KAJIAN MIKROENKAPSULASI BIOINSEKTISIDA
DARI
Bacillus thuringiensis
INDRA BAYU NAFARI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
ii
PERNYATAAN MENGENAI THESIS DAN SUMBER
INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa thesis Kajian Mikroenkapsulasi dari
Bacillus thuringiensis adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruang tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir thesis ini.
Bogor, 29 Januari 2012
Indra Bayu Nafari
ABSTRACT
INDRA BAYU NAFARI. Study of microencapsulated bioinsecticide from
Bacillus thuringiensis. Supervised by MULYORINI RAHAYUNINGSIH and TITI CANDRA SUNARTI.
Bacillus thuringiensis is one of well known bioinsecticide resources. Bioinsecticide is utilized in organic farming for the replacement of chemical insecticide. Weaknesses of B. thuringiensis toxin are easily disrupted by ultra violet from sunlight and easily washed by rain. The purposes of this research were to produce microencapsulated B. thuringiensis and to produce microencapsulated formula for the protection of toxin active ingredient from the environmental factor. The experimental result showed maltodextrin can be used as an encapsulation material for bioinsecticide using spray drying process. Lactose could not be used as an microencapsulation agent in spray dryin process, especially for areas with high humidity levels due to its low Tg ( Temperature of glass transition) characteristic. Increase ratio in concentration of encapsulation material increased the number of spores contained but gave lower product toxicity. Result showed that 5% maltodextrin concentration produce highest level product of toxicity, but because of poor quality of encapsulation material formed, the product showed high level of degradation after drying process. Rainfall simulation test showed that product encapsulated by maltodextrin gave increase persistence against rain wash on leaf but it could not protect active ingredient deterioration caused by sunlight.
iv
RINGKASAN
Bacillus thuringiensis adalah salah satu sumber penghasil bioinsektida.
Bioinsektisida digunakan dalam pertanian organik sebagai pengganti insektisida sintetis. Penggunaan insektisida sintetis telah terbukti memiliki banyak efek negatif bagi lingkungan dan mahluk hidup, menyebabkan perlunya bioinsektisida sebagai alternatif pengganti.
Kekurangan yang dimiliki oleh bahan aktif yang dihasilkan oleh B. thuringiensishuringiensis adalah kerusakan yang diakibatkan paparan cahaya
matahari dan pencucian hujan dari permukaan daun. Mempermudah penggunaan produk dan menghasilkan tipe produk yang tepat menjadi permasalahan yang harus dipecahkan dalam menghasilkan formulasi produk bioinsektisida. Tipe produk mikroenkapsulasi merupakan salah satu formulasi produk yang dapat menjawab permasalahan-permasalahan tersebut.
Tujuan penelitian ini adalah mengkaji pengaruh kondisi pengoperasian alat
spray dry , yakni : suhu inlet, suhu outlet dan laju pompa alir, terhadap mutu
serbuk yang dihasilkan. Memperoleh pengaruh perbedaan bahan enkapsulan maltodekstrin dan laktosa terhadap mutu serbuk bioinsektisida yang dihasilkan. Tujuan lainnya adalah untuk mengkaji pengaruh konsentrasi bahan enkapsulan yang digunakan terhadap karakteristik produk yang dihasilkan, yakni : jumlah spora, nilai LC50 dan potensi toksisitas yang dimiliki.Memperoleh pengaruh sinar
matahari dan curah hujan terhadap kemampuan toksisitas produk yang diaplikasikan pada tanaman.
Penelitian menghasilkan bahwa suhu yang digunakan pada pengoperasian mesin spray dryer dan kecepatan pompa berpengaruh terhadap proses dan mutu serbuk yang dihasilkan. Suhu optimum yang diperoleh adalah 120 oC untuk inlet,
70 oC untuk outlet dan kecepatan pompa 50 ml/min.
