ISOLASI, KARAKTERISASI DAN OPTIMASI MEDIUM
PRODUKSI SENYAWA AKTIF KAPANG ENDOFIT
UNTUK MENGHAMBAT PROLIFERASI SEL
KANKER PAYUDARA MCF-7 SECARA
IN VITRO
ERWAHYUNI ENDANG PRABANDARI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi dengan judul ” Isolasi, Karakterisasi, dan Optimasi Medium Produksi Senyawa Aktif Kapang Endofit untuk Menghambat Proliferasi Sel Kanker Payudara MCF-7 Secara In Vitro” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Desember 2011
ERWAHYUNI ENDANG PRABANDARI. Isolation, Characterization and Medium Optimization for Production of Active Compound Produce by Endophytic Fungi Inhibiting Breast Cancer Cell MCF-7 Proliferation. Under direction of TUN TEDJA IRAWADI, WAHONO SUMARYONO, KHASWAR SYAMSU
An endophytic fungus is the fungus that lives in close association with living plant tissues. Medicinal endophytic fungi are one group of prospecting endophytic fungi. These fungi reported producing secondary metabolite which has structure and activity similar with the host plant. In this study; isolation, characterization and medium optimization for the production of active compound produced by endophytic fungi from medicinal plant originated from East Lombok, West Nusa Tenggara has been conducted. Seventy five endophytic fungi have been isolated from 34 medicinal plants that consist of 57 isolate from leave sample and 18 isolate from stem. The result showed that colonization endopyhitic fungi in leave (70%) was higher compared to stem (32%) from total samples. Thirty six isolates from total 75 isolates were screened for citotoxicity against Artemia salina using brine shrimp lethality test method. First screening using 1000 mg/L concentration of crude extract showed that 9 extracts were active out of 108 extracts assayed. Further screening for the 9 active extracts using LC50showed that ethyl acetate extract from fungus ENLT 74.3d.2 was the most active compared to the others with LC50of 30,21 mg/L. Fungus ENLT 74.3d.2 was isolated from Cibotium barometz and morphological descript as Curvularia lunata. This active fungus was deposited and labelled as BioMCC FE-00283. Active compound purification of endophytic fungi C. lunata BioMCC FE-00283 was conducted by bioassay guided. Preliminary bioassay of the extract and fractions was conducted by Brine Shrimp Lethality Test, while citotoxicity of the pure active compound was conducted by MTT assay against human carcinoma breast MCF-7 cell. First purification of active compound was done by coloumn cromatography using silica gel 60 as stationary phase and eluted by step gradient method using hexane, ethyl acetate, and methanol subsequently. Further purification was done by HPLC using C18 column and eluted by gradient system of acetonitril water from 15% up to 100% for 25 minutes. Bioassay showed that ethyl acetate fraction was the most active (LC50 = 4.69 mg/L), while the pure compound from HPLC on concentration 5 mg/L could inhibit 28 % proliferation of MCF-7. Elucidation of formula and structure using spectroscopy IR, LC-MS, 1H NMR, 13C NMR and MS-MS resulted that active compound of endophytic fungi C. lunata BioMCC FE-00283 is 8-hydroxy 9,12-octadecadienoic acid (8-HODE) which molecule formula is C18H32O3.Glucose, monosodium glutamate and corn oil were media components which showed significant effect toward 8-HODE production byC. lunata BioMCC FE-00283. Composition optimization of these three medium components was performed by RSM and full factorial CCD was used design the experiment. Maximum 8-HODE production predicted by the quadratic model was 11.78 mg/L; which was verified experimentally to be 10.78 ± 0.872 mg/L and had rendement (YP/S) 0.001. This maximum 8-HODE production reached in media composition that consist of 5.87 g/L glucose, 11.05 g/L monosodium glutamate and 1.00 ml/L corn oil. Eventhough experimentally verification showed lower result compared to model prediction, however it was higher compare to 8-HODE production using basal media which only reach concentration 0.491 ± 0.072 mg/L and rendemen 4.879 x 10-5. This verification showed that optimization increased 8-HODE production about 22 fold compared to un-optimized media.
ERWAHYUNI ENDANG PRABANDARI. Isolasi, Karakterisasi dan Optimasi Media Produksi Senyawa Aktif Kapang Endofit untuk Menghambat
Proliferasi Kanker Payudara MCF-7 SecaraIn Vitro. Dibawah bimbingan TUN TEDJA IRAWADI, WAHONO SUMARYONO, KHASWAR SYAMSU
Kapang endofit adalah kapang yang dalam periode waktu tertentu dalam siklus hidupnya mengkolonisasi jaringan hidup tanaman inangnya tanpa menimbulkan gejala apapun. Kapang endofit dari tanaman obat adalah salah satu kelompok kapang endofit yang mempunyai prospek bagus. Telah banyak dilaporkan bahwa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit mempunyai struktur dan khasiat yang menyerupai metabolit sekunder tanaman inangnya.
Dalam penelitian ini telah dilakukan rekayasa proses produksi senyawa aktif kapang endofit dari tanaman obat yang diambil dari Lombok Timur propinsi Nusa Tenggara Barat. Hasil isolasi menggunakan metode sterilisasi permukaan dan media Corn meal malt extract agar menghasilkan 75 isolat kapang endofit yang terdiri dari 57 isolat dari sampel daun dan 18 isolat dari sampel batang yang berasal dari 34 jenis tanaman obat. Hasil isolasi menunjukkan tingkat kolonisasi kapang pada daun mencapai 70% dari total sampel, sedangkan tingkat kolonisasi pada batang hanya 32% dari total sampel. Dari 75 isolat kapang yang berhasil diisolasi telah dilakukan penapisan sitotoksisitas terhadap 36 kapang hasil isolasi terhadap Artemia salinadengan menggunakan metodeBrine shrimp lethality test. Penapisan pertama dengan konsentrasi ekstrak 1000 mg/L mendapatkan 9 ekstrak aktif dari 108 ekstrak yang diuji. Penapisan lanjutan terhadap 9 ekstrak dengan menghitung LC50 menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat dari isolat ENLT 74.3d.2 adalah ekstrak yang menunjukkan aktivitas tertinggi dibandingkan ekstrak yang lain dengan LC50 sebesar 30,21 mg/L. Kapang ENLT 74.3d.2 diisolasi dari tanaman Cibotium barometz dan secara morfologi sesuai dengan deskripsi fungiCurvularia lunata.Isolated aktif disimpan dalam koleksi kultur dan diberi nomer BioMCC FE-00283.
lunata BioMCC FE-00283 adalah 8-hydroxy 9,12-octa decadionoic acid (8-HODE) dengan rumus molekul C18H32O3
Pengaruh sumber karbon, sumber nitrogen dan minyak nabati sebagai inducer produksi 8-HODE oleh C. lunata BioMCC FE-00283 telah dipelajari untuk dapat menentukan komposisi media produksi 8-HODE. Glukosa, monosodium glutamate dan minyak jagung adalah komponen media yang menunjukkan pengaruh nyata terhadap produksi 8-HODE oleh kapangC. lunata BioMCC FE-00283. Optimasi komposisi ketiga komponen media tersebut telah dilakukan dengan Metode Respon Permukaan (RSM). Rancangan faktorial penuh dengan Central Composite Design (CCD) dipilih sebagai rancangan percobaan agar dapat menjelaskan pengaruh interaksi antar komponen media. Produksi 8-HODE tertinggi yang diprediksi oleh model kuadratik mencapai konsentrasi 11,71 mg/L, yang pada verifikasi secara eksperimen menghasilkan 8-HODE dengan konsentrasi 10,78 ± 0,872 mg/L dan rendemen produk terhadap substrat (YP/S) sebesar 0,001. Produksi 8-HODE maksimum tersebut tercapai pada komposisi media yang terdiri dari glukosa 5,87 g/L monosodium glutamat 11,05 g/L dan minyak jagung 1,00 ml/L. Meskipun verifikasi secara eksperimen menunjukkan hasil yang lebih kecil dibandingkan dengan prediksinya (92%) akan tetapi hasil tersebut lebih tinggi dibandingkan dengan 8-HODE yang diproduksi pada media basal dengan konsentrasi 0,491 ± 0,072 mg/L dan rendemen 4,879 x 10-5. Hasil verifikasi ini menunjukkan bahwa optimasi meningkatkan produksi 8-HODE 22 kali lipat dibandingkan dengan sebelum dilakukan optimasi.
PRODUKSI SENYAWA AKTIF KAPANG ENDOFIT
UNTUK MENGHAMBAT PROLIFERASI SEL
KANKER PAYUDARA MCF-7 SECARA
IN VITRO
ERWAHYUNI ENDANG PRABANDARI
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Teknologi Industri Pertanian
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
HALAMAN PENGESAHAN
Judul Disertasi : Isolasi, Karakterisasi dan Optimasi Media Produksi Senyawa Aktif Kapang Endofit untuk Menghambat Proliferasi Kanker Payudara MCF-7 secaraIn Vitro Nama Mahasiswa : Erwahyuni Endang Prabandari
NIM : F361060092
Program Studi : Teknologi Industri Pertanian
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS Ketua
Prof. Dr. Wahono Sumaryono
Anggota Prof. Dr. Ir. Khaswar Syamsu, MScAnggota
Diketahui
Ketua Program Studi Teknologi Industri Pertanian
Dr. Ir. Machfud, MS
Dekan Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc Agr
Ujian tertutup pada :
Hari/tanggal : Senin/10 Oktober 2011 Penguji luar komisi pada ujian tertutup:
: Dr. Ir. Liesbetini Hartoto, MS
(Dosen Pengajar Departemen Teknologi Industri Pertanian, Institut Pertanian Bogor)
: Dr. Ir. Zainal Alim Mas’ud, DEA
(Dosen Pengajar Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor)
Ujian terbuka pada :
Hari/tanggal : Jumat/16 Desember 2011 Penguji luar komisi pada ujian terbuka:
: Dr. dr. Irma H. Suparto, MD, MS
(Dosen Pengajar Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor) : Dr. Bambang Marwoto, Apt. MEng.
