUM dan DIDAH NUR FARIDAH .
Masalah keamanan pangan tidak lepas dari adanya mikroba patogen yang dapat menyebabkan pada masalah kesehatan dan kerusakan pada pangan.
Staphlococcus aureus dan Aspergillus niger merupakan bakteri patogen dan
kapang perusak pangan yang mudah tumbuh di daerah Indonesia, sehingga pertumbuhannya harus dikontrol. Salah satu upaya untuk mengkontrol pertumbuhan mikroba tersebut yakni dengan penggunaan senyawa antimikroba alami seperti saponin. Senyawa saponin diketahui memiliki aktifitas antimikroba, dan jumlahnya cukup melimpah pada daun pepaya yang banyak tersebar di wilayah Indonesia.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui metode ekstraksi saponin yang menghasilkan rendemen tinggi dari daun pepaya dengan membandingkan rendemen dari daun pepaya (tua, muda) dan pelarut (etanol, metanol) yang digunakan, serta untuk mengetahui aktivitas antimikroba saponin dari daun pepaya (Carica papaya L) pada S. aureus dan spora A. niger dengan melihat pengaruh saponin pada membran sel bakteri dan spora.
Hasil dari penelitian ini diketahui bahwa ekstraksi menggunakan pelarut etanol menghasilkan rendemen yang lebih tinggi (5,7%) dibandingkan dengan metanol (3,2%), sedangkan rendemen ekstrak kaya saponin pada daun pepaya muda dan tua tidak berbeda nyata. Ekstrak kaya saponin yang diperoleh dengan pelarut etanol, pada konsentrasi 20 mg/mL dan 50 mg/mL mampu menghambat pertumbuhan S. aureus dan spora A. niger. Setelah dipaparkan dengan ekstrak kaya saponin selama 6 jam, absorbansi dari supernatan meningkat, hal tersebut mengindikasikan keluarnya cairan sitoplasma dari dalam sel. Selain itu, jumlah sel atau spora yang berfluoresense merah meningkat, mengindikasikan bahwa membran mengalami kebocoran. Ekstrak kaya saponin dari daun pepaya mampu menghambat pertumbuhan S. aureus dan menghambat germinasi spora A. niger
dengan kebocoran membran.
SUMMARY
DINA FITHRIYANI. Effect of Saponin-rich-extract from Papaya Leaves on Membrane of Staphylococcus aureus and Aspergillus niger Spore. Supervised by HARSI D. KUSUMANINGRUM and DIDAH N. FARIDAH.
Food safety issues can not be separated from the microbial pathogens that can cause health problems and food spoilage. Staphylococcus aureus is known as important foodborne pathogenic bacteria and Aspergillus niger as important mold
causing food spoilage in Indonesia. Their presence in food product should be prevented and controlled. One of the efforts to improve food safety is the utilization of antimicrobial compounds, that can inhibit the growth of pathogenic microbes and food spoilage microorganism like Saponin. Saponins are triterpenic or steroidal glycosides which have many biological properties, and largely distributed in papaya leaves abundantly grown in Indonesia.
This research aimed to compare the extraction procedure of saponin from papaya leaves by the difference of papaya leaves (young and old) and solvent (methanol, ethanol) that be used. This research also to determine the antimicrobial activity of saponins from papaya leaves (Carica papaya) and to see the effect of
saponins in the cell membranes of bacteria and spores.
The results showed that extraction by etanol provided higher yields (5.7%) than by metanol (3.2%). The yields of saponin-rich-extract from young and old leaves were not significantly different. Saponin-rich-extract of papaya leaves obtained by etanol extraction at a concentration of 20 mg/g and 50 mg/mL were able to inhibit the growth of S. aureus and A. niger significantly, respectively. After exposed to saponin-rich-extract for 6 hours, the absorbance of supernatant increased, indicating leaching of cytoplasm cells, and the sum of red-fluorescent cells or spore increased, indicating membrane disruptions. Saponin rich extract of papaya leaves were able to inhibit the growth of S. aureus and inhibit the germination of A. niger spores by disrupting the membrane.
Keywords: Aspergillus niger, membrane disruption, papaya leaves, saponin,
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2017
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Pangan
PENGARUH EKSTRAK KAYA SAPONIN DARI DAUN
PEPAYA (
Carica papaya
L) TERHADAP MEMBRAN
Staphylococcus aureus
DAN SPORA
Aspergillus niger
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2017
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan tesis yang berjudul Pengaruh Ekstrak Kaya Saponin dari Daun Pepaya (Carica papaya L) terhadap Membran Sel Staphylococcus aureus dan Spora Aspergillus niger. Tesis
ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan strata dua (S2) Program Studi Ilmu Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Ir Harsi Dewantari Kusumaningrum dan Dr Didah Nur Faridah, STP, MSi selaku pembimbing yang telah memberikan pengarahan, bimbingan, saran, motivasi, serta solusi dari setiap permasalahan yang dihadapi penulis selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Ucapan terimakasih kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia yang telah memberikan beasiswa BPPDN Calon Dosen dan telah mendanai penelitian ini melalui Hibah Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Lanjutan tahun 2015-2016 atas nama Dr. Ir. Harsi D Kusumaningrum. Selain itu penulis ucapkan terima kasih kepada penguji luar komisi Prof Dr Ir Ratih Dewanti H. MSc dan Dr. Nancy Dewi Yuliana, STP, MSc selaku Sekretaris Program Studi Ilmu Pangan IPB, yang telah memberikan masukan pada saat ujian sidang tesis untuk membuat karya ilmiah ini menjadi lebih baik.
Ungkapan terima kasih yang tak terhingga juga penulis ucapkan kepada kedua orang tua bapak Drs. Furqon Amin dan ibu Nashriyah, suami tercinta Erwin Dian Saputro ST, ananda Muhammad Zhafran Nufays, kakak, adik serta seluruh keluarga besar tercinta, atas segala doa, semangat, dukungan, motivasi dan kasih sayangnya selama ini. Penulis juga ingin menyampaikan terima kasih kepada semua pihak, teknisi laboratorium, dan teman-teman yang telah membantu dan berbagi ilmu dalam penelitian ini. Terima kasih kepada teman-teman seperjuangan Pascasarjana Ilmu Pangan IPB. Semoga karya tulis ini bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan selanjutnya.
Bogor, Februari 2017
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 1
Tujuan Penelitian 2
Hipotesis 2
Manfaat Penelitian 2
2 TINJAUAN PUSTAKA 3
Saponin 3
Saponin Daun Pepaya (Carica papaya Linn) 5
Ekstraksi Saponin 5
Saponin sebagai Antimikroba 7
Staphylococcus aureus 9
Aspergillus niger 11
Mekanisme Kerusakan Sel Mikroba dan Spora Kapang 12
3 METODE 14
Waktu dan Tempat Penelitian 14
Bahan 14
Alat 14
Prosedur Penelitian 15
Prosedur Analisis Data 19
4 HASIL DAN PEMBAHASAN 19
Ekstrak Kaya Saponin Daun Pepaya 19
Aktivitas Antimikroba Ekstrak Kaya Saponin dari Daun Pepaya 24 Pengaruh Ekstrak Kaya Saponin dari Daun Pepaya 27
5 SIMPULAN DAN SARAN 31
Simpulan 31
Saran 31
DAFTAR PUSTAKA 31
LAMPIRAN 36
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Jumlah Senyawa Bioaktif Ekstrak Daun Pepaya ... 5
Tabel 2. Nilai MIC Ekstrak saponin pada Berbagai Bakteri ... 7
Tabel 3. Hasil Penelitian Saponin dari Berbagai Sumber ... 8
Tabel 4. Kondisi Pertumbuhan S. aureus dan Produksi Enterotoksin ... 10
Tabel 5. Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Kaya Saponin dan Ekstrak Etanolik ... 21
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Contoh saponin steroid dengan 4 rantai gula ... 3Gambar 2. Perbedaan struktur aglikon saponin ... 3
Gambar 3. Struktur kimia beberapa macam jenis saponin ... 4
Gambar 4. Metode ekstraksi ... 6
Gambar 5. Aktifitas antikapang dari 3 jenis saponin ... 8
Gambar 6. Struktur membran sel bakteri ... 10
Gambar 7. Morfologi kapang Aspergillus niger... 12
Gambar 8. Struktur spora ... 12
Gambar 9. Model pembentukan pori oleh molekul saponin ... 13
Gambar 10. Model kerusakan membran oleh saponin ... 13
Gambar 11. Skema prosedur tahapan penelitian ... 15
Gambar 12. Rendemen ekstrak daun pepaya ... 20
Gambar 13. Kromatogram ... 22
Gambar 14. Kadar saponin pada ekstrak daun pepaya ... 23
Gambar 15. Zona hambat ekstrak kaya saponin pada S. aureus ... 24
Gambar 16. Nilai MIC ekstrak kaya saponin pada S. aureus ... 25
Gambar 17. Pemaparan A niger. dengan ekstrak kaya saponin ... 26
Gambar 18. Agar Dilution Test spora A. niger ... 26
Gambar 19. Absorbansi supernatan S aureus ... 27
Gambar 20. Absorbansi supernatan A. niger ... 28
Gambar 21. Sel bakteri S. aureus ... 29
Gambar 22. Spora A niger ... 30
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Prosedur Analisa Kadar Air ... 36Lampiran 2. Prosedur Analisis Kualitatif Fitokimia ... 36
Lampiran 3. Hasil uji ANOVA Rendemen Ekstrak Daun Pepaya ... 37
Lampiran 4. Hasil uji ANOVA Kadar Saponin Ekstrak Daun Pepaya ... 37
Lampiran 5. Hasil uji ANOVA Absorbansi S. aureus ... 38
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Masalah keamanan pangan tidak lepas dari adanya mikroba patogen yang dapat menyebabkan pada masalah kesehatan dan kerusakan pada pangan.