Maltodekstrin lebih cocok digunakan sebagai bahan enkapsulan pada proses yang menggunakan pemanasan seperti pada alat spray dryer dibandingkan bahan
laktosa. Kadar air produk yang dihasilkan juga berpengaruh terhadap rendemen yang didapatkan, konsentrasi bahan enkapsulan 5% memiliki kandungan kadar air tertinggi dan rendemen terendah dibandingkan konsentrasi 10%. Konsentrasi 5% bahan enkapsulan menghasilkan nilai LC50 tertinggi yakni 0.003 g/ml dan nilai
© Hak Cipta Milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
vi
KAJIAN MIKROENKAPSULASI BIOINSEKTISIDA
DARI
Bacillus thuringiensis
INDRA BAYU NAFARI
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Teknologi Industri Pertanian
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
ii
Lembar Pengesahan
Judul Tesis : Kajian Mikroenkapsulasi Bioinsektisida dariBacillus thuringiensis
Nama : Indra Bayu Nafari
NIM : F351090091
Disetujui Oleh Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Mulyorini Rahayuningsih, M.Si Ketua
Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, M.Si Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Teknologi Industri Pertanian
Dr. Ir. Machfud, MS
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga penelitian ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian ini adalah Kajian Mikroenkapsulasi Bioinsektisida dari Bacillus thuringiensis.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr.Ir. Mulyorini Rahayuningsih, M.Si dan Ibu Dr.Ir. Titi Candra Sunarti,M.Si selaku pembimbing, serta teman-teman semuanya yang telah memberikan saran dan dukungan sehingga penulisan hasil penelitian ini selesai dibuat.
Semoga hasil penelitian ini bermanfaat.
Bogor, 29 Juni 2012
iv
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Samarinda pada tanggal 9 Januari 1984 dari ayah Ir.Muhtadin Nafari dan ibu Ernawati Said. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ...vi
DAFTAR GAMBAR ...vi
DAFTAR LAMPIRAN ...vii
PENDAHULUAN ...1
Latar Belakang ...2
Tujuan Penelitian ...3
Manfaat Penelitian ...3
Ruang Lingkup Penelitian ...3
TINJAUAN PUSTAKA ...4
Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis) ...4
Toksin B. thuringiensis ...5
Enkapsulasi Spora dan Kristal Bt ...7
Bahan–bahan Enkapsulasi ...8
BAHAN DAN METODE PENELITIAN ...12
Kerangka Pemikiran ...12
Alat dan Bahan ...13
Tempat penelitian ...14
Metode penelitian ...14
HASIL DAN PEMBAHASAN ...22
Proses produksi bahan aktif boinsektisida ...22
Proses mikroenkapsulasi bioinsektisida ...29
Pengaruh lingkungan terhadap toksisitas produk bioinsektisida ...54
KESIMPULAN DAN SARAN ...62
DAFTAR PUSTAKA ...64
vi
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Klasifikasi Bt sebagai sumber insektisida ... 5
2. Komposisi kebutuhan mineral pada medium fermentasi B. thuringiensis ... 14 3. Komponen kimiawi limbah cair tahu dan air kelapa ... 22 4. Kandungan nutrisi air kelapa ... 22 5. Perbandingan karakter bahan fermentasi yang didapatkan dengan
penelitian sebelumnya ... 24 6. Kandungan nutrisi daun brokoli dan sawi hijau ... 27 7. Pengaruh kondisi operasi mesin spray dryer terhadap kinerja mesin dan
produk yang dihasilkan dengan konsentrasi maltodekstrin 10%... 29 8. Pengaruh jenis bahan enkapsulan terhadap produk yang dihasilkan ... 34 9. Pengaruh kosentrasi bahan enkapsulan maltodekstrin terhadap karakter
produk ... 44
10.Perbandingan komposisi δ-endotoksin subsp. aizawai dan berliner ... 46
11.Perbandingan komposisi asam amino antara sampel fermentasi dan
produk komersial Bactospeine... 48 12.Perbandingan kenaikan nilai potensi dan penurunan nilai log VSC antara
dua jenis proses mikroenkapsulasi dengan konsentrasi bahan enkapsulan
spray drying 5% maltodekstrin dan freeze drying 6% laktosa ... 49
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Spora dan bentuk kristal B. thuringiensis subsp. aizawai ...4
2. Struktur protein δ-endotoksin...6
3. Rumus polimer laktosa dan maltodekstrin ...11