KATA PENGANTAR
Puji Syukur kehadirat Allah SWT karena berkat rahmat dan hidayah-Nya karya ilmiah yang berjudul “Rekayasa Proses Produksi Senyawa Aktif dari Kapang Endofit Penghambat Proliferasi Kanker Payudara Secara In Vitro” berhasil diselesaikan dengan baik. Karya ilmiah ini disusun sebagai salah satu syarat menyelesaikan studi program doktor di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Penelitian yang telah dilakukan selama 4 (empat) tahun bertujuan secara umum untuk mendapatkan senyawa aktif dari kapang endofit yang bersifat antikanker.
Penulis mengucapkan terimakasih kepada Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS selaku ketua komisi pembimbing, Prof. Dr. Wahono Sumaryono dan Prof. Dr. Ir. Khaswar Syamsu, M.Sc selaku anggota komisi pembimbing atas bimbingan dan pengarahannya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini. Ucapan terima kasih juga saya sampaikan kepada Prof. Dr. Irawadi Djamaran selaku Ketua Program Studi Teknologi Industri Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan Dr. Ir. Machfud, MS sebagai penggantinya beserta jajarannya yang telah memberikan saran dan masukan pada proses penyelesaian penulisan disertasi ini.
Pertanian, Institut Pertanian Bogor atas bantuan dan peran serta dalam penyelesaian disertasi ini.
Rasa terima kasih yang sedalam-dalamnya juga penulis untuk seluruh keluarga yang telah memberikan segenap dukungannya. Kepada almarhumah Ibu tercinta, tiada kata yang bisa mewakili rasa terima kasih atas besarnya kasih sayang, kesabaran, dukungan dan motivasi demi kemajuan kami putra-putrinya. Kepada Mas Erwan dan keluarga yang dengan sabar selalu setia mendengarkan setiap keluhan
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih mempunyai keterbatasan. Kritik dan saran penulis harapkan dari semua pihak untuk perbaikan, dan semoga hasil penelitian ini dapat berguna bagi yang membutuhkan.
Bogor, Desember 2011
Erwahyuni Endang Prabandari NIM. F361060092
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Klaten pada tanggal 28 Desember 1969 dari ibu Sudariyah (Alm) dan ayah Projomintoro (Alm). Penulis merupakan anak ke-2 dari dua bersaudara.
Tahun 1988 penulis lulus dari SMA Negeri I Klaten, Jawa Tengah dan pada tahun yang sama masuk di Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Gadjah Mada melalui program PMDK dan lulus pada bulan Agustus 1993. Pada tahun 1994-1996 penulis bekerja di PT Hasil Kesatuan, perusahaan yang bergerak dibidang pengolahan minyak nabati sebagai staf Research and Development.Pada bulan Maret 1996 penulis diterima sebagai pegawai negeri di Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) dan ditempatkan di Pusat Pengkajian dan Penerapan Bioteknologi. Pada Tahun 2000 penulis mendapatkan beasiswa dari STAID untuk melanjutkan studi program S2. Pada tahun tersebut penulis melanjutkan studi program S2 di Program Studi Teknologi Industri Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Pada tahun 2003 penulis menyelesaikan studi S2 di Teknologi Industri Pertanian Bogor. Pada tahun 2006 penulis mendapatkan beasiswa dari Kementrian Negara Riset dan Teknologi untuk melanjutkan studi S3, dan mengambil studi di Program Studi Teknologi Industri Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Selama mengikuti mengikuti program S3, penulis telah mengikuti beberapa seminar nasional dan internasonal sebagai pemakalah selama studi di antara lain; National Indonesia Congress 10th Society for Microbiology an
KARYA ILMIAH YANG TELAH DIPUBLIKASI DI JURNAL
TERAKREDITASI
Optimasi Produksi Hydroxy Octadecadienoic Acid (HODE) dari Kapang Endofit Curvularia lunataBioMCC FE-00283 dengan Metode Respon Permukaan. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia (JIFI). Volume 9 No 1. April 2011. Hal 46-52. Diterbitkan oleh Fakultas Farmasi Universitas Pancasila.
Selection of Carbon and Nitrogen Source for Hydroxy Octadecadienoic Acid Production using Endophytic Fungi Curvularia lunata BioMCC FE-00283. Accepted. Journal of Microbiology Indonesia Diterbitkan oleh The Indonesian Society for Microbiology
Uji Sitotoksisitas Fraksi Aktif dan Senyawa Murninya yang Dihasilkan oleh Kapang Endofit Tanaman Obat dari Lombok Timur terhadap sel MCF-7. Accepted. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia (JIFI). Diterbitkan oleh Fakultas Farmasi Universitas Pancasila.
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ...……..………... xii
DAFTAR GAMBAR ………... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ….………... xv
DAFTAR SINGKATAN... xvii
PENDAHULUAN... 1
Latar belakang... 1
Tujuan Penelitian... 5
Hipotesis... 6
Ruang Lingkup Penelitian... 6
TINJAUAN PUSTAKA... 7
Mikroba endofit... 7
Metabolit sekunder kapang endofit sebagai antikanker... 9
Penapisan metabolit sekunder sebagai antikanker... 16
Optimasi kultivasi kapang endofit... 18
Pemilahan komponen media... 19
Rancangan untuk optimasi... 20
METODE PENELITIAN... 22
Tempat dan waktu penelitian... 22
Sampel dan lokasi... 22
Media dan larutan yang digunakan... 22
Cara Kerja... 23
Isolasi kapang endofit... 23
Kultivasi kultur vegetatif... 24
Kultivasi kultur produksi... 24
Ekstraksi senyawa aktif... 24
Uji aktivitas biologis dengan metode brine shrimp lethality test... 24
Uji sitotoksisitas terhadap sel kanker payudara MCF-7... 25
Identifikasi morofologi kapang... 26
Pemurnian senyawa aktif... 26
Identifikasi struktur kimia senyawa aktif... 26
Pembuatan kurva standar 8-HODE... 27
Diagram alir penelitian... 28
ISOLASI DAN PENAPISAN SITOTOKSISITAS KAPANG ENDOFIT TANAMAN OBAT DARI KABUPATEN LOMBOK TIMUR... 29
Abstrak... 29
Abstract... 30
Pendahuluan... 30
Cara kerja... 32
Pengambilan sampel tanaman dan isolasi kapang... 32
Kultivasi isolat kapang endofit hasil isolasi... 32
Ekstraksi senyawa aktif hasil kultivasi isolat kapang endofit ... 32
Penapisan aktivitas biologis ekstrak pelarut organik dari isolat kapang endofit... 32
Identifikasi morfologi kapang aktif... 33
Hasil dan Pembahasan... 33
Isolasi kapang endofit dari tanaman obat………. 30
Penapisan sitoktoksisitas awal dengan metode BSLT……… 35
Penapisan sitotoksisitas ekstrak dengan penetapan LC50 menggunakan metode BSLT………... 40
Identifikasi kapang aktif……… 41
Simpulan……… 44
PEMURNIAN, UJI SITOTOKSISITAS DAN ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF YANG DIHASILKAN OLEHCurvularia lunata BioMCC-FE00283 KAPANG ENDOFIT YANG DIISOLASI DARI TANAMANCibotium barometz……… 45
Abstrak……… 45
Abstract……….. 46
Pendahuluan……….………. 46
Cara kerja……….………….. 48
Produksi senyawa aktif ……….……… 48
Ekstraksi senyawa aktif……….……… 48
Pemurnian senyawa aktif dengan panduan bioaktivitas ..……… 48
Identifikasi struktur kimia senyawa aktif……….. 49
Hasil dan Pembahasan………. 49
OPTIMASI MEDIA PRODUKSI 8-HYDROXY 9,12-OCTADECADIENOIC
ACID DARI KAPANG ENDOFIT Curvularia lunata BioMCC FE-00283 60
Abstrak……… 60
Abstract……….. 61
Pendahuluan………. 61
Cara kerja……….. 60
Kultivasi produksi 9-HODE………... 63
Analisis 8-HODE hasil kultivasi……… 63
Kompoisisi medium kultivasi..……….. 63
Pemilihan jenis sumber kerbon, nitrogen dan lemak untuk produksi 8-HODE……… 63
Pemilihan level glukosa, monosodium glutamat dan minyak jagung…. 64 Optimasi komposisi media kultivasi untuk produksi 8-HODE…………. 64
Analisis data……… 66
Hasil dan Pembahasan……… 66
Pemilihan jenis sumber karbon pada kultivasiC. lunatauntuk produksi 8-HODE………... 66
Pemilihan jenis sumber nitrogen pada kultivasiC. lunatauntuk produksi 8-HODE……….. 68
Pemilihan jenis sumber inducer pada kultivasiC. lunatauntuk produksi 8-HODE……….. 69
Pemilihan level konsentrasi glukosa sebagai sumber karbon……… 71
Pengaruh konsentrasi monosodium glutamat sebagai sumber nitrogen.. 72
Pengaruh penambahan minyak jagung sebagaiinducer……… 74
Optimasi komposisi media produksi 8-HODE olehC. lunata………. 75
Simpulan……… 82
PEMBAHASAN UMUM……….. 83
SIMPULAN DAN SARAN……….. 89
SIMPULAN……….. 89
SARAN………. 89
DAFTAR PUSTAKA……… 90
DAFTAR TABEL
Halaman 1. Kapang endofit yang berhasil diisolasi dari bagian tanaman obat …. 34 2. Orientasi konsentrasi penapisan sitotoksisitas dengan metode
BSLT……… 36
3. Hasil penapisan toksisitas metabolit sekunder kapang endofit pada konsentrasi 100 mg/L ……… 37
4. Hasil penapisan berdasarkan penetapan LC50……….. 39