Staphylococcus aureus dan Aspergillus niger merupakan bakteri patogen dan
kapang perusak pangan yang mudah tumbuh di daerah Indonesia, sehingga pertumbuhannya harus dikontrol. Salah satu upaya untuk mengontrol pertumbuhan mikroba tersebut yakni dengan penggunaan senyawa antimikroba alami seperti saponin. Senyawa saponin diketahui memiliki aktifitas antimikroba, dan jumlahnya cukup melimpah pada daun pepaya yang banyak tersebar di wilayah Indonesia.
Menurut Baskaran et al. (2012) senyawa yang terkandung dalam daun
pepaya antara lain yaitu alkaloid, saponin, glikosida, fitosterol, komponen fenolik, flavonoid, terpenoid, dan tanin. Beberapa senyawa tersebut diketahui memiliki aktivitas antimikroba, seperti alkaloid yang mampu menghambat pertumbuhan dan pembentukan toksin dari Staphylococcus aureus (Handayani, 2014), komponen fenolik menghambat patogen dengan menggangu membran sel dan ATPase (Cetin, 2011), dan saponin yang mampu menghambat pertumbuhan
Candida albicans dan Aspergillus niger (Ribeiro et al., 2013).
Saponin merupakan triterpenoid atau steroid glikosida yang terdapat pada tanaman. Glikosida tersebut memiliki fungsi fisiologis pada tanaman yakni sebagai faktor penghambat serangan patogen. Selain menghambat patogen, saponin juga dimanfaatkan sebagai pembentuk busa, emulsifier, antioksidan, anti tumor, antimikroba dan sebagainya (Ribeiro et al., 2013). Menurut Vuong et al.
(2013), saponin ditemukan pada ekstrak etanol daun pepaya dalam jumlah yang cukup banyak yaitu 82.88 mg/g ekstrak, akan tetapi penelitian mengenai metode ekstraksi dan isolasi saponin tersebut belum banyak dilakukan. Selain itu, penelitian tentang saponin dari daun pepaya belum banyak dilakukan di Indonesia khususnya. Dengan demikian diperlukan penelitian untuk mempelajari ekstraksi dan isolasi saponin yang menghasilkan rendemen tinggi dari daun pepaya.
Barile et al. (2007) menyatakan bahwa, saponin dari Allium minutiflorum
memiliki aktivitas sebagai antikapang. Hal yang hampir serupa disampaikan oleh Ribeiro et al. (2013) bahwa saponin dari sisal (Agave sisalana) memiliki aktivitas penghambatan pada kapang (A. niger, C. albicans) yang jauh lebih tinggi
dibandingkan daya hambatnya pada bakteri (E. coli, S. aureus, B. subtilis).
Menurut Morrissey dan Osbourn (1999), saponin dapat membentuk kompleks dengan sterol yang ada pada membran sel sehingga mengganggu permeabilitas sel. Oleh karena itu perlu suatu penelitian lebih lanjut untuk mengetahui aktivitas antimikroba saponin dari daun pepaya (Carica papaya) serta penghambatannya pada spora kapang (A. niger) dan bakteri patogen (S. aureus) dengan melihat pengaruh saponin pada membran sel bakteri dan spora kapang tersebut.
Perumusan Masalah
2
enterotoksin yang tahan terhadap pemanasan dan A. niger yaitu kapang perusak pangan dan penghasil mikotoksin. Aktivitas antimikroba ini berhubungan dengan komponen fitokimia yang terdapat dalam daun pepaya, seperti komponen fenolik, alkaloid, dan saponin. Saponin merupakan senyawa kimia yang jumlahnya cukup tinggi pada daun pepaya, namun eksplorasi saponin pada daun pepaya belum banyak dilakukan khususnya di Indonesia. Metode ekstraksi saponin dari daun pepaya yang menghasilkan rendemen yang tinggi juga belum banyak diteliti. Oleh karena itu, kajian mengenai metode ekstraksi saponin daun pepaya serta aktvitas ekstrak saponin dari daun pepaya terhadap bakteri (S. aureus) dan spora kapang
(A. niger)perlu dilakukan.
Tujuan Penelitian
Tujuan umum penelitian adalah untuk menguji pengaruh penambahan ekstrak saponin dari daun pepaya dalam berbagai konsentrasi terhadap pertumbuhan S. aureus dan spora A. niger. Tujuan khusus penelitian ini adalah
untuk menentukan metoda ektraksi saponin dengan rendemen tinggi, menentukan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) ekstrak kaya saponin dari daun pepaya terhadap S. aureus dan spora A. niger, dan mengetahui pengaruh saponin
daun pepaya terhadap membran sel S. aureus dan spora A. niger
Hipotesis
Ekstrak saponin dari daun pepaya mampu menghambat pertumbuhan S. aureus dan spora A. niger. Saponin dapat merusak membran sel dari bakteri S. aureus dan spora kapang A niger.
Manfaat Penelitian
Dari penelitian tentang pengaruh ekstrak saponin dari ekstrak daun pepaya terhadap membran S. aureus dan spora kapang A. niger ini dapat memberikan
manfaat antara lain yakni :
1. Memberikan informasi tentang ekstraksi saponin dari daun pepaya yang menghasilkan rendemen tinggi.
2. Memberikan informasi tentang manfaat daun pepaya dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. aureus dan spora kapang A. niger sehingga dapat membantu meningkatkan keamanan bahan dan produk pangan.
3
2
TINJAUAN PUSTAKA
Saponin
Dalam review yang dilakukan oleh Morrissey dan Osbourn (1999), saponin adalah molekul glikosilat triterpenoid, steroid, alkaloid steroida yang banyak tersebar di berbagai jenis tanaman dan diketahui memiliki aktifitas antikapang. Saponin merupakan senyawa yang memiliki rantai oligosakarida yang terdiri glukosa, arabinosa, asam glukoronat, silosa, rafinosa. Saponin diklasifikasikan menjadi 2, yaitu: saponin steroid dan saponin triterpenoid. Saponin steroid tersusun atas inti steroid (C-27) dengan molekul gula. Saponin steroid dihidrolisis menghasilkan suatu aglikon yang dikenal sebagai saraponin. Saponin triterpenoid tersusun atas inti triterpenoid dengan molekul gula yang dihidrolisis menghasilkan suatu aglikon yang disebut sapogenin. Contoh struktur kimia saponin steroid dan aglikon yang berbeda pada saponin dapat dilihat pada Gambar 1 dan Gambar 2.
Gambar 1. Contoh saponin steroid dengan 4 rantai gula: Parquisoide yang diekstrak dari Cestrum parqui (Chaieb, 2010)
4
Saponin merupakan metabolit sekunder yang banyak tersebar di tanaman, berperan sebagai senyawa kimia pada sistem pertahanan tanaman untuk melawan patogen dan herbifor (Augustin et al, 2011). Tanaman yang berbeda kemungkinan memiliki jenis saponin yang berbeda, misalnya pada akar oat memiliki jenis
saponin triterpenoid yakni avenacin, sedangkan pada kentang dan tomat memiliki
saponin steroid glikoalkaloid yakni α-tomatine dan α –chaconine (Morrissey dan Osbourn, 1999). Untuk contoh struktur kimia berbagai macam saponin dapat dilihat pada Gambar 3. Avenosin A dan B secara biologis inaktif di dalam tanaman, namun akan diubah menjadi antikapang ketika ada serangan dari patogen oleh glukosil hidrolase pada tanaman yang spesifik untuk molekul glukosa atom C-26 (Morrissey dan Osbourn 1999).
Gambar 3. Struktur kimia beberapa macam jenis saponin (Morrissey dan Osbourn, 1999)
Saponin diketahui memiliki aktifitas farmasi seperti hemolitik, antikapang atau antiyeast , antibakteri, antiparasitik, antitumor, dan antiviral (Sparg et al., 2004). Selain dalam farmasi, saponin juga digunakan pada pangan sebagai surfaktan alami dan sebagai pengawet dalam mengontrol mikroba perusak pangan. Piorkowski dan McClements (2013), menggunakan Quillaja saponin sebagai surfaktan alami dengan molekul kecil dalam emulsi minuman menggantikan surfaktan sintetik. Yang et al. (2013), membandingkan surfaktan
5 emulsi, serta diketahui surfaktan alami efektif dan mampu mengganti surfaktan sintetik. Saponin teh yang dikombinasikan dengan Bacillus amyloliquefacien
untuk perlakuan pascapanen buah Mandarin, dapat mengurangi kapang hijau dan biru (Hao et al., 2011). Pada penelitian Du et al. (2015), nilai LD50 dari uji
toksisitas oral akut saponin dari Sapindus mukorossi adalah 9260 mg/kg berat kelinci Wistar, dan disimpulkan bahwa saponin dari Sapindus mukorossi aman untuk kosmetik serta dikategorikan “practical nontoxic‖ dan ―non dermal iritation‖.