4. Kerangka pemikiran pada penelitian ...14
5. Mesin spray dryer ...18
6. Pengaruh jenis bahan enkapsulan terhadap penampakan produk yang dihasilkan ...37
7. Pengaruh konsentrasi bahan enkapsulan terhadap permukaan partikel yang terbentuk dari proses mikroenkapsulasi ...42
8. Penampakan sampel serbuk bioinsektisida setelah penyimpanan selama 6 bulan ...42
9. Perbandingan permukaan daun yang diberi perlakuan berbeda ...51
10.Efek fitotoksik bioinsektisida pada tanaman...52
11.Perbandingan bahan aktif sebelum dan sesudah proses mikroenkapsulasi ...53
viii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Pendahuluan
1. Latar BelakangPenggunaan insektisida kimia telah membuktikan tingkat efektivitas yang tinggi bagi pengendalian serangga, akan tetapi mengingat potensi pencemaran lingkungan yang dapat diakibatkan dan tingkat bahaya langsung yang dapat ditimbulkan bagi mahluk hidup lain, maka penggunaan insektisida kimiawi mulai dibatasi. Hasil penelitian yang telah dilakukan mengungkapkan bahwa penggunaan insektisida kimia di Indonesia pada umumnya telah disalahgunakan (Nugrahani 2005). Penelitian tersebut juga mengungkapkan bahwa residu produk-produk insektisida yang tersisa pada komoditas sayuran beberapa daerah di Indonesia telah melampaui Batas Maksimum Residu (BMR) yang telah ditetapkan dalam Keputusan Bersama Menteri Kesehatan dan Menteri Pertanian No. 881/Menkes/SKB/VIII/1996 dan 711/Kpts/TP.270/8/1996, sehingga diperlukan alternatif lain yang dapat menggantikan insektisida kimiawi.
Salah satu pilihan untuk menggantikan insektisida kimawi adalah bioinsektisida. Salah satu cara untuk mendapatkan bioinsektisida adalah melalui fermentasi oleh bakteri, diantaranya adalah Bacillus thuringiensis. Bioinsektisida yang dihasilkan yang memiliki kelebihan yakni sumber bahan bakunya bersifat alami, sehingga mudah terdegradasi oleh alam dan umumnya bersifat toksin spesifik terhadap serangga sehingga tidak bersifat toksik bagi manusia (Hunsberger 2000).
Bioinsektisida yang dihasilkan oleh B. thuringiensis mendominasi pasaran
2
Kekurangan yang dimiliki oleh bahan aktif yang dihasilkan oleh B. thuringiensishuringiensis adalah kerusakan yang diakibatkan paparan cahaya
matahari dan pencucian hujan dari permukaan daun. Mekanisme aktivasi oral bagi bahan aktif juga memberikan tantangan tersendiri bagi formula produk bioinsektisida B. thuringiensis. Mempermudah penggunaan produk dan
menghasilkan tipe produk yang tepat menjadi permasalahan yang harus dipecahkan dalam menghasilkan formulasi produk bioinsektisida. Tipe produk mikroenkapsulasi merupakan salah satu formulasi produk yang dapat menjawab permasalahan-permasalahan tersebut.
Penelitian produk bioinsektisida mencakup beberapa aspek diantaranya adalah proses fermentasi, proses formulasi, rekayasa alur proses dan usaha teknologi rekombinasi genetik pada bakteri serta pada tanaman transgenik. Usaha penelitian tentang produksi bioinsektisida dari Bt telah banyak dilakukan di Indonesia. Namun penelitian-penelitan yang sering dilakukan adalah proses fermentasi dan usaha rekombinasi genetik akan tetapi penelitian dalam bidang formulasi masih jarang ditemukan. Penelitian ini bertujuan untuk melengkapi ketersediaan informasi tentang hasil-hasil penelitian sebelumnya, karena proses formulasi adalah proses yang menentukan bentuk produk yang akan dipasarkan dan digunakan oleh konsumen.
Formulasi Bt di pasar terdiri atas: tipe cairan dan tipe padatan (Burges 1998). Meninjau dari lahan aplikasi yang akan dituju adalah lahan perkebunan
Bacillus thuringiensis subsp. aizawai lebih cocok untuk diformulasikan dalam
2. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan produk serbuk mikroenkapsulasi bioinsektisida dari B. thuringiensis. Secara khusus dari
penelitian ini akan dihasilkan:
1) Kondisi pengoperasian alat spray dryer, yakni: suhu inlet, suhu outlet dan
laju pompa alir, terhadap mutu serbuk yang dihasilkan.