5. Hasil uji ekstrak etil asetat dan fraksi metabolit sekunder kapang endofit BioMCC FE-00283 terhadap larvaA. salina………. 47
6. Hasil uji penghambatan proliferasi terhadap sel MCF-7 ……….. 50
7. Geseran kimia spektra H-NMR dari senyawa aktif kapangC. Lunata BioMCC FE-00283 ... 53
8. Rancangan percobaancentral compoiste design... 63
9. Level Konsentrasi setiap faktor padacentral composite design... 63
9.a. Level konsentrasi optimasi pertama... 63
9.b. Level konsentrasi optimasi kedua... 63
10. Hasil uji anova terhadap model ... 75
11. Analisa ANOVA terhadap model respon permukaan kuadratik... 75
12. Perkiraan koefisien peubah pada model……….. 76
DAFTAR GAMBAR
1. Mikroba endofit yang mengkolonisasi jaringan tanaman (A), miselia kapang endofit yang muncul dari jaringan daun yang sudah disterilkan dan ditumbuhkan pada media CMM dengan tambahan
antibiotika (B) ………. 7
2. Struktur kimia taxol, senyawa antikanker pertama yang dapat
dihasilkan oleh kapang endofit ... 10 3. Struktur kimia dari hormonemat metabolit sekuder kapang
Hormonema dematioides ... 12 4. Struktur senyawa antikanker yang dihasilkan kapang endofit dari
tanamanCastaniopsis fissa ... 12 5. Metabolit sekunder kapangPhomopsis cassiae ... 13 6. Struktur kimia senyawa camptothecin yang dihasilkan oleh kapang
Entrospora infrequens ... 13 7. Struktur asperpiron D, metabolit sekunder kapang Aspergillus
tubingensismikroba endofit dari tanamanFallugia paradoxa ... 14 8. Struktur kimia Fusaristatin A (a) dan B (b) metabolit sekunder
kapangFusariumsp endofit tanamanMaackia chinensis ... 15 9. Struktur kimia senyawa podophilotoksin yang dihasilkan oleh
kapang endofit tanamanPodophylumsp ... 16 10. Diagram alir keseluruhan penelitian………. 28 11. Morfologi kapang BioMCC FE-00283 dibawah mikroskop dengan
perbesaran 1000 kali ………. 40
12. Kromatogram ekstrak etil asetat (a), dan fraksi etil asetat (b) ……… 48 13. Kromatogram dan spektra serapan uv dari senyawa aktif………….. 49 14. Spektra FTIR senyawa aktif kapang endofit BioMCC FE-283 ... 50 15. Spektra spektroskopi massa senyawa aktif kapang endofit BioMCC
FE-283 ... 52 16. Spektra MS-MS untuk menentukan fragmentasi senyawa aktif
kapangC. lunataBioMCC FE-00283 ... 54 17. Struktur senyawa aktif dari kapang endofit C. lunata BioMCC
FE-00283 ………. 55
18. Pengaruh jenis sumber karbon terhadap produksi 8-HODE oleh
kapangC. lunata ……… 64 19. Pengaruh jenis sumber nitrogen terhadap produksi 8-HODE oleh
kapangC. lunata ……… 66
10. Siklus asam sitrat dan jalur biosintesis asam lemak pada kapang … 67 21. Pengaruh minyak sebagai inducer terhadap produksi HODE oleh
kapangC. lunata ……….. 68
22. Jalur biosintesis oksilipin pada tanaman dan kapangAspergillus.... 69 23. Pengaruh konsentrasi glukosa di dalam medium kultivasi terhadap
produksi 8-HODE……… 70
24. Pengaruh konsentrasi monosodium glutamat terhadap produksi
8-HODE……… 71
25. Pengaruh penambahan minyak jagung di dalam medium kultivasi
terhadap produksi 8-HODE……….. 72
26. Plot kontur permukaan interaksi antar peubah terhadap produksi
8-HODE………. 74
27. Pengaruh masing-masing komponen media fermentasi terhadap produksi HODE olehC lunata ………. 77 28. Plot kontur dan respon permukaan interaksi antara glukosa dan
monosodium glutamat ………. 77
DAFTAR LAMPIRAN
1 Perhitungan tingkat kolonisasi kapang endofit pada sampel ……… 106
2 Kurva penentuan LC50ekstrak kapang endofit 107
2a Kurva penentuan LC50ekstrak penyarian etil asetat isolat ENLT
9.3d.1... 107 2b Kurva penentuan LC50ekstrak penyarian etil asetat isolat ENLT
7.26... 107 2c Kurva penentuan LC50ekstrak penyarian butanol isolat ENLT
35.3d.1... 108 2d Kurva penentuan LC50ekstrak penyarian etil asetat isolat ENLT
35.3d.2………. 108
2e Kurva penentuan LC50ekstrak penyarian etil asetat isolat ENLT
74.3d.2... 109 2f Kurva penentuan LC50ekstrak penyarian etil asetat isolat ENLT
101.3d... 109 2g Kurva penentuan LC50ekstrak penyarian etil asetat isolat ENLT
108.4d.2... 110 2h Kurva penentuan LC50ekstrak penyarian etil asetat isolat ENLT
6.6d.1... 110 2i Kurva penentuan LC50ekstrak penyarian etil asetat isolat ENLT
8.2d ... 111 3 Kurva penentuan LC50hasil fraksinasi ektrak hasil penyarian etil asetat
isolateCurvularia lunataBioMCC FE-002……… 112 3a Kurva penentuan LC50fraksi heksana... 112 3b Kurva penentuan LC50fraksi heksana : etil asetat = 50 : 50... 112 3c Kurva penentuan LC50fraksi etil asetat... 113 3d Kurva penentuan LC50fraksi etil asetat : metanol = 50:50... 113 3e Kurva penentuan LC50fraksi metanol... 114 4 Penentuan prosen penghambatan senyawa aktif dari kapang endofit
BioMCC FE-00283 dan cisplatin……… 115 4a Fraksi etil asetat 5 mg/L……….. 115
4b Senyawa aktif 5 mg/L……….. 115
4c Cisplatin 5 mg/L……… 115
4d Cisplatin 10 mg/L……….. 116 4e Cisplatin 15 mg/L………... 116 5 Spektra 13C NMR dari senyawa aktif……… 117 6 Spektra 1H NMR dari senyawa aktif ... 118 7 Hasil analisis ragam dan uji Duncan perlakuan jenis sumber karbon
terhadap luas area 8-HODE ... 119 8 Hasil analisis ragam dan uji Duncan perlakuan jenis sumber nitrogen
terhadap luas area 8-HODE……… 120 9 Hasil analisis ragam dan uji Duncan perlakuan jenis sumberinducer
terhadap konsentrasi 8-HODE……… 121 10 Hasil analisis ragam dan uji Duncan perlakuan konsentrasi glukosa
terhadap konsentrasi 8-HODE……… 122
11 Hasil analisis ragam dan uji Duncan perlakuan konsentrasi
monosodium glutamat terhadap konsentrasi 8-HODE………. 123 12 Hasil analisis ragam dan uji Duncan perlakuan penambahan minyak
jagung terhadap konsentrasi 8-HODE……… 124 13 Hasil Optimasi komposisi medium dengan tiktik tengah sesuai hasil
DAFTAR SINGKATAN
BLST :brine shrimp lethality test CCD :central composite design CMM :corn meal malt extract
DMEM :dulbecco’s modified eagle medium
ESI-MS :electro spray ionization mass spectrometry FTIR :fourier transform infra red
HETE :hydroxy eicosa tetranoic acid HODE :hydroxyl octadeca dienoic acid KCKT : kromatografi cair kinerja tinggi NMR :nucleus magnetic resonance PDA :potato dextrose agar
PDY :potato dextrose yeast extract
PPAR :peroxisome proliferator acitivated receptor QTOF-MS-MS :quadropole time of flight mass spectrometry RSM :response surface methodology
1
PENDAHULUAN
LATAR BELAKANG
Dalam sejarah pemakaian tanaman untuk pengobatan, metabolit sekunder tanaman banyak dijadikan sumber untuk penapisan obat-obatan baru. Paclitaxel, yang lebih dikenal dengan nama dagang Taxol, sebagai obat penyakit kanker adalah contoh terbaik betapa metabolit sekunder tanaman mempunyai manfaat sangat besar dalam dunia obat-obatan. Dalam mekanisme kerjanya senyawa yang diisolasi dari tanaman Taxus brevifolia ini mampu berinteraksi dengan tubulin selama fase mitosis dalam siklus hidup sel sehingga menghambat terbentuknya mikrotubulin yang akhirnya dapat menghambat pembelahan sel (Strobel dan Daisy, 2003)
Dengan bertambahnya populasi, manusia memerlukan lahan yang lebih luas untuk menopang kehidupannya. Pertambahan populasi juga menyebabkan kerusakan lingkungan yang menyebabkan turunnya keragaman hayati. Akibat dari semua ini adalah menurunnya kemungkinan menemukan tanaman di alam yang bisa digunakan sebagai sumber penapisan senyawa baru yang berkhasiat obat, disamping semakin berkurangnya lahan untuk tempat tumbuh tanaman. Sebagai gambaran untuk penapisan dari tanaman diperlukan bahan kering sebanyak 5-200 kg, tergantung kandungan bahan aktif dalam tanaman. Hal ini mulai menjadi masalah dengan semakin terbatasnya lahan untuk budidaya tanaman, dan masalah akan menjadi bertambah apabila tanaman yang mengandung senyawa aktif ternyata adalah tanaman yang sudah langka atau sukar untuk dibudidayakan (Cragg, et al., 1996). Masalah yang sama juga dialami oleh Indonesia yang mempunyai sejarah panjang pengobatan tradisional dari tanaman. Komisi Plasma Nutfah Indonesia melaporkan bahwa tumbuhan obat di Indonesia telah mengalami penurunan populasi bahkan ada yang hampir punah karena terus menerus diambil dan belum dibudidayakan (Hasanah, 2005).
digunakan dalam berbagai bidang kesehatan, industri maupun pertanian (Rondon, et al.,1999). Dalam bidang farmasi modern keragaman mikroba telah disetarakan dengan keragaman kimia sebagai sumber bahan baku obat, karena metabolit sekunder mikroba adalah sumber keragaman kimia dengan struktur yang sering kali tidak diduga (Young, 1999).
