TUGAS BIOTEKNOLOGI KELAS B
Oleh : Atika Sari Dyah P.
132210101050
SOAL :
1. Apa perbedaan dari macam-macam vektor : • Plasmid
• Bakteriofaga • Cosmid
• Yeast Artificial Chromosom
2. Apa fungsi dari vektor pRSET A,B,C dan pEASY’T ?
JAWABAN :
1. A. Plasmid
Plasmid adalah DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu makhluk hidup, berbentuk pita ganda sirkular. Sebuah vektor plasmid dapat dibuat secara alami dan buatan. Plasmid buatan dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain, sedangkan plasmid alami dari segmen-segmen yang tidak perlu dihapus dan urutan DNA yang ingin dikode disisipkan. Untuk mengkloning sebuah sampel DNA, enzim restriksi yang sama harus digunakan untuk memotong kedua vektordan sampel DNA. Oleh karena itu, vektor biasanya berisi urutan (polylinker) yang dapat mengenali beberapa enzim restriksi sehingga vektor dapat digunakan untuk kloning berbagai sampel DNA.
Plasmid polylinker dan Gen penanda untuk skrining biru-putih
Koloni dengan plasmid rekombinan yang putih, dan koloni dengan plasmid non rekombinan berwarna biru. Contoh: pUC19
Keuntungan Kerugian
Kecil, mudah pengerjaannya Strategi seleksi mudah
Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran kecil (< 10kbp)
Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)
B. Bakteriofag
Bakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning pada sel inang bakteri. Kegunaannya adalah untuk konstruksi kloning gen. Bacteriophage ini dapat dengan mudah untuk bereplikasi serta dimanupulasi saat di laboratorium. Bacteriophage juga mempunyai fragmens sekitar lima ribu pasang basa.
Keuntungan Kerugian
efisiensi transformasi yang tinggi, sekitar 1000 kali lebih efisien daripada vektor plasmid Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (10 - 23 kbp)
Seleksi berdasarkan ukuran
Lebih sulit pengerjaannya
C. Cosmid
Cosmid adalah kombinasi dari plasmid vektor dan situs COS yang memungkinkan target DNA untuk dimasukkan ke dalam kepala λ-fage. Kegunaannya adalah untuk pemasukan/pegumpulan kromosom ke dalam kepala fag dan memanfaatkan pula urut-ƛ urutan (bagian tengah cosmid) untuk fungsi resistensi terhadap antibiotik serta replikasi. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32 hingga 47 kb menjadikan cosmid lebih menguntungkan daripada fag l dan plasmid.
Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)
Seleksi berdasar ukuran Pengerjaan seperti plasmid
Tidak terlalu mudah untuk
mengerjakan plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)
D. Vektor YAC (Ye a s t A r t i f i c i a l C h r o m o s o m e )
YAC adalah romosom ragi buatan, vektor mampu membawa fragmen
DNA besar (hingga 2 Mb), tetapi efisiensi transformasi sangat rendah. Penggunaan Yeast Artificial Chromosome (YAC), sangat membantu dalam konstruksi peta fisik genom kompleks secara lengkap. YACs dapat membawa fragmen DNA genomik sepanjang lebih dari 1 Mb. Oleh karena itu, YACs dapat digunakan untuk meng-clone gen utuh manusia, misalnya gen penyandi cystic fibrosis yang panjangnya 250 kb. Dengan kemampuannya itu YACs sangat berguna dalam pemetaan genom manusia seperti yang dilakukan pada Human Genome Project.
Komponen penting vektor YAC, meliputi:
a) Sentromer (CEN), telomer (TEL) and sekuen untuk replikasi otonom (ARS = autonomous replicating sequence) untuk proliferasi di dalam sel inang.
b) ampr, amplifikasi spesifik dan sebagai marker / penanda bagi DNA TRP1 dan URA3 untuk mengidentifikasi sel yang mengandung vektor YAC.
c) situs yang dapat dikenal oleh enzim restriksi, contohnya EcoRI dan BamHI. Vecktor YAC dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast Vektor BAC
2. Perbedaan dari :
PERBEDAAN Vektor pRSET A,B,C pEASY-T1
FUNGSI Ekspresi ini diinduksi oleh T7 RNA polymerase di E.coli. Sel-sel ini juga memproduksi T7 lisozim untuk mengurangi ekspresi
basal gen target MARKA SELEKSI Ketahanan: antibiotik
ampicillin. Vektor ini bisa diseleksi dengan Ampicillin.