Saponin Daun Pepaya (Carica papaya L)
Pada penelitian yang dilakukan oleh Vuong et al. (2013), tentang kondisi
ekstraksi komponen fenolik dan aktivitas antioksidan pada ekstrak daun pepaya, diketahui bahwa jumlah saponin dalam daun pepaya cukup tinggi dibandingkan dengan komponen yang lain. Hasil tersebut dapat dilihat pada Tabel 1. Namun penelitian tersebut menyatakan ekstraksi saponin dari daun pepaya belum banyak dilakukan, sehingga bagian daun pepaya yang paling banyak mengandung saponin serta jenis saponin yang terkandung belum banyak diketahui.
Tabel 1. Jumlah Senyawa Bioaktif Ekstrak Daun Pepaya (Carica papaya L)
dengan Berbagai Pelarut Senyawa Bioaktif/Aktivitas
Antioksidan
Jumlah Senyawa Bioaktif dan Aktivitas Antioksidan pada Ekstrak Air Aseton Etanol Metanol Total antioksidan (µg TE/g) 166.66±5.14 133.18±2.15 122.47±1.81 158..91±1.68 *Ket: GAE = gallic acid equivalent; CE = catechin equivalent; aes = aescin
(standar saponin); TE = trolox equivalent; mg/g = mg / g ekstrak Sumber : Vuong et al., 2013
Ekstraksi Saponin
Pada umumnya ekstrasi saponin dapat diklasifikasikan menjadi dua kategori yakni teknik konvensional dan green technology. Teknik konvensional meliputi ekstraksi dengan maserasi, soxhlet dan refluks, sedangkan green technology
meliputi ultrasound-assisted, microwave-assisted, and accelerated solvent extraction (Heng et al., 2013). Ekstraksi secara konvensional didasarkan pada kelarutan saponin pada pelarut. Hal tersebut menyebabkan pelarut yang dibutuhkan seringnya dalam jumlah banyak untuk mengekstrak saponin meskipun terkadang ditambahkan proses pemanasan, pengadukan, dan pengocokan. Di sisi lain, teknik ekstraksi menggunakan green technology memperkecil bahaya reakasi kimia, lebih hemat penggunaan bahan kimia, lebih efisien, serta mengurangi polusi (Azmir et al., 2013).
6
merendam bahan dalam pelarut spesifik selama beberapa waktu yang ditentukan ( Takeuchi et al., 2009). Pada teknik ini etanol dan metanol sering digunakan sebagai pelarut dalam ekstraksi saponin dari tanaman. Durasi waktu ekstraksi dengan menggunakan metode maserasi cukup lama, terkadang mencapai beberapa minggu. Teknik konvensional selain maserasi yakni teknik soxhlet dan refluks. Proses tersebut yaitu memanaskan pelarut untuk menguapkannya kemudian dikondensasikan dan dialirkan pada sampel dan dikembalikan pada flash. Larutan yang sering digunakan yakni etanol. Kerugian dari teknik ini yaitu lama, sedikitnya diperlukan waktu 1-4 jam untuk refluks dan 24-72 jam untuk soxhlet.
Gambar 4. Persentase metode ekstraksi yang digunakan untuk ekstraksi saponin dari berbagai tanaman (Cheok et al., 2014).
Pada ekstrasi saponin, sering juga digunakan 2 kombinasi teknik ekstraksi utnuk memperoleh ekstrak saponin yang hampir murni sebelum dianalisis dengan HPLC. Soxhlet pada umumnya berada pada tahapan pertama ekstraksi, bertujuan untuk menghilangkan lipid pada sampel tanaman. Pelarut pada tahapan soxhlet yang sering digunakan yakni hexan dan kloroform (Ncube et al., 2011).
Selain menggunakan teknik konvensional seperti yang disebutkan sebelumnya, ekstraksi saponin juga dapat menggunakan green technology antara lain yaitu ultrasound-assisted extraction (UAE), microwave-assisted extraction
(MAE),dan accelerated solvent extraction (ASE). Prinsip kerja UAE yaitu
ultrasound yang membentuk gelembung pada solvent akan bekerja sebagai mikrojet untuk mendenaturasi dinding sel tanaman, ketika gelembung pecah pada fraksi akan dihasilkan yield komponen bioaktif. UAE sudah sering diaplikasi pada ekstraksi komponen bioaktive dari herbal, industri dan pengolahan pangan (Soria dan Villamel, 2010). Meskipun UAE sudah sering digunakan, namun pada proses ekstraksi saponin belum banyak yang menggunakan metode tersebut (Cheok et al., 2014).
7 mekanisme pemanasan yang khusus (Heng et al., 2013). Microwaves mampu berpenetrasi ke dalam material dan menimbulkan panas yang dihasilkan oleh interaksi molekul polar seperti air di dalam material. Efektifitas MAE tergantung pada pelarut dan struktur matriks sel tanaman (Takeuchi et al., 2009). Pada review yang dilakukan oleh (Cheok et al., 2014), pada ekstraksi saponin dengan menggunakan metode MAE menghasilkan yield yang lebih tinggi, dan waktu yang lebih singkat.
Berbeda dengan MAE yang menggunakan gelombang elektromagnetik, ASE menggunakan suhu dan tekanan yang tinggi namun pelarut yang sedikit. Penggunaan suhu yang tinggi bertujuan untuk meningkatkan kelarutan serta transfer masa zat terlarut pada pelarut, dan tekanan yang tinggi mempertahankan titik didih pelarut, mempercepat, dan mengefisienkan proses ekstraksi (Mottaleb dan Sarker, 2012). Proses ekstraksi pada umumnya berakhir selama 15-25 menit dengan menggunakan 15-45 mL pelarut. SAE banyak digunakan pada penelitian lingkungan, pangan, polimer, dan farmasi.
Pada umumnya, saponin diekstrak menggunakan pelarut air, etanol, dan metanol (Huang et al., 2008). Shuna et al. (2007) meneliti tentang ekstraksi saikosaponin dari Radix Bupleri dengan metode UAE dan memperoleh hasil bahwa kondisi optimum yakni selama 30 menit, suhu 80 oC, ukuran partikel <0,3 mm, perbandingan padatan dan larutan 25 mg/mL dengan konsentrasi pelarut 50% (Etanol/air).
Saponin sebagai Antimikroba
Pada penelitian yang dilakukan oleh Hassan et al. (2010) tentang aktivitas
antimikroba dari ekstrak saponin dari Guar Mill diketahui bahwa ekstrak kaya saponin tersebut mampu menghambat bakteri Staphylococcus aureus, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli, Lactobacillus spp. dengan nilai konsentrasi
hambat minimum (KHM) dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Nilai KHM ekstrak saponin pada berbagai bakteri
Bakteri KHM (mg/mL)
Selain menghambat bakteri, saponin juga diketahui mampu menghambat pertumbuhan kapang. Lanzotti et al. (2012) meneliti aktifitas antikapang ekstrak saponin dari Allium cepa L pada 10 jenis kapang dan diketahui bahwa aktivitas
anti kapang naik dengan naiknya konsentrasi. Berikut grafik aktifitas antikapang tersebut dapat dilihat pada Gambar 5.
8
Tabel 3. Hasil Penelitian Saponin dari Berbagai Sumber dan Aktivitasnya sebagai Antimikroba
Tanaman sumber
saponin Jenis Saponin Mikroba yang dihambat Pustaka
A. minutiflorum sapogenins,
Candida albicans, Aspergillus niger Ribeiro et
al. 2013
Allium cepa L. Ceposide Trichoderma atroviride, Botrytis cinerea Lanzotti et
9
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus merupakan bakteri penyebab keracunan makanan yang sering disebut dengan Staphylococcal food poisoning, merupakan penyakit
yang menyebabkan gastroenteritis dengan gejala waktu onset yang pendek. S. aureus sering ditemukan pada lingkungan seperti tanah, air, udara dan juga berada di hidung dan kulit manusia. S. aureus merupakan bakteri gram positif, tidak
membentuk spora, berbentuk bulat (coccus). Gambar struktur membran S. aureus
dapat dilihat pada Gambar 6. S. aureus memproduksi staphylococcal enterotoxin
(SE) yang menyebabkan Staphylococcal food poisoning (FDA, 2012)
Pertumbuhan S. aureus dipengaruhi oleh beberapa factor antara lain yaitu:
suhu, aw, pH, konsentrasi oksigen, dan komposisi dari makanan. Suhu pertumbuhan untuk S. aureus berkisar pada suhu 7-48oC, dengan suhu pertumbuhan optimum pada 37oC. S. aureus resisten terhadap suhu pembekuan
dan dapat bertahan dengan baik pada suhu penyimpanan -20oC, akan tetapi viabilitasnyha turun pada suhu -10oC hingga 0oC. S. aureus dapat mati pada proses pasteurisasi atau pemasakan. Untuk pH pertumbuhannya yakni berkisar antara 4.0 – 10.00, dengan optimum pH pertumbuhannya yakni 6-7 (Stewart, 2003).