2) Informasi pengaruh perbedaan bahan enkapsulan maltodekstrin dan laktosa terhadap mutu serbuk bioinsektisida yang dihasilkan.
3) Informasi pengaruh konsentrasi bahan enkapsulan yang digunakan terhadap karakteristik produk yang dihasilkan, yakni : jumlah spora, nilai LC50 dan potensi toksisitas yang dimiliki.
4) Informasi pengaruh bahan mikroenkapsulasi yang digunakan terhadap ketahanan bahan aktif pada sinar matahari dan curah hujan.
3. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan akan bermanfaat sebagai pedoman dalam mengembangkan dan menghasilkan produk bioinsektisida dari Bt. Penelitian diharapkan menghasilkan kondisi operasional alat yang optimum, formula yang dapat membantu kemudahan penggunaan oleh konsumen dan efisiensi fungsi patogenitasnya.
4. Ruang Lingkup Penelitian
1. Produksi bahan aktif bioinsektisida Bacillus thuringiensis subsp. aizawai
dengan media cair limbah cair tahu dan air kelapa menggunakan sistem fermentasi skala laboratorium.
2. Proses mikroenkapsulasi menggunakan bahan enkapsulan maltodekstrin dan laktosa.
3. Karakterisasi produk yang dihasilkan terhadap serangga uji Crocidolomia pavonana dengan menggunakan analisis beda nilai tengah Tukey-Kramer
dan model Probit.
4. Menguji pengaruh lingkungan terhadap toksisitas produk terhadap serangga uji C. pavonana dengan menggunakan analisis beda nilai tengah
Tinjauan Pustaka
1. Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis)
B. thuringiensis merupakan bakteri yang tergolong ke dalam Gram positif
dan mampu membentuk spora (Gambar 1). Ciri khas bakteri ini memiliki kemampuan untuk membentuk kristal inklusi selama proses sporulasi. B. thuringiensis memiliki kedekatan dengan beberapa spesies Bacillus lainnya yang
sudah dikenal, antara lain B.cereus dan B.antrachis (penghasil antraks) (Glare &
O’callaghan 2000). Jenis Bacillus ini diketahui memiliki sifat aerob dan hanya
memiliki perbedaan mencolok pada susunan plasmidnya.
B. thuringiensis pertama kali ditemukan oleh ilmuwan Jepang Shigetane Ishiwata pada tahun 1901 kemudian pada tahun 1911 ditemukan oleh Berliner dalam isolat Mediteranian flour moth. B. thuringiensis biasa terdapat di dalam lambung beberapa spesies ulat dan kupu-kupu, walaupun hasil penelitian lain menunjukkan beberapa spesies B. thuringiensis ditemukan pada media tanah dan debu (Oregon State University 2000; Öztürk et al.. 2009). B. thuringiensis akan terus tumbuh pada fase vegetatif dalam media yang kaya akan nutrisi, namun apabila pasokan pakan menurun maka B. thuringiensis akan mulai membentuk
spora dan menghasilkan kristal protein δ. Penggunaan komersial B. thuringiensis
sebagai produk bioinsektisida dimulai di Hungaria pada akhir tahun 1920 dan terhenti ketika Perang Dunia II. Revolusi Hijau setelah PD II B. thuringiensis
menandai pengembangan B. thuringiensis sebagai sumber bioinsektisida potensial
(Rosas-Garcia 2009).