Schutz (2001) didalam Strobel dan Daisy (2003) melaporkan bahwa metabolit sekunder mikroba ternyata spesifik untuk suatu biotopes tertentu. Atas dasar fakta tersebut maka untuk dapat menemukan metabolit sekunder mikroba yang baru, pencarian harus difokuskan pada mikroba yang mempunyai biotopes yang unik. Mikroba endofit termasuk salah satu mikroba dengan biotopes yang unik karena mempunyai biotopes tanaman tingkat tinggi. Mikroba endofit didefinisikan sebagai mikroba yang seluruh atau sebagian siklus hidupnya mengkoloni jaringan tanaman yang sehat (Tan dan Zou, 2001).
Saat ini mikroba endofit dipandang sebagai sumber untuk mendapatkan senyawa aktif yang sangat menjanjikan karena ada berbagai macam jenis tanaman tingkat tinggi sebagai biotopes-nya. Disamping itu terdapat tanaman dengan jenis tertentu yang dapat tumbuh dalam berbagai lingkungan yang berbeda-beda pula. Untuk mendapatkan senyawa aktif yang sangat spesifik, pemilihan jenis tanaman sebagai sumber isolat mikroba menjadi hal yang sangat penting, karena pemilihan jenis tanaman yang tepat akan memperbesar kemungkinan mendapatkan mikroba baru dan senyawa aktif yang baru. Menurut Strobel dan Daisy (2003), pemilihan tanaman sebagai sumber isolat kapang endofit dapat dikategorikan menjadi 4 kelompok yaitu: tanaman yang tumbuh dalam lingkungan yang spesifik yang mempunyai kemampuan bertahan di lingkungan yang ekstrem, tanaman yang mempunyai sejarah etnobotani yaitu tanaman yang digunakan oleh penduduk lokal untuk keperluan penyembuhan, tanaman yang bersifat endemik dilokasi tertentu, dan tanaman yang tumbuh dalam wilayah dengan keragaman hayati yang tinggi.
3
spesifik tersebut kemungkinan besar merupakan inang bagi kapang endofit yang spesifik pula.
Para peneliti di dunia, terutama di daerah Asia dan Amerika Latin yang beriklim tropis, telah mulai melakukan eksplorasi kapang endofit yang diisolasi dari tanaman obat. Penelitian mengenai isolasi kapang endofit dari tanaman obat dan penapisan bioaktivitasnya telah banyak dilaporkan dalam publikasi ilmiah. Penelitian keragaman kapang endofit dari tanaman obat terutama dilakukan di Asia (Sugijanto,et al.,2004; Gao, et al., 2005; Tejesviet al.,2005; Khan et al., 2007; Lin, et al., 2007; Wang,et. al., 2008). Sedangkan penapisan bioaktivitas metabolit sekunder kapang endofit sudah mulai banyak dilakukan di Asia, termasuk Indonesia, maupun Amerika Latin sebagai antikanker (Radu dan Kqueen, 2002; Filip et al., 2003; Liet al., 2004; Wiyakurta et al., 2004; Silvaet al.,2005; Kumalaet al, 2006; Puriet al.,2006; Linet al.,2007; Pongpaichitet al., 2007; Shiono et al., 2007; Chakravarthi et al., 2008; Guimarães et al.,2008), antimikroba (Daisy et al., 2002; Radu dan Kqueen, 2002; Wahyudi dan Hendriana, 2003; Liu, et al., 2004; Wiyakurta et al., 2004; do Rasario Marinho, 2005; Silvaet al.,2005; Linet al.,2007; Dinget al., 2008; Guimarãeset al.,2008; Liu, et al, 2008), antiparasit (Simanjuntak et al., 2002; Wiyakurta et al., 2004; Guimarães et al.,2008) dan antioksidan (Puri et al., 2006; Huang et al.,2007). Tidak seperti isolasi dan penapisan bioaktivitasnya, optimasi kondisi proses maupun medium fermentasi untuk memproduksi metabolit aktif kapang endofit belum banyak dilaporkan. Gogoi et al., (2008a) melaporkan optimasi kondisi fermentasi kultur terendam untuk produksi metabolit yang dihasilkan oleh kapang endofit Hypocrea spp. NSF-08 yang diisolasi dari tanaman Dillenia indica Linn. di timur laut India. Peneliti yang sama Gogoi et al., (2008b) melaporkan optimasi parameter proses produksi antimikroba dari kapang endofit Fusariumsp.DF2 yang diisolasi dari tanaman obatTaxus wallichiana.
Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang prevalensinya meningkat dari tahun ke tahun. Data yang dilaporkan oleh National Cancer Institute (NCI) sampai tahun 2004, prevalensi kanker payudara pada wanita di Amerika Serikat terus meningkat dan merupakan penyebab kematian ketiga setelah kanker paru-paru dan kanker usus besar. Data di Indonesia yang dikumpulkan oleh Rumah Sakit Ciptomangunkusumo menyebutkan bahwa untuk kasus di Indonesia kanker payudara merupakan jenis kanker dengan prevalensi tertinggi kedua (17,77%) setelah kanker serviks (28,66%) (Tjindrabumi dan Mangunkusumo, 2001). Data yang dikeluarkan oleh Kementerian Kesehatan RI tahun 2008 bahwa sejak tahun 2004 kanker payudara merupakan kasus kanker tertinggi di Indonesia (Ahmadet al.2008).
Pengobatan atau terapi terhadap kanker sangat tergantung pada jenis atau tipe kanker yang diderita, organ atau jaringan tubuh yang terkena, pola penyebaran serta stadium penyakitnya. Seperti kasus kanker pada umumnya, penanganan kanker payudara juga dilakukan dengan berbagai pendekatan, yaitu dengan pembedahan atau operasi, kemoterapi (terapi dengan obat-obatan), radioterapi (terapi dengan radiasi), terapi hormonal atau terapi biologik. Dalam prakteknya hampir selalu dilakukan kombinasi dalam melakukan terapi kanker, dengan memilih salah satu jenis terapi sebagai terapi utama dan jenis yang yang lain sebagai terapi tambahan.
Kemoterapi dalam pengobatan kanker payudara adalah salah satu pilihan sebagai terapi utama selain pembedahan atau terapi biologik. Cara kerja kemoterapi dapat bersifat sebagai agen alkilator, antimetabolit, anti mitosis maupun antibiotika. Kemoterapi pada kanker payudara ternyata memberikan respon yang tergolong tinggi (25-75 %) (Sukardja, 2000).
5
Indonesia. Peluang ini menjadi semakin besar karena mikroba endofit dari tanaman obat di Indonesia relatif belum banyak dieksplorasi.
Dalam penelitian ini telah dilakukan eksplorasi kapang endofit tanaman obat dari beberapa lokasi di Kabupaten Lombok Timur, yang terletak di lereng gunung Rinjani. Daerah ini termasuk dalam kawasan yang mempunyai keragaman baik flora maupun fauna yang merepresentasikan daerah di bagian barat garis Wallacea maupun bagian timur (Rhee et al., 2004). Oleh karena itu Lombok merupakan area yang menarik untuk dijadikan sebagai lokasi pengambilan contoh tanaman obat sumber untuk isolasi kapang endofit. Kapang endofit yang diperoleh kemudian akan dipilih dengan cara penapisan aktivitas penghambatan proliferasi sel kanker payudara. Dari penapisan ini diharapkan dapat diperoleh kapang endofit yang mampu menghasilkan senyawa aktif penghambat proliferasi sel kanker. Senyawa tersebut akan diperbanyak dengan cara fermentasi untuk dapat dimurnikan dan dikarakterisasi struktur kimianya. Rekayasa proses sangat diperlukan agar diperoleh kondisi dan medium kultivasi optimum untuk memproduksi senyawa aktif tersebut. Dalam berbagai publikasi belum banyak ditemukan laporan mengenai rekayasa proses produksi senyawa aktif yang dihasilkan oleh kapang endofit. Hal ini memberi peluang untuk dapat melakukan penelitian mendalam tentang hal tersebut. Rekayasa bioproses akan dilakukan dengan menggunakan metode statistik dalam perancangan percobaan, sedangkan untuk optimasi proses akan digunakan metode statistik dengan respon permukaan.