S. aureus merupakan bakteri yang cukup unik karena mampu bertahan pada
kondisi Aw yang rendah, konsentrasi garam tinggi dan pada kondisi stress osmotic. Untuk merespon kondisi Aw yang rendah, beberapa komponen diakumulasi di dalam sel sehingga Aw dalam sel seimbang dengan Aw di luar sel.
S. aureus merupakan bakteri kompetitor yang lemah, akan tetapi kemampuan
untuk tumbuhnya pada kondisi osmotik dan pH rendah menyebabkan dapat tumbuh pada berbagai macam makanan, termasuk daging curing yang tidak mampu ditumbuhi oleh bakteri patogen lain (Montville dan Matthews, 2008). Kebanyakan S. aureus tumbuh pada kisaran Aw 0.83 hingga > 0.99 (FDA, 2012).
S. aureus merupakan bakteri fakultatif anaerob, sehingga dapat tumbuh pada kedua kondisi aerob dan anaerob. Akan tetapi pertumbuhannya lebih lamban jika kondisi pertumbuhannya anaerob. Untuk bakteri bukan penghasil spora, S. aureus
relatif lebih resisten terhadap panas (Stewart, 2003).
Keracunan Staphylococcal umumnya memiliki waktu onset yang cukup
pendek, berkisar 3 jam setelah konsumsi (berkisar 1-6 jam). Gejala-gejala yang ditunjukkan yaitu pusing, mual dan mutah, kram perut, dan diare. Lama penyembuhannya berkisar 1-3 hari (FDA, 2012). Kebanyakan terjadi pada anak-anak dan orang tua (Monville dan Matthews, 2008). Staphylococcal food poisoning merupakan intoksikasi yang disebabkan karena terkonsumsinya SE (Argudin, 2010). SE terdiri dari berbagai macam jenis, antara lain yakni : enterotoksin A (paling sering menyebabkan sakit), enterotoksin D, E, H, G, B, dan I yang juga menyebakan Staphylococcal food poisoning. SE diproduksi selama
fase eksponensial S. aureus, dengan jumlah yang tergantung oleh strain. Biasanya dosis SE menyebabkan sakit yakni ketika jumlah S. aureus berkisar 105 – 108
CFU/g (Monville dan Matthews, 2008).
10
9.6, dengan pH optimum yaitu 7 – 8. Produksi SE dapat terjadi baik pada kondisi aerob maupun anaerob, akan tetapi akan optimum produksinya pada kondisi aerobic (Stewart, 2003).
SE resisten pada panas dan pH rendah yang mana kondisi tersebut dapat dengan mudah membunuh bakteri S. aureus. SE juga resisten pada enzim proteolitik, hal ini yang menyebabkan SE mampu bertahan di dalam saluran pencernaan. Ukuran SE yaitu 22-28 kDa dan mengandung rantai disulfide yang flexible, hal tersebut diduga SE menyebabkan mual-mual, menstimulasi neuroreseptor pada saluran usus, kemudian dikirimkan stimuli pada saraf pusat mual pada otak melalui saraf vagus. SE mampu berpenetrasi ke dalam lapisan mukosa dam menstimulasi respon imun, sehingga akan dilepaskan inflammatory mediator, seperti histamine yang menyebabkan mual dan muntah. Diare selama
Staphylococcal food poisoning disebabkan oleh inhibisi air dan reabsorbsi
elektrolit pada usus halus (Argudin et al., 2010).
Tabel 4. Kondisi pertumbuhan S. aureus dan produksi enterotoksin
Pertumbuhan bakteri Produksi enterotoksin
Optimal Kisaran Optimal Kisaran
Suhu (°C) 37 7–48 40–45 10–48
pH 6–7 4–10 7–8 4.5–9.6
Aw 0.98 0.83–>0.99 0.98 0.87–>0.99 Sumber : ICMSF, 1996
11 kompleks dengan saponin dan menyebabkan pembentukan pori-pori pada membran dan menghambat pertumbuhan sel.
Aspergillus niger
A. niger dapat tumbuh pada kisaran suhu yang cukup luas, yakni berkisar antara 6-47 oC dengan suhu optimum pertumbuhannya yakni pada suhu 35-37 oC. Aw pertumbuhannya cukup rendah meskipun jika dibandingkan dengan
Aspergillus yang lain, Aw-nya yakni berkisar 0,88. Selain itu A. niger juga
mampu tumbuh pada pH ekstrim dan kisaran pH-nya sangat luas, yakni 1,4-9,8. Kemampuan tersebut sangat mendukung untuk produksi konidiospora yang dapat disebarkan melalui udara (Raper dan Fennel, 1965). Morfologi kapang A. niger
dapat dilihat pada Gambar 7. Produk pangan yang sering ditumbuhi A. niger
yakni produk pangan yang Aw-nya rendah seperti wajit, dan jenang.
A. niger merupakan salah satu mikroorganisme yang cukup penting di
bidang bioteknologi. A. niger sering dimanfaatkan oleh industri untuk memproduksi asam sitrat. Selain itu, A. niger menghasilkan asam glukonat dan asam fumarat. Sejak tahun 1960 an, A. niger dimanfaatkan sebagai
mikroorganisme penghasil enzim yang sangat berguna dalam proses pengolahan buah, pengolahan pati, dan di industri pangan lainnya. A. niger adalah kapang berfilamen yang tumbuh secara aerobik di bahan organik dan di alam ditemukan pada tanah serta sampah kompos (Schuster et al., 2002).
Meskipun A. niger memiliki banyak manfaaat di bidang industri seperti disebutkan di atas, pertumbuhan A. niger tetap harus di kontrol dan strain kultur harus diketahui karena menurut Schuster et al. (2002), dari hasil
penelitian-penelitian sebelumnya diketahui bahwa strain tertentu A. niger dapat memproduksi okratoksin A. Okratoksin A merupakan mikotoksin yang bersifat nefrotoksin dan karsinogenik. Metabolit sekunder tersebut sangat berbahaya untuk kesehatan. Dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Kusters et al. (1991), strain
CBS 618.78 dapat menghasilkan okratoksin A tersebut. Dibandingkan koleksi kultur yang lain, strain CBS 618.78 tersebut berhubungan dengan CBS 126.48 yang merupakan A. niger yang diketahui mampu memproduksi okratoksin A
dalam jumlah yang cukup banyak. Oleh karena itu, dalam pemanfaatan A. niger
sangat penting sekali untuk mengetahui strain yang digunakan, dan produksi toksinnya. Selain mampu menghasilkan mikotoksin yang berbahaya A. niger juga
dapat menyebabkan aspergillosis dan mikosis telinga.
Pada Gambar 8 terlihat struktur spora terdiri atas coat, cortex, membran
dan core. Coat terdiri dari berbagai molekul toksik dan enzim-enzim yang
12
Gambar 7. Morfologi kapang Aspergillus niger (Madigan et al. 2012)
Gambar 8. Struktur spora kapang (Madigan et al. 2012)
Mekanisme Kerusakan Sel mikroba dan Spora Kapang oleh Senyawa Saponin
13
Gambar 9. Model Pembentukan pori oleh molekul saponin (Avenacin A-1) (Armah et al. 1999)
Gambar 10. Model kerusakan membran oleh saponin (Morrissey dan Osbourn, 1999).
Mekanisme utama penghambatannya yakni saponin membentuk kompleks dengan sterol membran kapang maupun bakteri dan menyebabkan terbentuknya pori pada membran sehingga permeabilitas membran dari kapang tersebut terganggu dan pertumbuhannya terhambat. Pembentukan kompleks saponin-sterol pada membran, kemungkinan disebabkan adanya interaksi antara gula residu dan molekul saponin. Rantai gula yang terikat pada C-3 merupakan hal yang penting untuk aktifitas antikapang, dimana hilangnya gula residu akan menyebabkan berkurangnya aktifitas biologisnya (Armah et al., 1999).
14
menyebabkan membrane dessease pada sel membran protozoa (Cheeke, 2000). Morrissey dan Osbourn (1999) dalam tulisannya juga memaparkan bagaimana saponin mampu menghambat pertumbuhan kapang dengan cara membentuk pori-pori pada membran kapang. Saponin akan berikatan dengan sterol yang ada pada membran kapang dan akan membentuk pori-pori pada membran yang selanjutnya berdampak pada kebocoran sel dan keluarnya komponen dalam sel.
3
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan dan Kimia Pangan, gedung PAU SEAFAST Center IPB serta di Laboratorium Kimia Pangan dan Persiapan ITP IPB. Penelitian dilaksanakan pada bulan November 2014 – Mei 2016
Bahan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun pepaya
calina (IPB 9) diperoleh dari Pusat Kajian Holtikultura Tropika (PKHT) Institut
Pertanian Bogor dengan umur tanam 18 bulan, isolat S. aureus American type culture collection (ATCC) 25923 dan Aspergillus niger American type culture collection (ATCC) 6275yang diperoleh dari IPBCC.