Ketahanan antibiotik kanamycin dan ampicillin serta seleksi biru putih (Lac Z).
a. Vektor pRSET A,B,C
Vektor pRSET dirancang untuk ekspresi prokariotik tingkat tinggi yang dikendalikan oleh promotor bkteriofag T7 yang kuat. Selain itu, sisipan DNA berada di posisi hilir (awal) dan berada dalam urutan yang mengkodekan fusi N-terminal peptida. Urutan ini mencakup ATG inisiasi terjemahan kodon yang menstabilkan urutan dari gen 10 dari fag T7, Xpress™ epitop, dan tempat pembelahan enterokinase.
Satu set ketiga vektor disediakan (A, B, dan C). Masing-masing memiliki N-terminal tag coding dengan urutan kerangka pembacaan yang relatif berbeda terhadap situs kloning beberapa untuk menyederhanakan di-frame kloning gen Anda. Mereka hanya berbeda dalam jarak antara urutan kode untuk peptida N-terminal dan beberapa situs kloning. Untuk ekspresi yang tepat, ditentukan dulu situs restriksi yang sesuai untuk ligase.
b. pEASY-T1
pEASY-T1 menyediakan metode yang sangat efisien untuk kloning Taq polymerase produk PCR secara langsung yang menghasilkan produk berupa vector plasmid. Ekspresi vektor ini memiliki T7 / lac kontrol promotor yang tepat, dan ekspresi ini memiliki kemampuan efisien yang tinggi. Ukuran insert fragmen 750 bp, dan protein tujuan adalah sekitar 27 kDa. Produk PCR tidak perlu pemurnian dan intisari enzim. Efisiensi kloning tinggi. Kontrol promotor ekspresi T7 / lac tepat. Protein rekombinan mudah dimurnikan oleh terminal 6xHis.
a. Ketahanan Antibiotik Ampisillin dan Kanamycin
Vektor pEASY-T1 resisten terhadap Ampisillin dan Kanamycin. Hal ini menunjukkan bahwa ketika vector diletakkan pada wadah yang dbieri antibiotik Ampisillin maka vector tersebut akan tetap hidup, begitu juga ketika diletakkan pada wadah yang diberi antibiotik Kanamisin maka akan tetap hidup pula karena vektor itu telah resisten terhadap antibiotik-antibiotik tersebut.
Kebanyakan vektor kloning modern, memiliki suatu MCS dalam gen lacZ. Gen ini dalam keberadaan suatu induser seperti IPTG (isopropil-β-Dtiogalaktosida) akan menghasilkan enzim β-galaktosidase, yang akan mengkonversi laktosa menjadi galaktosa dan glukosa. Enzim ini dalam kondisi normal akan disintesis oleh E.coli jika ada laktosa, dan merubah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa (Stryer, 2000).
Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC18/19 telah disisipi oleh DNA asing pada bagian gen lacZ. Dalam hal ini gen lacZ menjadi tidak berfungsi (tidak akan menghasilkan β-galaktosidase) karena telah disisipi DNA asing.
Terbentuknya koloni berwarna putih berarti sel kompeten membawa DNA rekombinan (DNA plasmid dan gen target). Adapun koloni berwarna biru berarti sel kompeten yang tumbuh membawa DNA plasmid saja (tidak disisipi gen terget).
Dengan kata lain, bila gen lacZ-nya rusak atau dirusak maka sel akan membentuk koloni yang berwarna putih. Jadi, dengan mata telanjang bisa disimpulkan bahwa apabila sel bakteri membentuk koloni berwarna biru berarti gen lacZ-nya masih berfungsi, sedangkan apabila koloninya berwarna putih gen lacZ-nya sudah rusak dan tidak berfungsi.
DAFTAR PUSTAKA :
Anonim. 2010. pRSET A, B, And C for High-Level Expression of Recombinant Proteins In E. Coli. Invitrogen. Cat. no . V351-20
Noviendri, Dedi. 2007.Teknologi Dna Rekombinan Dan Aplikasinya Dalam Eksplorasi Mikroba Laut. IPB. Bogor. 9 pp.