TUJUAN PENELITIAN Penelitian ini bertujuan
1 Mendapatkan kapang endofit dari tanaman obat Indonesia yang mampu menghasilkan senyawa aktif penghambat proliferasi sel kanker payudara
2 Mendapatkan senyawa aktif penghambat proliferasi sel kanker payudara yang dihasilkan oleh kapang endofit
HIPOTESIS
1 Kapang endofit yang diisolasi dari tanaman obat mampu menghasilkan senyawa aktif yang bersifat sitotoksik
2 Senyawa aktif dari kapang endofit diduga merupakan senyawa asam lemak dengan struktur tertentu dan mampu menghambat proliferasi sel kanker payudara pada ujiin vitro
3 Produksi senyawa aktif oleh kapang endofit secara in vitro diduga dipengaruhi oleh jenis dan jumlah komponen penyusun media
RUANG LINGKUP PENELITIAN Ruang lingkup penelitian adalah sebagai berikut:
1 Pengambilan sampel tanaman obat dari Lombok Timur Nusa Tenggara Barat
2 Isolasi kapang endofit dari tanaman obat
3 Penapisan awal efek sitotoksisitas metabolit kapang dengan dengan metodeBrine Shrimp Lethality Test(BSLT)
4 Identifikasi kapang aktif secara morfologi
5 Pemurnian senyawa aktif antikanker yang meliputi ekstraksi menggunakan pelarut organik, fraksinasi dengan kromatografi kolom dan purifikasi dengan Kromatografi Cair Kinerja TInggi (KCKT) preparatif 6 Uji hambat senyawa aktif murni terhadap proliferasi sel kanker payudara
MCF-7 secarain vitro
7 Identifikasi struktur senyawa aktif dengan metode spektrofotometri infra merah, spektrometri massa, spektroskopi resonansi magnetik inti
8 Pemilihan jenis sumber karbon, sumber nitrogen dan senyawa penginduksi untuk mendapatkan senyawa aktif tertinggi
9 Optimasi komposisi medium skala laboratorium dengan metode respon permukaan.
TINJAUAN PUSTAKA
MIKROBA ENDOFIT
Secara bahasa endofit diartikan sebagai “di dalam tanaman”, berasal dari bahasa Yunani endon yang berarti di dalam danphyton yang berarti tanaman. Penggunaan istilah endofit ini pada kenyataannya sama luasnya dengan arti bahasanya, karena luasnya potensi tanaman sebagai inang dan inhabitan yang bisa berada di dalamnya, yang dapat berupa bakteri, fungi, alga, atau serangga (Schulz dan Boyle, 2005). Secara umum pengertian endofit didefinisikan sebagai makhluk hidup yang dalam periode waktu tertentu dalam siklus hidupnya mengkolonisasi jaringan hidup tanaman inangnya tanpa menimbulkan gejala apapun (Petrini et al., 1999; Tan dan Zou, 2001; Zhang et al., 2006). Pada Gambar 1 kolonisasi endofit ditunjukkan oleh lingkaran-lingkaran berwarna merah yang lebih gelap dibandingkan dengan jaringan tanaman.
Gambar 1 Mikroba endofit yang mengkolonisasi jaringan tanaman (A), miselia kapang endofit yang muncul dari jaringan daun yang sudah disterilkan dan ditumbuhkan pada media CMM dengan tambahan antibiotika (B) (Sumber: Tan dan Zou, 2001 (A), Laboratorium Mikrobiologi, Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT (B))
Hubungan antara endofit dan tumbuhan inangnya berkisar dari penyebab penyakit (patogen) sampai terbentuknya simbiosis mutualisme, yang memungkinkan suatu spesies tanaman tertentu mempunyai setidaknya satu jenis mikroba yang spesifik. Meskipun secara umum komunitas endofit
B A
TINJAUAN PUSTAKA
MIKROBA ENDOFIT
Secara bahasa endofit diartikan sebagai “di dalam tanaman”, berasal dari bahasa Yunani endon yang berarti di dalam dan phytonyang berarti tanaman. Penggunaan istilah endofit ini pada kenyataannya sama luasnya dengan arti bahasanya, karena luasnya potensi tanaman sebagai inang dan inhabitan yang bisa berada di dalamnya, yang dapat berupa bakteri, fungi, alga, atau serangga (Schulz dan Boyle, 2005). Secara umum pengertian endofit didefinisikan sebagai makhluk hidup yang dalam periode waktu tertentu dalam siklus hidupnya mengkolonisasi jaringan hidup tanaman inangnya tanpa menimbulkan gejala apapun (Petrini et al., 1999; Tan dan Zou, 2001; Zhang et al., 2006). Pada Gambar 1 kolonisasi endofit ditunjukkan oleh lingkaran-lingkaran berwarna merah yang lebih gelap dibandingkan dengan jaringan tanaman.
Gambar 1 Mikroba endofit yang mengkolonisasi jaringan tanaman (A), miselia kapang endofit yang muncul dari jaringan daun yang sudah disterilkan dan ditumbuhkan pada media CMM dengan tambahan antibiotika (B) (Sumber: Tan dan Zou, 2001 (A), Laboratorium Mikrobiologi, Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT (B))
Hubungan antara endofit dan tumbuhan inangnya berkisar dari penyebab penyakit (patogen) sampai terbentuknya simbiosis mutualisme, yang memungkinkan suatu spesies tanaman tertentu mempunyai setidaknya satu jenis mikroba yang spesifik. Meskipun secara umum komunitas endofit
B A
TINJAUAN PUSTAKA
MIKROBA ENDOFIT
Secara bahasa endofit diartikan sebagai “di dalam tanaman”, berasal dari bahasa Yunani endon yang berarti di dalam dan phytonyang berarti tanaman. Penggunaan istilah endofit ini pada kenyataannya sama luasnya dengan arti bahasanya, karena luasnya potensi tanaman sebagai inang dan inhabitan yang bisa berada di dalamnya, yang dapat berupa bakteri, fungi, alga, atau serangga (Schulz dan Boyle, 2005). Secara umum pengertian endofit didefinisikan sebagai makhluk hidup yang dalam periode waktu tertentu dalam siklus hidupnya mengkolonisasi jaringan hidup tanaman inangnya tanpa menimbulkan gejala apapun (Petrini et al., 1999; Tan dan Zou, 2001; Zhang et al., 2006). Pada Gambar 1 kolonisasi endofit ditunjukkan oleh lingkaran-lingkaran berwarna merah yang lebih gelap dibandingkan dengan jaringan tanaman.
Gambar 1 Mikroba endofit yang mengkolonisasi jaringan tanaman (A), miselia kapang endofit yang muncul dari jaringan daun yang sudah disterilkan dan ditumbuhkan pada media CMM dengan tambahan antibiotika (B) (Sumber: Tan dan Zou, 2001 (A), Laboratorium Mikrobiologi, Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT (B))
Hubungan antara endofit dan tumbuhan inangnya berkisar dari penyebab penyakit (patogen) sampai terbentuknya simbiosis mutualisme, yang memungkinkan suatu spesies tanaman tertentu mempunyai setidaknya satu jenis mikroba yang spesifik. Meskipun secara umum komunitas endofit
mempunyai inang yang spesifik, akan tetapi spesifitas tersebut ternyata juga dapat dipengaruhi oleh lingkungan. (Miller, 2001; Faeth, 2002; Schulz dan Boyle, 2005; Zhanget al., 2006).
Kapang endofit pertama kali ditemukan di daerah Darnel, Jerman dan dilaporkan oleh Freeman pada tahun 1904 (Tan dan Zhou, 2001; Strobel dan Daysi, 2003). Setelah penemuan ini tidak ada laporan ilmiah yang berarti tentang endofit sampai ketika pada tahun 1993 tim penelitian yang dipimpin oleh Gary Strobel dari Departemen Plant Science Montana State University di Amerika menemukan kapang endofit dari tanaman yew (Taxus brevifolia). Kapang yang kemudian diberi nama Taxomyces andreanaeini ternyata mampu menghasilkan senyawa taxol, senyawa anti kanker yang selama ini diekstrak dari tanaman yew (Strobelet al., 2004). Penemuan yang dilaporkan oleh Strobel dan tim-nya ini membawa dampak yang cukup revolusioner karena membuka harapan baru untuk menghasilkan senyawa-senyawa berkhasiat dari mikroba, yang diekstrak dari tanaman. Karena pada perkembangannya senyawa aktif yang dihasilkan oleh mikroba endofit ternyata tidak selalu sama dengan senyawa yang dihasilkan oleh tanaman inangnya, sehingga mikroba endofit menjadi sumber senyawa aktif baru yang sangat menjanjikan. Disamping itu pencarian senyawa baru dari mikroba endofit diharapkan dapat mengurangi kerusakan lingkungan akibat pemanfaatan tanaman secara besar-besaran untuk mendapatkan senyawa aktif. Penemuan ini juga membantu menyelamatkan tanaman-tanaman berkhasiat obat yang sudah semakin langka.
9
adalah mikroba yang paling mudah diisolasi dari tanaman dibandingkan mikroba lain.
METABOLIT SEKUNDER KAPANG ENDOFIT SEBAGAI ANTIKANKER Kapang endofit, seperti mahkluk hidup lainnya juga menghasilkan metabolit primer maupun metabolit sekunder. Tidak seperti mikroba endofit yang lain, kapang endofit jarang dilaporkan menghasilkan metabolit primer seperti karbohidrat, enzim, atau protein. Sejauh ini baru beberapa jenis enzim yang dilaporkan dihasilkan oleh kapang endofit. Laporan pertama adalah enzim lipase yang terikat dalam miselia Rhizopus oryzae, kapang endofit yang diisolasi dari tanaman daerah Mediterania Foeniculum vulgare (Torres et al., 2003). Enzim lain adalah kitinase yang terdeteksi disekresikan didalam kultur Neothyphodium sp yang diisolasi dari rumput Poa ampla Merr. Enzim ini dilaporkan berperan sebagai nutrisi, faktor pertumbuhan dan mekanisme pertahanan terhadap penyakit dari kapang endofit tersebut (Li et al.,2004). Laporan terbaru adalah enzim laccaseyang dihasilkan oleh kapang endofit Monotosporasp. endofit dari tanamanCynodon dactylon(Wanget al.,2006).