Bahan yang digunakan untuk ekstraksi saponin dari daun pepaya dan pengukuran kadar saponin antara lain yakni n-hexan (Merck & Co.,USA), etanol (Merck & Co., USA), metanol (Merck & Co., USA), kloroform (Merck & Co., USA), butanol (Merck & Co., USA), sodium hidroksida 1% (Merck KgaA, Germany), vanilin (Merck KgaA, Germany), standar saponin white pure Erg. B6 (Merck KgaA, Darmstadt, Germany), aquades, kertas saring. Untuk pengujian fitokimia daun pepaya digunakan NaOH 10%, kloroform (J.T. Baker, Pennsylvania, USA), FeCl3 1%, serbuk magnesium, alkohol khloridat (campuran HCl 37% dan etanol 95% dengan volume sama), amil alkohol (Merck KgaA, Germany), H2SO4
pekat (Merck KgaA, Germany), pereaksi Mayer(HgCl2, KI)
Bahan lain yang digunakan dalam penentuan KHM dan pengamatan kebocoran membran sel serta spora antara lain yaitu: media Tryptone Soy Agar
(TSA) (40 g/liter; Oxoid Hampshire, UK), Tryptone Soy Broth (TSB) (30 g/liter Oxoid Hampshire, UK), Potato Dextrose Agar (PDA) (Oxoid Ltd., Hampshire,
UK), Potato Dextrose Broth (PDB) (Oxoid Ltd., Hampshire, UK), Mueller Hinton agar (MHA) (38 g/liter; Oxoid Ltd., Hampshire, UK), garam fisiologis 0.85%, kapas, alumunium foil, 5 mM pottasiumfosfat, buffer (pH 6.7), pewarna fluoresens propidium iodide dan SYBR green (Kapa Biosystems, USA).
Alat
15 (Martin Christ Gamma 2-16 LSC), rotavapor (Butchi Rotavapor R-210, BÜCHI Labortechnik, Flawil, Switzerland), timbangan analit, spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-1800, Japan), sentrifuge (Hermle Z383K; Hermle Labortechnik GmbH,Wehingen, Saint Nom, Jerman), autoklaf, vortex, inkubator, refrigerator, penyaring vakum (BÜCHI Labortechnik, Flawil, Switzerland), onsen, inkubator, shaker, mikroskop fluoresens (CH30, Olympus, Japan), plat TLC silika gel GF254
(Merck, Darmstadt, Germany), lampu UV, mikropipet (Finnpipette, Thermo Scientific, Finland), dan peralatan gelas.
Prosedur Penelitian
Skema prosedur penelitian secara umum dapat dilihat pada Gambar 11
.
16
Persiapan Daun Pepaya
Daun pepaya Calina diperoleh dari Pusat Kajian Holtikultura Tropika (PKHT) Institut Pertanian Bogor. Bagian yang diambil adalah daun yang berwarna hijau, memiliki tangkai yang lurus dan merupakan daun pepaya yang berada pada 3 lapis pertama (daun muda) dan 3 lapis bawah (daun tua) dari pucuk daun. Pengambilan dilakukan di pagi hari agar daun tidak cepat layu dan senyawa bioaktif di dalamnya tidak rusak karena panas.
Daun pepaya Calina utuh yang tidak terserang penyakit dikumpulkan dari pohon pepaya. Daun dicuci 2-3 kali dengan air bersih. Kemudian diukur kadar air daun pepaya segar dengan metode oven (AOAC, 2012). Setelah itu daun pepaya Calina dicuci dikeringkan dengan kabinet dryer selama 18 jam dan diukur kadar airnya (AOAC, 2012). Daun kering dihaluskan hingga membentuk bubuk dengan menggunakan blender atau grinder, dilewatkan pada saringan berukuran 40 mesh, dan disimpan pada wadah tertutup di suhu dingin agar senyawa bioaktifnya tidak rusak. Kemudian diukur kadar air bubuk dengan metode oven (AOAC, 2012). Pengukuran kadar air daun pepaya dan bubuk daun pepaya dilakukan 3 kali ulangan. Prosedur analisa kadar air dapat dilihat pada Lampiran 1.
Ekstraksi Etanolik Daun Pepaya
Proses ekstraksi daun pepaya menggunakan etanol 80% mengacu pada penelitian Vuong et al. (2015). Bubuk daun pepaya kering dimaserasi dalam etanol 80% selama 72 jam dan diletakkan dalam rotary shaker pada suhu ruang
dengan kecepatan 100-150 rpm. Filtrat dan larutan kemudian dipisahkan menggunakan penyaring vakum. Larutan etanol 80% dan ekstrak kemudian dipisahkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 50oC hingga terbentuk ekstrak kental.
Ekstraksi Saponin Daun Pepaya
Ekstraksi komponen saponin mengacu pada metode Ribeiro et al. (2013). Sebanyak 25 g bubuk daun pepaya tua atau muda didefatting menggunakan soxhlet
extractor (BUCHI, Switzerland) dengan pelarut n-hexan (Merck, Darmstadt,
Germany) selama 6 jam. Selanjutnya diekstraksi dengan metode Ultrasonic-Assisted Extraction (UAE). Menurut Cheok et al. (2014), ekstraksi menggunakan metode
ultrasound assisted extraction (UAE) efektif digunakan untuk mengekstrak
senyawa bioaktif. Untuk UAE dilakukan selama 30 menit, suhu 60oC, dan rasio 25 mL/g, dengan pelarut 50% EtOH:H2O (1:1,v/v) (Shuna et al. 2007) pada frekuensi 40 kHz. Setelah UAE selesai, kemudian disaring menggunakan pompa vakum pada suhu 50ºC dan dikeringkan dengan rottary evaporator (v-700; BUCHI, Rotavapor R-3) dibawah tekanan dan pada suhu 50oC sampai 2/3 volume awal, kemudian ekstrak di cuci dengan kloroform 20 mL (3x cuci). Selanjutnya dipartisi dengan BuOH:H2O (1:1) sebanyak 3x dan dicuci dengan NaOH 1% untuk memisahkan fraksi butanol dan fraksi air. Lapisan BuOH yang diperoleh, diambil dan selanjutnya dipekatkan dengan rotavapor pada kondisi vacum (Mostafa et al.,
17 Pengukuran Kadar Saponin dan Analisa Kualitatif Fitokimia Ekstrak
Pengukuran kadar saponin mengacu pada metode Vuong et al. (2013), 0.5 mL sampel, ditambahkan 0,5 mL 8% (b/v) vanilin dan dicampur dengan H2SO4 pekat (77%) kemudian diinkubasi pada waterbath (60oC) selama 15 menit. Setelah diinkubasi, larutan didinginkan pada es hingga suhu ruang kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV/VIS pada panjang gelombang 560 nm. Untuk pembuatan kurva standar, dibuat seri pengenceran standar saponin (Erg. B6), selanjutnya diambil 0.5 mL larutan standar pada setiap seri pengenceran dan diberi perlakuan yang sama seperti pada sampel. Analisa fitokimia dilakukan untuk mengetahui senyawa apa saja yang ada di dalam ekstrak antara lain yaitu senyawa fenol, tannin, flavonoid, alkaloid, steroid dan terpenoid (Harborne, 2006). Prosedur analisa fitokimia secara kualitatif dapat dilihat pada Lampiran 2.
Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum
Sebelum Penentuan KHM, dilakukan persiapan isolat S. aureus dan isolat
A.niger. Satu ose (loop) kultur murni mikroba uji dari Trypticase Soy Agar (TSA) miring yang dipelihara pada suhu 4oC, diinokulasi secara aseptis ke 10 mL Brain Heart Infution Broth (BHIB) dan diinkubasi pada suhu 35°C selama 18 - 24 jam. Suspensi bakteri selanjutnya digores pada TSA dan diinkubasi pada suhu 35°C ± 2°C selama 48 jam. Koloni tunggal ditransfer ke 10 mL Trypticase Soy Broth (TSB) dan diinkubasi pada suhu 35°C ± 2°C selama 18 - 24 jam. Kultur ini (kultur kerja) yang digunakan untuk pengujian antibakteri. Untuk persiapan isolat
A.niger, satu ose (loop) kultur murni diremajakan pada media Potato Dextrose Agar (PDA) miring kemudian diinkubasi pada suhu 25-28oC selama 5 hari
sebelum dipanen sporanya guna dipaparkan dengan saponin (Mostafa et al., 2013).
Penentuan KHM pada S. aureus dilakukan dengan metode pengenceran
makro. Isolat S. aureus berumur 18 - 24 jam pada media TSB disentrifugasi pada
10000 rpm selama 5 menit dan pelet bakteri disuspensikan pada garam fisiologis 0.85%. Sebanyak 100 l suspensi S. aureus berumur 18-24 jam dengan
konsentrasi awal 106 diinokulasikan ke dalam 1 mL media TSB yang mengandung ekstrak saponin daun pepaya pada berbagai konsentrasi. Kultur bakteri kemudian diinkubasi pada 37°C selama 24 jam dan digoyang dengan kecepatan 150 rpm. Selanjutnya, dibuat seri pengenceran dari kultur bakteri pada setiap konsentrasi (100, 50, 25, 12.5, 0 mg/mL) ekstrak saponin dan disebar pada media TSA. Media tersebut diinkubasi pada 37°C selama 48 jam dan dilakukan penghitungan jumlah bakteri. KHM90 merupakan konsentrasi ekstrak kasar saponin daun pepaya terendah yang dapat menghambat 90% pertumbuhan bakteri dibandingkan dengan jumlah awal inokulum (Fazeli dan Salehi, 2007).