Gambar 1 Spora dan bentuk kristal B. thuringiensis subsp. aizawai (Sumber:
Beberapa jenis B. thuringiensis yang sudah dikenal adalah kurstaki, aizawai, sotto, entomocidus, berliner, san diego, tenebroid, morrisoni dan israeliensis
(Bahagiawati 2002). Penggolongan subspesies dari B. thuringiensis ditemukan
beberapa cara disebabkan adanya perbedaan pendapat diantara para ilmuwan taksonomi dalam mendefinisikan dan mengelompokkan B. thuringiensis. Salah
satu perbedaan pendapat dalam pengelompokan ini adalah pengelompokkan B. thuringiensis dan Bacillus cereus. Beberapa metode yang digunakan dalam
mengelompokkan B. thuringiensis adalah metode klasik (metode fenotipe dan
serotipe) dan metode berbasis DNA (Glare & O’callaghan 2000). Para ilmuwan yang memberi perhatian khusus dalam pemanfaatan B. thuringiensis sebagai
insektisida mengelompokkannya menjadi delapan kelas (Tabel 1). Tabel 1 Klasifikasi B. thuringiensis
Kelas Jenis Kristal Protein Kelompok Hama Target I Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Cb, Cry1F Lepidoptera
II CryIIA, CryIIB, CryIIC Lepidoptera III CryIIIA, CryIIIB, CryIIIC Koleoptera
IV CryIVB, CryIVC Diptera
V CryV Lepidoptera dan Koleoptera
VI CryVI Nematoda
VII CryIXF Lepidoptera
VIII CryX Lepidoptera
Sumber : Bahagiawati (2002) 2. Toksin B. thuringiensis
Toksin yang mampu diproduksi oleh B. thuringiensis dari masing-masing
spesies adalah (Hunsberger 2000): 1. Endotoksin: sebagai agen insektisida
2. Eksotoksin: bersifat racun bagi mamalia pada dosis tinggi 3. Haemolysin
4. Enterotoksin
5. Protein insektisida vegetatif
6
dari jumlah total B. thuringiensis (Glare & O’callaghan 2000). δ-endotoksin
secara molekular berwujud sebagai protein dengan ukuran 130 sampai140 kDa (Gambar 2). Fungsi utama toksisitas endotoksin adalah merusak organ pencernaan serangga, sehingga toksin ini disebut racun perut.
Protein δ-endotoksin disandikan oleh gen Cry dan gen Cyt. Aktivitas yang
dikodingkan dua jenis gen ini berbeda, endotoksin sitolitik tidak memiliki sifat toksin spesifik untuk spesies serangga tertentu. Protein memiliki sifat pathogen setelah dicerna oleh enzim protease di dalam saluran pencernaan serangga. Bentuk kristal protein berbeda-beda dan memiliki spesifitas aktivitas terhadap serangga yang berbeda. Struktur bipiramid diidentifikasi memiliki aktifitas patogen terhadap Lepidoptera, sedangkan bentuk oval dan kubus diidentifikasi memiliki aktifitas patogen terhadap Lepidoptera dan Diptera(Glare et al. 2000).
Proses aktivasi protein merupakan proses pemotongan rantai panjang protein menjadi bentuk sederhana (27 sampai 149 kDa) oleh enzim protease yang dimiliki oleh serangga serta berlangsung dalam suasana alkali (pH >9.5) (Rosas-Garcia 2009). Masing-masing jenis endotoksin memiliki situs pemotongan enzim (domain) pada badan proteinnya dan situs reseptor spesifik pada dinding sel serangga (Gambar 2). Setelah teraktivasi, proses pengrusakan dinding sel usus serangga terjadi selama beberapa jam.
Fase awal dari pengikatan endotoksin dengan dinding sel terjadi ketika toksin membentuk konformasi yang menyebabkan toksin dapat masuk ke dalam membran sel. Peristiwa oligomerasi akan muncul dan menyebabkan terbentuknya pori-pori ionik, yang akan mengganggu kesetimbangan osmotik di dalam sel (Rosas-Garcia 2009). Setelah sel-sel usus rusak dan menyebabkan kebocoran pada dinding usus, maka sel-sel vegetatif B. thuringiensis akan menyebar di
dalam tubuh serangga menyebabkan septicaemia dan kemudian kematian.
Pusztai et al. (1991) menjelaskan bahwa mekanisme kerusakan kristal
protein oleh sinar matahari disebabkan pemutusan rantai peptida protein, terutama residu triptofan. Hasil penelitian tersebut juga menjelaskan bahwa beberapa rantai cabang amino seperti gugus indole juga hancur karena kerusakan sinar matahari. 3. Enkapsulasi Spora dan Kristal B. thuringiensis
Formulasi didefinisikan sebagai suatu usaha untuk mengawetkan bahan aktif, menyampaikan bahan aktif tersebut kepada target kemudian meningkatkan aktivitas bahan aktif (Burges 1998). Formula sebuah produk menentukan performa produk tersebut di tangan konsumen dan di lapangan. Beberapa faktor yang mempengaruhi jenis formulasi yang dipilih adalah jenis organisme, lingkungan yang dituju dan tipe aksi dari bahan aktif tersebut. B. thuringiensis memiliki tipe aksi yang unik, yaitu harus termakan dan berada di saluran pencernaan.