Berbanding terbalik dengan metabolit primernya, publikasi tentang metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit jauh lebih banyak. Metabolit sekunder kapang endofit yang sudah pernah diisolasi mempunyai aktivitas biologis yang sangat bervariasi dari bidang pertanian, industri sampai farmasi. Dalam bidang pertanian mikroba endofit digunakan sebagai insektisida (Azevedo et al., 2000; Daysi et al., 2002; dos Santos et al., 2003), sedangkan dalam bidang industri diaplikasikan untuk biotransformasi dari satu senyawa menjadi senyawa lain (Mundova et al., 2002; Shibuya et al., 2003). Dalam bidang farmasi, metabolit sekunder kapang endofit dapat dimanfaatkan sebagai antibiotik (Radu dan Kqueen, 2001; Strobel et al., 2001; Castillo et al., 2002; Ezra et al., 2004; Seephonkai et al., 2004; Wiyakrutta et al., 2004; Li et al., 2005), antifungal (Strobelet al., 1999a ; Strobelet al., 1999b; Radu dan Kqueen, 2001; Wiyakrutta et al., 2004; Silva et al., 2005; Li et al., 2005), anti kanker (Carusoet al.,2000; Radu dan Kqueen, 2001; Filipet al.,2003; Wiyakruttaet al., 2004; Liet al.,2005; Silvaet al.,2005; Guoet al.,2006), antiinflamasi (Weberet al., 2004) maupun antimalaria (Wiyakruttaet al.,2004)
fenilpropanoid dan lignan, fenol dan asam fenolat, peptida, senyawa alifatik, dan lakton (Tan dan Zou, 2004; Zhanget al., 2006).
NH O
O OH
O
CH3 CH3 O
C H3
O
O
CH3OH
O O
O CH3 H
O O H
O
Gambar 2 Struktur kimia taxol, senyawa antikanker pertama yang dihasilkan oleh kapang endofit (Sumber : Strobelet al., 2004)
Meskipun belum ada laporan tentang senyawa metabolit sekunder kapang endofit yang sudah beredar di pasaran, akan tetapi laporan tentang penemuan senyawa antikanker dari kapang endofit telah banyak dilaporkan. Taxol (Gambar 2) dan turunannya adalah kelompok senyawa pertama yang dilaporkan berhasil diisolasi dari kultur kapang endofit dan mempunyai khasiat antikanker (Strobelet al., 2004). Taxol adalah senyawa diterpenoid yang pada awalnya diisolasi dari tanaman Taxus brevifolia (Wani et al.,1971). Pada awal penemuannya kanker rahim dan payudara adalah target utama taxol, akan tetapi sekarang pemakaiannya untuk kemoterapi sudah meluas untuk hampir semua proliferasi sel jaringan tubuh yang tidak terkendali. Kapang endofit Taxomyces andreanae adalah kapang endofit pertama yang dilaporkan mampu menghasilkan senyawa taxol. Kapang tersebut diisolasi dari tanaman Taxus brevifolia. (Stierle et. al., 1993).
11
media PDA yang dikultivasi pada suhu 25oC selama 3 minggu dalam keadaan gelap. Taxol yang dihasilkan dianalisis dengan KCKT menggunakan kolom AlltechEconosil C18 dan dielusi secara gradien menggunakan campuran air dan metanol. Peneliti lain melaporkan bahwa kapangFusarium solaniyang diisolasi dari tanamanTaxus celebicajuga mampu menghasilkan senyawa taxol. Kapang ditumbuhkan dengan kultur cair stasioner pada medium PDA pada suhu 25oC selama 21 hari. Analisis taxol dilakukan dengan KCKT menggunakan kolom Kromasil C18. Sampel dielusi secara isokratik dengan campuran metanol air (70:30, v/v) dengan kecepatan 1 ml/min (Chakravarthi et al., 2008). Taxol juga dilaporkan dapat dihasilkan oleh kapang Colletotrichum gloesporioides yang diisolasi dari tanaman obat Justicia gendarusa. Produksi taxol dilakukan pada media cair dengan medium MID yang ditambah dengan pepton soya. Kultivasi stasioner dilakukan pada suhu 26oC selama 21 hari (Gangadevi & Muthumary, 2008). Kapang Pestalotiopsis pauciseta yang diisolasi dari tanaman Cardiospermum helicacabumjuga dilaporkan mampu menghasilkan taxol ketika dikultivasi pada medium MID yang ditambah dengan pepton soya. Kultivasi dilakukan dengan kultur stasioner pada suhu 26oC selama 21 hari. (Gangadevi, et al., 2008).
O H O H OH O C H3 O H OH O O C H3 O CH3 CH3 O O C H3 C H3 O O O CH3 CH3 C H3 C H3 OH O
Gambar 3 Struktur kimia dari hormonemat metabolit sekuder kapang Hormonema dematioides(Sumber : Filipet al.,2003)
pertumbuhan sel kanker usus besar COLO-320, DLD-1 dan HT-29. (Filip et al., 2003).
Kapang endofit yang berhasil diisolasi dari tanaman Castaniopsis fissa yang belum teridentifikasi juga dilaporkan mampu menghasilkan senyawa antikanker. Senyawa ergosta-8(9),22-diene-3,5,6,7-tetraol(3β,5α,22E) yang masuk dalam kelompok senyawa sterol tersebut (Gambar 4) bersifat sitotoksis terhadap sel kanker Bel-7402, NCI4460 dan L-02 dengan IC50 masing-masing 8,445; 5,03; dan 13,621 µg/ml. Senyawa tersebut dihasilkan dari kultivasi kapang dalam media cair yang diinkubasi pada suhu 25oC dengan pengocokan 120 rpm selama 5-7 hari (Liet. al.,2004).
O H C H3 CH3 OH OH CH3 C H3 CH3 CH3 CH3
Gambar 4 Struktur senyawa antikanker yang dihasilkan kapang endofit dari tanamanCastaniopsis fissa(Sumber : Liet al.,2004)
Kapang Phomopsis cassiae yang diisolasi dari tanaman Cassia spectabilis dilaporkan dapat menghasilkan dua senyawa baru, phomopsilakton dan etil 2,4-hihidroksi-5,6-dimetilbenzoat (Gambar 5a dan 5b) pada kultivasi dalam media PDB pada suhu 25oC dan pengocokan 150 rpm selama 28 hari. Kedua senyawa tersebut dalam ujiin vitroterbukti bersifat sitotoksis terhadap sel kanker servik. (Silvaet al.,2005).
O
O H
OH
O CH3 CH2 O C H3 C H3 CH3 O H OH O O CH3
Gambar 5 Metabolit sekunder kapang Phomopsis cassiae (Sumber : Silva et al.,2005)
13
Camptothecin (Gambar 6), adalah senyawa golongan alkaloid yang juga sudah terbukti sebagai senyawa antikanker. Senyawa yang merupakan penghambat topoisomerasi I ini pada awalnya diperoleh dari tanaman Nothapodytes foetida, yang kemudian menarik peneliti untuk mempelajari kapang endofitnya. Amnaet. al., (2006) melaporkan bahwa kapangEntrospora infrequens yang diisolasi dari tanaman N. foetida mampu menghasilkan senyawa camptothecin. Ekstrak kloroform:metanol (9:1, v/v) dari kultur padat maupun cair dari kapang yang kemudian diinjeksikan ke dalam unit LC/MS menunjukkan bahwa kapangE. infrequensmampu menghasilkan camptothecin.
N
N O
O
OH C
H3 O
Gambar 6 Struktur kimia senyawa camptothecin yang dihasilkan oleh kapang Entrospora infrequens(Sumber : Amnaet al.,2006)
Kelompok peneliti ini melaporkan bahwa camptothecin dapat dihasilkan oleh kapang Entrospora infrequens baik pada kultur padat maupun kultur cair. Hasil tertinggi pada kultur padat adalah 4,28 mg/100 g miselia kering dari kultur berumur 14 hari. Sedangkan pada kultur cair diperoleh hasil 250 µg/L kaldu fermentasi.