Penentuan KHM pada spora kapang dilakukan dengan metode Agar dilution plate. A. niger yang sudah disegarkan pada media PDA dan berumur 5
18
satu plate dan diinkubasi pada suhu 27oC selama 3 hari, dan kemudian dihitung jumlah spora yang tumbuh.
Pengukuran Tingkat Kerusakan (Imelda et al., 2014)
Pada penelitian ini, pengukuran kerusakan sel bakteri S. aureus dan spora
A. niger hanya diamati pada tingkat kerusakan sel secara fisik yakni dengan pengukuran kebocoran sel dan spora. Kultur S. aureus sebanyak 100 mL diambil
dan dituangkan pada TSB steril dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Untuk A.niger setelah disegarkan di media PDA dipanen spora nya dengan menambahkan 9 mL peptone physiological salt solution (8,5 g/L NaCl with 1 g/L bacteriological peptone (Oxoid Ltd) + 0,1% Tween 80), dan disaring menggunakan nylon filter. Selanjutnya kultur dan suspensi spora disentrifugasi pada 10000 rpm selama 5 menit, dan kemudian diresuspensi pada larutan sodium klorida steril (0.85 g/100 mL). Suspensi diencerkan hingga konsentrasi mencapai 109 CFU/mL untuk S. aureus dan 106 SFU/mL untuk A. niger. Ekstrak dituang pada masing-masing tube yang akan diuji yang berisi 4 mL suspensi bakteri atau spora. Suspensi tersebut diinkubasi pada 37oC selama 0, 2, 4, 6 jam untuk S. aureus dan 27oC selama 0, 6, 18 dan 24 jam untuk A. niger. Setelah diinkubasi,
kultur disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit dan pelet dihilangkan. Absorbansi supernatan diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm menggunakan UV-Vis spektrofotometer (Shimadzu UV-1800, Jepang) (Oonmetta-aree et al., 2006 dengan modifikasi).
Deteksi Kebocoran Membran Sel dengan DNA Probe Staining (Arum et al.,
2014)
Suspensi mikroba uji yang telah dipaparkan ekstrak saponin daun pepaya disentrifugasi untuk memperoleh pelet mikroba uji. Selanjutnya pelet mikroba uji dibilas sebanyak tiga kali dengan larutan garam fisiologis. Pewarna fluoresens, yaitu 0,2 mL SYBR green dan 0,2 mL 0,01 mg/mL Probidium Iodida (PI) ditambahkan ke pelet mikroba dan diinkubasi selama 15 menit pada kondisi gelap dan suhu ruang (28oC). Satu tetes suspensi mikroba yang telah diwarnai diteteskan di atas kaca objek dan ditutup dengan cover glass. Pengamatan dilakukan
menggunakan mikroskop fluoresens. Pelet mikroba yang tidak dipaparkan dengan ekstrak juga diwarnai sebagai kontrol.
Deteksi Kebocoran Material Sitoplasma (Oonmetta-aree et al., 2006 dengan modifikasi)
19
Prosedur Analisis Data
Data yang diperoleh dari hasil pengujian sebanyak 3 ulangan diolah secara statistik menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA) pada tingkat kepercayaan 95% (taraf signifikan 0,05). Jika hasil uji berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji Duncan. Software yang digunakan adalah IBM SPSS Statistik 22. Hasil
dilaporkan sebagai nilai rata-rata ± standar deviasi (SD).
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak Kaya Saponin dari Daun Pepaya
Pada tahap awal penelitian, untuk mendapatkan ekstrak kaya saponin dilakukan beberapa proses yakni pengambilan daun pepaya, pencucian, pengeringan, pengecilan ukuran daun pepaya, fraksinasi hingga mendapatkan ekstrak kaya saponin. Daun pepaya yang digunakan yakni daun pepaya muda dan tua yang diperoleh dari PKHT dengan umur tanam 18 bulan. Daun muda yaitu daun yang tumbuh 3 lapis atas dan daun tua yakni daun yang tumbuh pada 3 lapis bawah. Pada tahap awal ini diukur kadar air daun pepaya untuk mengetahui rendemen ekstrak yang dihasilkan. Dari pengukuran kadar air daun pepaya segar muda dan tua tersebut diperoleh hasil yaitu sebesar 85,59 ± 0,11% dan 81,76 ±09,04%. Waktu pemetikan yang berbeda mampu mempengaruhi kadar air daun, karena daun yang dipetik siang hari kemungkinan besar sudah terkena sinar matahari dibandingkan yang dipetik pagi hari. Pada penelitian ini, daun pepaya diambil di pagi hari yaitu antara jam 5.30–06.00 WIB. Penelitian lain yang mengukur kadar air daun pepaya dilakukan oleh Nowfia et al. (2012),
menyebutkan kadar air daun pepaya segar sebesar 81.27–85.17%, hasil pengukuran tersebut hampir sama dengan hasil pengukuran pada penelitian ini. Faktor yang mempengaruhi nilai kadar air daun pepaya selain yang disebutkan sebelumnya, bagian daun dan varietas daun pepaya juga sangat berpengaruh.
20
namun tidak merusak saponin yang ada pada daun, karena saponin masih stabil pada suhu 60oC (Du et al, 2014)
Daun pepaya yang sudah kering, selanjutnya di defatting dengan menggunakan soxhlet extractor dan pelarut n-hexan. Tujuan dari proses ini yakni untuk menghilangkan lemak yang ada pada daun pepaya. Lemak yang ada pada daun akan menghambat proses ekstraksi saponin (Ribeiro et al., 2013). Tahapan selanjutnya, daun diekstrak dengan menggunakan pelarut polar metanol dan etanol. Pemilihan dua macam pelarut ini dikarenakan dua macam pelarut tersebut menghasilkan rendemen yang cukup tinggi (Du et al, 2014). Metode ekstraksi menggunakan UAE sering diaplikasi pada ekstraksi komponen bioaktif dari herbal, industri dan pengolahan pangan (Soria dan Villamel, 2010) karena efektif dan efisien. Setelah diultrasonikasi selama 30 menit, padatan dan ekstrak dipisahkan dengan kertas saring dan dirotavapor pada kondisi vakum pada suhu 50oC untuk menghilangkan pelarut. Proses rotavapor dilakukan hingga 2/3 volume awal ekstrak. Pada proses ekstraksi tersebut diperoleh saponin dan senyawa aktif lainnya, sehingga selanjutnya ekstrak dicuci dengan kloroform dan dipartisi dengan butanol. Pada tahap ini diperoleh ekstrak kasar yang masih banyak mengandung glikosida, saponin dan flavonoid. Dengan demikian, diperlukan larutan sodium hydrooksida 1% untuk menghilangkan fenolikglikosilat dan air untuk menetralkan. Selanjutnya ekstrak yang telah dicuci tersebut dirotavapor pada suhu 50oC dengan kondisi vakum untuk menguapkan butanol, dan dikeringkan dengan menggunakan freez dryer sehingga diperoleh ekstrak kaya saponin (Ribeiro et al., 2013).
21 Ekstrak etanolik pada Gambar 12 merupakan ekstrak yang diperoleh dari daun pepaya tanpa defatting yang diekstrak menggunakan etanol secara maserasi (Vuong et al., 2015), tanpa ada tahapan pencucian dengan kloroform dan partisi
butanol. Tujuan adanya ekstrak etanolik ini yaitu untuk membandingkan rendemen dan kemurnian ekstrak kaya saponin yang dihasilkan. Dari Gambar 12 tersebut terlihat bahwa rendemen tertinggi yakni rendemen ekstrak etanolik, hal ini dikarenakan pada ekstrak tersebut masih banyak mengandung senyawa aktif lain selain saponin. Untuk mengetahui kemurnian senyawa yang diperoleh, pada penelitian ini dilakukan uji kualitatif dan kromatografi lapis tipis (KLT). Hasil pengujian kualitatif dari ekstrak dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Hasil uji fitokimia ekstrak kaya saponin dan ekstrak etanolik
No. Senyawa Ekstrak mengandung steroid dan saponin, sedangkan ekstrak etanolik masih mengandung berbagai senyawa bioaktif. Tahapan ekstraksi sangat berpengaruh pada senyawa akhir yang dihasilkan, pada tahapan pencucian dengan kloroform dan partisi butanol serta pencucian dengan sodium hidrooksida dan air mampu menghilangkan senyawa fenolik, tanin dan alkaloid. Selain itu, dari Tabel 5 tampak ekstrak kaya saponin masih mengandung saponin dan steroid. Hal ini menunjukkan bahwa tahapan ekstraksi yang dilakukan efektif memperoleh saponin. Adanya senyawa steroid pada ekstrak kaya saponin ini menunjukkan bahwa saponin yang ada pada daun pepaya yakni saponin dari golongan steroid bukan triterpenoid. Saponin diklasifikasikan menjadi 2, yaitu: saponin steroid dan saponin triterpenoid. Saponin steroid tersusun atas inti steroid (C-27) dengan molekul karbohidrat. Saponin steroid dihidrolisis menghasilkan suatu aglikon yang dikenal sebagai saraponin. Saponin triterpenoid tersusun atas inti triterpenoid dengan molekul karbohidrat yang dihidrolisis menghasilkan suatu aglikon yang disebut sapogenin (Morrissey dan Osbourn, 1999), kemungkinan besar saponin pada daun pepaya yaitu saraponin.