O
O CH3
OCH3
H3CO
O
OH O
H OCH3
O
CH3
Gambar 7 Struktur asperpiron D, metabolit sekunder kapang Aspergillus tubingensis mikroba endofit dari tanaman Fallugia paradoxa (Sumber Zhanet al.,2007)
CH3 CH3
O
CH3
O N H
R1 O
O
N H CH3O
O CH2
NH
R2
R3
A NH2
O
A OH
O
Gambar 8 Struktur kimia Fusaristatin A (a) dan B (b) metabolit sekunder kapang Fusariumsp endofit tanamanMaackia chinensis(Sumber : Shionoet al.,2007)
Senyawa baru lain yang dilaporkan merupakan antikanker adalah fusaristatin A dan B (Gambar 8). Fusaristatin A dan B adalah golongan
a. R1= R2= H R3=CH3
15
lipopeptida siklik yang dihasilkan oleh kapang Fusarium sp yang diisolasi dari tanaman Maackia chinensis. Kedua senyawa tersebut dihasilkan dari kultur padat menggunakan media beras pada suhu 25oC selama 3 minggu. Fusaristatin A dan B dilaporkan mampu menghambat proliferasi sel kanker paru-paru LU 65 dengan IC50masing-masing 23 dan 7 µM (Shionoet al.,2007)
Selain senyawa antikanker, kapang endofit dari tanaman obat juga dapat menghasilkan senyawa yang berfungsi sebagai prekursor senyawa antikanker. Podophilotoksin, suatu senyawa golongan ariltetralin lignan (Gambar. 9) merupakan prekursor dari obat antikanker etoposida, teniposida, dan etoposida phosphat. Sumber utama senyawa tersebut adalah tanaman Podophylum sp. Semakin langkanya tanaman sebagai sumber utama senyawa mendorong para peneliti untuk mengisolasi kapang endofit dari berbagai spesiesPodophylumsp. Kapang endofit Trametes hirsutayang diisolasi dari P. hexandrum dari daerah Himalaya dilaporkan dapat menghasilkan podophilotoksin. Kultur cair dalam media Sabouraud brothyang dikultivasi pada suhu 28oC dan pengocokan 220 rpm selama 7 hari digunakan untuk memproduksi podophilotoksin. Senyawa aktif tersebut diekstrak dari biomassa yang dihasilkan dari kultur cair menggunakan campuran kloroform:metanol (4:1, v/v). Untuk mengidentifikasi senyawa ekstrak dimurnikan dengan KCKT dan kemudian dianalisis dengan ESI MS/MS dan NMR (Puriet. al.,2006).
O
O
O OH
O
OCH3 OCH3 H3CO
Gambar 9 Struktur kimia senyawa podophilotoksin yang dihasilkan oleh kapang endofit tanamanPodophylumsp (Sumber : Puriet. al.,2006).
podophilotoksin dilakukan dalam medium cair MB atau YMB pada suhu 20-23oC dalam gelap. Biomassa yang dihasilkan dipisahkan dari mediumnya, dikeringkan pada suhu 70-80oC selama 24 jam, kemudian diekstrak dengan etanol 95% menggunakan pengekstrak Soxhlet. Untuk mengetahui komposisi senyawa didalamnya, ekstrak tersebut kemudian dianalisis menggunakan KCKT dengan kolom Hypersil BDS. Fasa gerak digunakan campuran asetonitril/air secara gradien 5 - 95% selama 40 menit dengan laju alir 1 ml/min. Puncak yang muncul dari sampel kemudian dibandingkan dengan puncak standar podophilotoksin (Eybergeret al.,2006)
PENAPISAN METABOLIT SEKUNDER SEBAGAI ANTIKANKER Senyawa bahan alam merupakan produk metabolit sekunder yang dihasilkan oleh makhluk hidup sebagai tanggapan atas stimulan dari lingkungan. Stimulan tersebut dapat berupa perubahan nutrisi, infeksi, maupun kompetisi. Senyawa bahan alam yang dihasilkan oleh tanaman, hewan, serangga maupun mikroba telah banyak dimurnikan sebagai bahan obat yang mempunyai aktivitas biologis. Senyawa bahan alam tersebut banyak digunakan oleh industri farmasi sebagai sumber keragaman struktur untuk pengembangan aktivitas farmakologi.
Untuk mendapatkan senyawa bahan alam yang mempunyai aktivitas biologis, diperlukan suatu metode tertentu yang sistematis untuk memilih/menapis senyawa aktif yang diinginkan dari demikian banyak senyawa yang mungkin ada. Menurut Omura (1986), kunci utama untuk mendapatkan senyawa aktif dari mikroba adalah sistem penapisan yang efektif. Penapisan aktivitas biologis terhadap metabolit sekunder mikroba harus memenuhi beberapa criteria, yaitu penggunaan materi biologi yang tepat dan kemampuan untuk menguji jumlah sampel dalam jumlah kecil dengan mudah serta cepat.
17
antikanker dari senyawa murni yang akan dikembangkan sebagai obat antikanker. Secondary testini adalah uji yang berkapasitas rendah, lambat dan mahal (Komiyama & Funayama, 1991).
Brine shrimp lethality test(BSLT) adalah salah satu metodeprescreening untuk senyawa antikanker. BSLT dilakukan dengan pemaparan larva udang pada ekstrak yang akan diuji didalam larutan garam dan kemudian tingkat kematiannya diamati setelah satu hari. Metode ini telah digunakan oleh peneliti National Cancer Institute (NCI) di Amerika untuk metode prescreening dalam penelitian pengembangan obat kanker (Quignardet al., 2003). Disamping cepat, mudah, dan murah, BSLT juga mempunyai korelasi positif dengan aktivitas antitumor. Karena adanya korelasi positif ini, BSLT direkomendasikan sebagai metode prescreening yang efektif untuk melihat efek sitotoksik dan antitumor (Anderson et al., 1991; McLaughlin et al. 1998). BSLT telah banyak dimanfaatkan peneliti untuk melakukan penapisan awal senyawa antikanker dari tanaman (Khan et al. 2008; Mojica dan Micor, 2007; Pisutthanan, et al., 2004), maupun dari mikroba (Al-Bari et al., 2007; Haque et al., 2005; Logrieco et al. 1996).
Apabila BSLT adalah metode prescreening yang banyak digunakan, maka metode screening in vitro yang paling sering digunakan adalah uji viabilitas sel. Dalam metode ini akan dihitung jumlah sel kanker yang masih hidup setelah dikenai perlakuan dengan senyawa uji. Sel yang masih hidup dapat ditunjukkan dengan terjadinya reduksi senyawa 3-(4,5-dimethilthiazol-2-yl)-2,5-dipenil tetrazolium bromide (MTT) menjadi formazan yang menyebabkan terjadinya perubahan warna. Reaksi reduksi ini dikatalisis oleh enzim mitokondrial dehidrogenase yang menunjukkan bahwa suatu sel masih hidup (viabel) (Boyd, 2004).
Aktivitas antikanker atau sitotoksisitas metabolit sekunder kapang endofit pada umumnya juga diuji dengan metode MTT. Berbagai publikasi skrining aktivitas kapang endofit menggunakan metode MTT (Guimarães et al, 2008; Phongpaichitet , 2007; Zhan et al,2007; Kumalaet al, 2006; Wiyakrutta et al, 2004; Liet al,2005)
OPTIMASI KULTIVASI KAPANG ENDOFIT
yang lainnya akan mempengaruhi kondisi kimiawi dan nutrisi dari sel di dalam reaktor. Kondisi ini mempengaruhi akumulasi produk di dalam sel maupun yang disekresikan ke dalam medium. Optimasi media terutama dilakukan untuk mendapatkan sistem pertumbuhan terbaik untuk memaksimalkan produk maupun meminimalkan biaya dan teknologi. Formulasi media bukan merupakan hal mudah, karena banyaknya variabel yang terlibat di dalam proses dan kompleksitas metabolisme di dalam mikroorganisme yang terlibat di dalam fermentasi (Weuster-Botz, 2000).
Karena sifat-sifatnya maka optimasi dan pembuatan model untuk fermentasi juga kompleks dan memakan waktu lama (Roeva, 2005). Untuk mengoptimasi suatu proses fermentasi dibutuhkan suatu model yang mampu mendeskripsikan dinamika proses dan hubungan antar berbagai variabel yang terlibat dalam proses. Bagian penting dalam pembuatan model ini adalah pemilihan metode optimasi yang tepat untuk dapat memprediksikan parameter sehingga dengan data percobaan yang sudah ada dapat mengkalibrasi model agar data percobaan tersebut dapat diulang dengan cara yang terbaik (Rochaet al.,2006; Roeva, 2005).
Pendekatan statistik telah digunakan secara luas untuk memilah dan mengoptimasi proses fermentasi. Pendekatan statistik untuk melakukan optimasi ini melibatkan baik rancangan percobaan maupun teknik optimasi. Rancangan berfungsi untuk mendefinisikan variabel yang akan dilihat pengaruhnya terhadap proses, termasuk didalamnya banyaknya ulangan dan level dari setiap variabel. Kemudian dari data yang diperoleh dari percobaan dilakukan optimasi dengan menggunakan suatu model matematika untuk meramalkan kondisi proses yang lebih baik (Kennedy dan Krouse, 1999). Pendekatan statistik untuk optimasi telah digunakan secara luas terutama dengan semakin banyaknya perangkat lunak komputer yang memungkinkan untuk mengolah data dalam jumlah besar. Pendekatan secara statistik ini dapat digunakan untuk penapisan sejumlah besar faktor seperti misalnya untuk menentukan komposisi media fermentasi. Dengan rancangan percobaan ini faktor-faktor yang terbukti tidak mempunyai pengaruh nyata terhadap proses fermentasi dapat dihilangkan (Parekh et al., 2000).
19
optimum dari komponen-komponen tersebut. (Kennedy dan Krouse, 1999; Parekh,et al.,2000, Weuster-Botz, 2000).
Pemilahan komponen media
Rancangan faktorial dengan berbagai variasinya adalah rancangan yang paling umum digunakan untuk skrining komponen media. Rancangan faktorial dapat berupa faktorial lengkap maupun faktorial tidak lengkap (faktorial terfraksinasi). Dalam rancangan faktorial lengkap semua kombinasi dari faktor dicoba, sedangkan pada rancangan faktorial terfraksinasi memungkinkan untuk mengurangi jumlah percobaan apabila jumlah percobaan dengan rancangan faktorial lengkap dirasa kurang praktis. Apabila dalam rancangan percobaan faktorial lengkap jumlah percobaan dirumuskan dengan 2n, dimana n adalah faktor yang dicoba, maka dalam faktorial terfraksinasi jumlah percobaan dirumuskan menjadi 2n-k, dimana n adalah jumlah faktor yang dicoba dan k adalah fraksi yang akan digunakan.