22
sebagai metode pemisahan yang sederhana, cepat dan murah serta dapat digunakan untuk kajian identifikasi tentatif dan visual semi kuantitatif dari berbagai zat. Dibandingkan teknik kromatografi lainnya, KLT adalah teknik analisis sampel yang simultan, fleksibel dan serbaguna serta penggunaan sampel dan pelarut yang minimal (Striegel dan Hill, 1996). Fase gerak (mobile phase) dalam KLT sering disebut eluen dipilih berdasarkan polaritas senyawa. Eluen umumnya merupakan campuran beberapa pelarut dengan perbandingan atau rasio tertentu yang dipilih dengan cara trial and error. Kepolaran eluen sangat mempengaruhi Rf yang diperoleh. Semakin nonpolar suatu pelarut atau campuran pelarut maka akan semakin jauh pelarut tersebut menggerakkan senyawa polar naik pada plat silika (Watson, 2007). Fase diam yang umum digunakan adalah silika gel baik pada plat kaca maupun plat aluminium foil, adsorben lain yang dapat digunakan dalam KLT adalah alumina, serbuk selulose, serbuk poliamida, sephadex, celite dan kieselguhr. Pada penelitian ini sebagai fase diam yang digunakan adalah plat aluminium foil dengan adsorben silika gel 60 GF254 yang bersifat polar dan telah mengandung indikator fluoresen yang tereksitasi dibawah sinar UV pada panjang gelombang ( ) 254 nm. Adanya gugus fungsional –OH pada permukaan silika gel dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang memiliki polaritas rendah sampai tinggi.
Gambar 13. Kromatogram pengamatan dengan lampu UV (kiri) dan tanpa UV (kanan) (a) KLT ekstrak etanolik (Kloroform:EtOH:H2O 10:3:1) (b) KLT ekstrak etanolik (Kloroform:EtOH:H2O 17:3:1) (c) KLT
ekstrak kaya saponin (Kloroform:EtOH:H2O 10:3:1) (d) KLT
ekstrak kaya saponin (Kloroform:EtOH:H2O 17:3:1) (e) KLT standar
saponin Erg B6 (Kloroform:EtOH:H2O 17:3:1)
Hasil KLT pada Gambar 13, terlihat eluen Kloroform:EtOH:H2O dengan
perbandingan 10:3:1 belum dapat memisahkan fraksi ekstrak dengan sempurna ditunjukkan dengan belum terbentuknya spot. Pada eluen yang terpilih Kloroform:EtOH:H2O (17:3:1), diperoleh hasil setelah diamati dibawah lampu UV
pada 366 nm menunjukkan lima spot pada ekstrak etanolik dan hanya 1 spot pada
ekstrak kaya saponin. Hasil yang diperoleh pada ekstrak etanolik memiliki nilai Rf sebagai berikut: Rf1 = 1,2; Rf2 = 1,7; Rf3 = 3,7; Rf4 = 5,6; Rf5 = 6,1. Pada ekstrak kaya saponin hanya terdapat satu spot dengan Rf= 5,7.
Dari hasil KLT tersebut juga diketahui bahwa standar saponin yang ditotolkan pada plat dan diamati di bawah lampu UV tampak hanya ada satu spot dengan Rf= 5,9 dan berwarna hitam gelap. Ekstrak kaya saponin yang dihasilkan
23 mendekati murni karena hanya terbentuk satu spot dan terlihat seperti standar saponin yang ditotolkan pada plat, sedangkan ekstrak etanolik menghasilkan 5 spot yang warnanya berbeda-beda. Perbedaan nilai Rf pada ekstrak kaya saponin dan standar saponin kemungkinan dikarenakan perbedaan kejenuhan dalam wadah yang digunakan sehingga laju senyawa saponin pada plat juga berbeda.
Gambar 14. Kadar saponin pada ekstrak daun pepaya
Selain secara kualitatif, ekstrak kaya saponin juga diukur kadar saponinnya secara kuantitatif. Hasil pengukuran tersebut dapat dilihat pada Gambar 14. Pada grafik terlihat kadar saponin pada ekstrak kasar etanol lebih sedikit dibandingkan dengan ekstrak kaya saponin dengan pelarut etanol maupun metanol. Hal tersebut menunjukkan dalam ekstark etanol masih terdapat senyawa bioaktif lainnya selain saponin, namun pada ekstrak kaya saponin kemungkinan besar hanya terkandung senyawa saponin. Selain itu kadar saponin pada ekstrak kaya saponin dengan pelarut metanol lebih rendah dibanding etanol, hal ini dikarenakan saponin lebih terlarut pada etanol dibandingkan dengan metanol sehingga saponin yang diperoleh lebih tinggi. Menurut penelitian Vuong et al. (2013), ekstraksi komponen kasar saponin pada daun pepaya dengan menggunakan pelarut etanol 80% menghasilkan total saponin sekitar 368 mg aescin/g ekstrak. Jika dibandingkan dengan hasil penelitian Vuong et al. (2015), pada penelitian ini diperoleh hasil yang lebih tinggi (587 mg saponin/g ekstrak), hal tersebut kemungkinan dikarenakan tahapan proses ekstraksi dan sampel yang digunakan berbeda. Dari hasil tersebut juga diketahui bahwa metode ekstraksi saponin dengan partisi butanol mampu menaikkan 5 kali kadar saponinnya dibandingkan hanya dengan ekstraksi menggunakan etanol. Hasil perhitungan kadar saponin pada daun segar yaitu sebesar 7,01 mg saponin/g daun segar (daun muda) dan 7,26 mg saponin/g daun segar (daun tua). Hasil tersebut jika dibandingkan dengan kadar saponin pada tanaman lain cukup tinggi. Pada penelitian Dini et al. (2009) kadar saponin pada tanaman Ipomea batatas tubers sebesar 200,1 mg saponin/100 g ekstrak etanolik, sedangkan pada penelitian Man et al. (2010) kadar saponin pada tanaman Paris fargesi sebesar 19,5 mg saponin/g ekstrak etanolik dan pada Trillium plants sebesar 11,7 mg saponin/g ekstrak etanolik.
24
Aktivitas Antimikroba Ekstrak Kaya Saponin dari Daun Pepaya
Staphylococcus aureus
Pada penelitian ini ekstrak kaya saponin diujikan pada bakteri S. aureus dan A. niger yang merupakan bakteri patogen dan kapang perusak pangan. Dari pengamatan zona hambat ekstrak kaya saponin dengan menggunakan metode cakram diperoleh zona hambat yang ditunjukkan dengan adanya zona jernih pada sekitar cakram. Hasil tersebut dapat dilihat pada Gambar 15, pada pelarut sebagai kontrol negatif (aquades steril) menunjukkan tidak adanya penghambatan pada bakteri S. aureus, namun pada ekstrak dengan konsentraasi 25 mg/mL dan 50
mg/mL menunjukkan penghambatan dengan diameter zona hambat yakni sebesar 14,11 mm dan 16,04 mm. Ekstrak kaya saponin pada konsentrasi 12,5 mg/mL menunjukkan adanya zona hambat namun cukup kecil sehingga tidak terlihat. Hasil tersebut menunjukkan, semakin tinggi konsentrasi ekstrak, maka penghambatannya pun semakin besar ditandai dengan adanya diameter zona hambat yang tinggi. Semakin tinggi konsentrasi, maka semakin banyak senyawa saponin yang mampu menghambat pertumbuhan S aureus dan juga sebaliknya,
semakin kecil konsentrasi maka semakin sedikit saponin yang menghambat pertumbuhan S. aureus. Dari hasil pengamatan zona hambat ini, maka pengujian aktivitas antimikroba ekstrak kaya saponin daun pepaya dilanjutkan pada penentuan nilai konsentrasi hambat minimum (KHM) pada bakteri S aureus.
Gambar 15. Zona hambat ekstrak kaya saponin pada S. aureus
Pada penelitian Rahman et al., 2011, diameter zona hambat ekstrak etanolik
dari daun pepaya sudah terlihat pada konsentrasi 10 mg/ml sebesar 15 mm, hasil tersebut jika dibandingkan dengan ekstrak kaya saponin maka kemampuan penghambatannya jauh lebih besar dikarenakan ekstrak etanolik senyawa bioaktifnya lebih banyak sehingga kemampuan sebagai antimikrobanya lebih tinggi.