Rancangan faktorial terfraksinasi banyak digunakan sebagai tahap awal optimasi yang melibatkan banyak faktor, seperti pemilihan komponen media yang mempunyai pengaruh terhadap proses fermentasi. Ooijkaas et al., (1999) menggunakan metode ini untuk memilih komponen media yang mempunyai pengaruh terhadap produksi spora Coniothyrium minitants. Rancangan faktorial terfraksinasi juga digunakan oleh Rajendhran et al., (2002) untuk memilih 8 macam komponen media yang berpengaruh terhadap produksi penisilin G asilase oleh Bacillus sp. Setelah komponen media yang mempunyai pengaruh nyata terhadap hasil akhir yang diinginkan diketahui, baru dilakukan optimasi.
Rancangan untuk optimasi
yang merupakan kombinasi dari semua titik tengah faktor yang akan dioptimasi. Central composite design banyak digunakan peneliti untuk merancang percobaan optimasi setelah faktor-faktor yang mempunyai pengaruh terhadap hasil akhir yang diinginkan diketahui melalui percobaan berdasarkan rancangan faktorial yang lain.
Setelah mendapatkan serangkaian data dari rancangan penelitian diperlukan suatu metode untuk mendapatkan gambaran kondisi optimal yang diharapkan. Metode optimasi untuk rancangan percobaan statistik yang paling umum digunakan adalah Response Surface Methodology (RSM) (Parekhet al., 2000). Dengan RSM suatu model empiris dibangun berdasarkan data yang diperoleh dari percobaan yang telah dirancang sebelumnya. Model yang terbentuk, biasanya merupakan persamaan yang biasanya berupa persamaan polinomial ordo dua (persamaan 1), digunakan untuk meramalkan seberapa besar level yang diperlukan dari faktor yang diuji untuk mendapatkan respon tertinggi.
Y = b0+ Σ biXi+ Σ biiXi2+ Σ Σ bijXiXj ……… 1)
Dalam persamaan diatas Xi adalah variabel uji yang mempengaruhi respon (Y), b0, bi, bii, dan bij adalah ramalan untuk koefisien regresi, Xi Xj menggambarkan adanya interaksi antar variable uji dan Xi2 menggambarkan ketidak linieran ordo 2 (Unal et al.,1998). Menurut Parekh et al (2000) RSM adalah metode yang sangat kuat karena baik pengaruh interaksi antar faktor maupun pengaruh kuadratnya diperhitungkan dan dikuantifikasi. Metode optimasi dengan RSM kebanyakan hanya digunakan untuk proses fermentasi curah (bacth).
21
TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian dilakukan di fasilitas Laboratorium Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT, Laboratorium kultur sel LABTIAP BPPT, Kawasan Puspiptek Serpong; Laboratorium Analisis Mercian Corporation Jepang dan Laboratorium analisis Waters Singapura. Penelitian dilakukan mulai bulan Januari 2007 sampai dengan bulan Februari 2011
SAMPEL DAN LOKASI 1 Sampel tanaman
Sampel tanaman sebagai sumber isolasi kapang endofit adalah tanaman yang dikenal secara empiris sebagai tanaman obat
2 Lokasi pengambilan sampel tanaman
Sampel tanaman obat diambil di Kabupaten Lombok Timur, Propinsi Nusa Tenggara Barat
3 Penanganan sampel tanaman
Sampel tanaman diambil berupa daun dan dahan atau batang tanaman. Sampel dicuci dengan air, kemudian dimasukkan ke dalam plastik bersih yang sudah dilapis dengan kertas yang dilembabkan dengan air steril. Sampel disimpan dalam suhu dingin selama dalam transportasi sampai dilakukan isolasi mikroba
MEDIA DAN LARUTAN YANG DIGUNAKAN 1 MediaCorn Meal Malt Extract(CMM)
Media CMM terdiri dari 17 g corn meal agar (Oxoid), 20 g ekstrak malt (Oxoid), 2 g ekstrak khamir (Oxoid), 50 mg khloramfenicol (Merck), dan 1 L air tanpa mineral. Larutan media disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit. Media CMM digunakan untuk isolasi kapang endofit dari tanaman obat.
2 MediaPotato Dextrose Agar(PDA)
23
3 MediaPotato Dextrose Yeast(PDY)
Media terdiri dari: ekstrak dari 300 g kentang, 20 g glukosa (Merck), 3 g ekstrak khamir (Oxoid), dan 1 L air tanpa mineral. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Media PDY digunakan untuk kultivasi isolat kapang endofit.
4 MediaDulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) (Khantamatet al.,2004) Media DMEM digunakan untuk propagasi sel kanker sebelum digunakan untuk uji toksisitas. Media ini terdiri dari media DMEM (Difco) dengan 4 mM L-glutamin yang dikondisikan setiap liter media mengandung 1,5 g Sodium bikarbonat dan 4,5 g glukosa yang diperkaya dengan 0,01 mg/L bovine insulin dan 10 % fetal bovine serum. Medium disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit.
5 Air garam laut
Air garam dibuat dari 38 g garam laut dalam 1000 ml air bebas mineral, kemudian disaring hingga jernih.
6 Larutan stok MTT
Larutan stok pewarna MTT dibuat dari 5 g 3-(4,5 methilthiazol-2lil)-2,5 dipheniltetrazolium bromide (MTT, Sigma) yang dilarutkan dalam 1 L phosphat buffered saline (PBS) yang mempunyai pH 7,4.
7 Fasa gerak untuk analisis dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi
Pelarut organik yang akan digunakan disaring menggunakan kertas saring selulosa ukuran 0,45 µL. Pelarut yang sudah disaring disonikasi selama 15 menit untuk menghilangkan gelembung di dalam pelarut.
CARA KERJA Isolasi kapang endofit
% selama 0,5 menit. Sampel yang sudah disterilisasi permukaan dipotong dengan ukuran ± 1 cm kemudian dibelah. Permukaan dalam sampel diletakkan di atas media agar CMM dalam cawan petri. Cawan petri diinkubasi selama ± 3 minggu pada suhu kamar. Setiap hari dilakukan pengamatan, apabila sudah ada kapang yang tumbuh dari sisi sampel segera dipindahkan ke dalam media PDA dalam cawan petri. Cawan petri diinkubasi pada suhu 28oC sampai kapang tumbuh.
Kultivasi kultur vegetatif
Kultur vegetatif dilakukan pada 100 mL media PDY di dalam Erlenmeyer 250 mL. Media diinokulasi dengan 2 loop isolate fungi endofit yang tumbuh pada media PDA. Kultur vegetatif diinkubasi dalam orbital shaker incubator pada suhu 28oC selama 2 hari dengan pengocokan 150 rpm.
Kultivasi kultur produksi
Kultur produksi dilakukan dengan menggunakan media PDY atau media sesuai dengan rancangan percobaan yang akan dilakukan pada Erlenmeyer 250 mL yang berisi 100 mL media, Erlenmeyer 500 mL yang berisi 200 ml media atau Erlenmeyer 2000 mL yang berisi 1000 mL media. Kultur produksi diinokulasi dengan kultur vegetatif sebanyak 5-10 % volume media produksi. Kultur vegetative diinkubasi dalam orbital shaker incubator pada suhu 28oC selama 10 hari dengan pengocokan 150 rpm.
Ekstraksi senyawa aktif
25
Uji aktivitas biologis dengan metode brine shrimp lethality test (BSLT) a. Penetasan telurArtemia salina
Air garam dimasukkan ke dalam corong pisah 250 ml, kemudian ditambahkan telur A. Salina sebanyak 20 mg. Telur dibiarkan selama 24 jam dengan disinari lampu TL 18 W, telur yang tidak menetas dipisahkan sedangkan telur yang menetas dibiarkan lagi selama 24 jam dan siap untuk uji BSLT.
b. Uji BSLT
Uji BSLT dilakukan sesuai dengan mengikuti metode yang dilakukan oleh Costa-Latufo et al., 2005). Ekstrak/fraksi yang sudah dipekatkan ditimbang, kemudian diencerkan dengan methanol sampai konsentrasi 10.000 mg/L. Larutan dihomogenkan, diencerkan menjadi konsentrasi 100 mg/L, 50 mg/L dan 25 mg/L sesuai kebutuhan pengukuran. Lima puluh µL ekstrak yang telah diencerkan dipipet ke dalam vial dengan 3 ulangan dan dibiarkan hingga methanol menguap. Setelah methanol habis menguap, kedalam vial ditambahkan 20 µl pelarut dimetilsulfoksida (DMSO) sampai ekstrak larut kembali, 2 ml larutan garam dan 10 ekor larva A. salina. Air garam kembali ditambahkan sampai volume total mencapai 5 ml. Larutan uji ini diletakkan di dekat lampu TL 18 W selama 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva A. salina yang hidup dan mati. Blanko dilkerjakan dengan cara yang sama, tanpa penambahan ekstrak.
Larva mati karena perlakuan – Larva mati pada blanko % kematian larva : --- x 100 %
Jumlah larva awal
Uji sitotoksisitas terhadap sel kanker payudara MCF-7
(rata-rata absorbansi pada sumur percobaan) % penghambatan = --- x 100
(rata-rata absorbansi dalam sumur kontrol)
Identifikasi morfologi kapang
Isolat kapang endofit yang memiliki aktivitas tertinggi diidentifikasi secara morfologi. Identifikasi morfologi dilakukan baik secara makroskopik maupun mikroskopik. Pada pengamatan makroskopik isolat kapang diamati berdasarkan warna, permukaan koloni, garis-garis radial atau lingkaran konsentrasinya. Pada pengamatan secara mikroskopik, terlebih dahulu isolat k