0 mg/mL
12,5 mg/mL 25mg/mL
25
Gambar 16. Nilai KHM ekstrak kaya saponin terhadap S. aureus
Berdasarkan hasil pengamatan zona hambat, pada pengamatan nilai KHM ditentukan seri konsentrasi ekstrak kaya saponin yang digunakan yakni 0; 1,2; 2,5; 5; 10; 20 mg/mL. Hasil penentuan nilai KHM dapat dilihat pada Gambar 16. Dari hasil tersebut diketahui bahwa jumlah awal mikroba yang digunakan sebelum dipaparkan dengan ekstrak yakni sebesar 106 atau 5,6 log CFU/mL. Dan nilai KHM diperoleh pada konsentrasi sebesar 20 mg/mL dimana pada konsentrasi tersebut mengalami penurunan dari jumlah awal setelah dipaparkan selama 24 jam. Jumlah bakteri yang tumbuh setelah dipaparkan ekstrak kaya saponin yakni sebesar 3,8 log CFU/mL, dimana jumlah awal bakteri sebelum dipaparkan yaitu 5,6 log CFU/mL sehingga terjadi penurunan jumlah bakteri yang tumbuh berkisar 1.8 log CFU. Seperti yang diketahui bahwa nilai KHM ditentukan berdasarkan konsentrasi yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri sebesar 1 log CFU.
Pada konsentrasi ekstrak 10 mg/mL sebenarnya mampu menghambat bakteri S aureus namun belum mencapai hingga 1 log CFU, maka belum dapat
dikatakan sebagai nilai KHM. Dari hasil tersebut maka dapat dikatakan bahwa senyawa saponin dari daun pepaya efektif menghambat pertumbuhan bakteri S aureus dan berpotensi sebagai senyawa antimikroba alami. Nilai KHM yang
diperoleh hampir sama dengan penelitian yang dilakukan oleh Ribeiro et al.
(2013), dimana nilai KHM saponin dari tanaman Jua dan Sisal pada bakteri S. aureus yaitu >12.5 mg/mL, namun berbeda dengan penelitian Hassan et al. (2010)
yang memperoleh nilai KHM dari ekstrak saponin Guar Mill sebesar 3.13 mg/mL. Perbedaan hasil tersebut dikarenakan perbedaan jenis saponin yang diujikan. Tanaman yang berbeda memiliki jenis saponin yang berbeda dan aktifitas antimikrobanya berbeda pula.
Aspergillus niger
Kemampuan ekstrak kaya saponin dalam menghambat pertumbuhan A niger
ditunjukkan pada pengamatan secara kualitatif dimana A. niger dipaparkan dengan ekstrak kaya saponin dan ditumbuhkan pada media pertumbuhan Potato Dextrose Broth (PDB). Hasil tersebut dapat dilihat pada Gambar 17, semakin tinggi konsentrasi ekstrak kaya saponin, maka hifa yang terlihat semakin sedikit /
26
tipis, menandakan bahwa semakin sedikit spora yang mampu bergerminasi. Bila spora rusak, maka spora yang bergerminasi semakin sedikit dan hifa yang terbentuk semakin tipis. Hasil yang hampir serupa juga terlihat pada Gambar 18,
pada konsentrasi 0 – 12,5 mg/mL seluruh spot (18) dapat tumbuh, sedangkan pada konsentrasi 25 hanya 12 spot yang tumbuh dan 3 spot yang mampu tumbuh pada media dengan konsentrasi ekstrak saponin sebesar 50 mg/mL dan tidak ada yang tumbuh pada konsentrasi 100 mg/mL. Seperti yang dikatakan oleh Morrissey dan Osbourn (1999), saponin dapat membentuk kompleks dengan sterol yang ada pada membran sel sehingga mengganggu permeabilitas sel. Saponin yang ada pada media pertumbuhan spora kemungkinan dapat mengganggu membran spora
A. niger, sehingga spora A. niger tidak mampu tumbuh pada media yang mengandung saponin pada konsentrasi tertentu.
Gambar 17. Pemaparan A niger. dengan ekstrak kaya saponin dengan berbagai
konsentrasi pada media pertumbuhan PDB selama 24 jam
Gambar 18. Agar Dilution Test spora A. niger dengan konsentrasi Ekstrak kaya saponin (a) 0 mg/mL (b) 6 mg/mL (c) 12,5 mg/mL (d) 25 mg/mL (e) 50 mg/mL (f) 100 mg/mL
Dari hasil penelitian, maka nilai KHM ekstrak kaya saponin daun pepaya pada spora kapang A. niger yaitu sebesar 50 mg/mL dimana pada konsentrasi
tersebut hanya ada 2 spot yang mampu tumbuh. Menurut Hammer et al. (1999),
nilai KHM ditentukan berdasarkan konsentrasi terendah yang menghambat pertumbuhan mikroba (tidak ada mikroba yang tumbuh, 1-2 koloni diabaikan). Nilai KHM yang diperoleh berbeda dengan hasil pada penelitian yang dilakukan oleh Ribeiro et al. (2013), dimana nilai KHM saponin dari tanaman Jua dan Sisal
27 jauh tersebut dikarenakan kemungkinan jenis saponin yang berbeda serta metoda penentuan nilai KHM yang berbeda. Pada umumnya daya hambat ekstrak pada spora kapang diamati dengan membandingkan panjang hifa yang tumbuh, namun pada penelitian kali ini peneliti mencoba menggunakan metode agar dilution test
yang biasanya digunakan untuk pengamatan nilai KHM dari bakteri. Metode yang digunakan tersebut ternyata menunjukkan hasil yang cukup baik, dimana terlihat perbedaan yang signifikan antar perlakuan.
Pengaruh Ekstrak Kaya Saponin dari Daun Pepaya terhadap Membran
S. aureus dan Spora A. niger
Dalam penelitian juga menganalisa bagaimana pengaruh ekstrak kaya saponin mampu menghambat pertumbuhan S. aureus dan spora A. niger dengan mengamati kerusakan yang mungkin terjadi pada membran sel bakteri dan spora kapang. Membran sel atau sering disebut sebagai membran plasma merupakan membran yang menyelubungi sitoplasma dengan komponen utama lipid bilayer yang terdiri dari phospholipid dan protein. Membran plasma berperan penting dalam melindungi sel dari lingkungannya dan bersifat selektif permeabel yang berperan dalam sistem transportasi nutrisi dan ekskresi produk – produk limbah (Silhavy et al., 2010). Reaksi komponen bioaktif ekstrak tanaman dengan membran sel dapat mengubah permeabilitas membran sitoplasma sehingga mengakibatkan kebocoran nutrisi dalam sel yang berakibat pada terhambatnya transpor substrat (Burt, 2004). Bocornya membran sitoplasma bersifat dapat pulih dan dapat dideteksi dengan adanya perubahan jumlah asam nukleat dan protein dalam medium akibat terlepasnya material sitoplasma. Kebocoran membran sitoplasma dianalisa dengan penentuan material sel termasuk protein, asam nukleat, metabolit dan ion-ion yang diserap pada 260 nm (Liu et al. 2004; Oonmetta-aree et al. 2006; Xing et al. 2009) dan 280 nm (Henie et al. 2009).
Gambar 19. Absorbansi supernatan S. aureus yang dipaparkan ekstrak kaya
saponin dengan konsentrasi 0, 5 dan 10 mg/mL pada (a) 260 dan (b) 280 nm
28
selisih antara absorbansi suspensi S. aureus setelah terpapar ekstrak kaya saponin daun pepaya dengan absorbansi suspensi kontrol S. aureus (tidak terpapar ekstrak kaya saponin daun pepaya). Δ absorbansi terus meningkat sampai jam ke 4, namun setelah itu tidak terjadi peningkatan. Hal ini menandakan bahwa adanya kerusakan parah pada membran sitoplasma bakteri uji (Carson et al. 2002). Membran sitoplasma adalah komponen struktural yang mungkin menjadi rusak dan secara fungsional tidak berfungsi ketika suspensi bakteri terpapar senyawa antimikroba. Jika membran sel terganggu, ion kecil seperti K+ dan PO43- cenderung untuk keluar pertama diikuti oleh
molekul besar seperti DNA, RNA dan material lain (Shan et al. 2008; Xing et al. 2009).
Seperti pada absorbansi pada panjang gelombang 260 nm, peningkatan absorbansi dimulai pada jam ke 2. Protein dengan cincin aromatik seperti asam amino tirosin dan triptofan diketahui menyerap sinar UV pada 280 nm. Besarnya protein dengan cincin aromatik pada material sitoplasma yang keluar dari sel dapat diketahui dari Δ absorbansi, yaitu selisih antara absorbansi S. aureus setelah terpapar ekstrak dengan absorbansi suspensi kontrol S. aureus yang tidak terpapar ekstrak. Δ absorbansi terus meningkat sampai jam ke 4, namun setelah itu tidak terjadi peningkatan yang berarti. Hasil ini menunjukkan penambahan ekstrak kaya saponin mengganggu permeabilitas membran sel yang menginduksi kebocoran material sitoplasma. Distorsi struktur fisik sel akan menyebabkan ekspansi dan destabilisasi membran yang pada gilirannya akan meningkatkan permeabilitas pasif dan kebocoran berbagai material intraseluler penting termasuk ion, ATP, asam nukleat dan asam amino (Shan et al. 2008).
Gambar 20. Absorbansi supernatan A. niger yang dipaparkan ekstrak kaya
saponin dengan konsentrasi 0, 25 dan 50 mg/mLpada (a) 260 dan (b) 280 nm