Metode enkapsulasi spray dryer adalah metode yang berprinsip proses penguapan media air yang menjadi penghantar bahan yang telah teremulsi sehingga terbentuk mikropartikel yang mengenkapsulasi bahan aktif dengan rapat. Metode ini memiliki beberapa keuntungan yang diberikan, antara lain akan melindungi bahan aktif dari pengaruh lingkungan, memiliki waktu shelf life yang
lebih lama, tidak kamba, biaya yang diperlukan per luas daerah aplikasi lebih
kecil karena konsentrasi dari bahan tambahan yang digunakan per luas area aplikasi lebih konstan, dan mengandung bahan kimia lebih sedikit (Tamez-Guerra
et al.. 1996). Bahan tambahan yang digunakan pada umumnya adalah bahan yang
meniru komposisi daun yakni terdiri dari karbohidrat, protein dan lemak.
8
(1988) telah menyebutkan bahwa penggunaan pati sebagai bahan enkapsulan berpeluang digunakan untuk formulasi sebagai bahan aktif dan meningkatkan efikasi dari produk. Penggunaan lebih lanjut pada formulasi B. thuringiensis
menunjukkan bahwa bahan enkapsulan berbahan dasar karbohidrat dapat meningkatkan tingkat toksisitas produk dan meningkatkan persistensi produk terhadap faktor-faktor lingkungan yakni hujan dan sinar matahari (McGuire dan Shasha 1990; McGuire et al.. 1990; McGuire et al.. 1994). Formulasi enkapsulan
berbahan dasar karbohidrat ternyata tidak hanya menunjukkan hasil positif pada formulasi produk B. thuringiensis tapi juga untuk Entomopoxvirus (Mcguire et al.
1991 ; McGuire et al. 2001). Penelitian yang dilakukan oleh Ali et al. (1994) juga
menunjukan bahwa penggunaan karbohidrat yakni tongkol jagung, juga dapat meningkatkan potensi toksin yang dimiliki oleh B. thuringiensis. Formulasi yang dihasilkan pada saat itu masih berbentuk granula dan terpisah antara produk bioinsektisida dan bahan enkapsulan. Pemanfaatan formulasi produk bioinsektisida yang dihasilkan pada tahun-tahun awal dihadapkan oleh beberapa kendala yakni ketidaklarutan produk yang dihasilkan menyebabkan pencampuran dengan air pada saat peyemprotan menjadi kendala yang harus dipecahkan. Kendala yang dihadapi pada awal-awal digunakannya bahan enkapsulan karbohidrat adalah kemampuan larut produk yang dihasilkan sehingga menyebabkan pencampuran dengan air pada saat penyemprotan mengakibatkan penyumbatan pada alat penyemprot. Alasan ketidakpraktisan juga menjadi penyebab dikembangkannya formulasi produk yang lebih baik karena pengguna harus mencampur bahan enkapsulan dan bahan bioinsektisida secara manual.
daripada produk komersial tanpa mengurangi efek toksisitasnya (Tamez-Guerra et al.. 1996).
Pemberian perlakuan tambahan pada formulasi seperti pengaturan tingkat keasaman juga mempengaruhi toksisitas produk yang dihasilkan. Behle et al.
(1997a) menyebutkan bahwa peningkatan derajat keasaman (pH) dalam formulasi dengan menggunakan KOH dapat meningkatkan toksisitas yang dihasilkan hingga mendekati pH 12. Kondisi pH produk lebih dari 12 mengakibatkan penurunan toksisitas produk. Keadaan tersebut dapat diatasi dengan penggunaan gluten sebagai bahan enkapsulan. Gluten dapat mempertahankan tingkat toksisitas pada saat pH produk ditingkatkan hingga pH 13. Penggunaan gluten juga menunjukkan peningkatan persistensi terhadap curah hujan. Hal itu disebabkan lapisan film yang terbentuk dapat membentuk lapisan penahan dari pencucian hujan.
4. Bahan-Bahan Enkapsulan
Proses enkapsulasi banyak digunakan dalam industri-industri untuk membentuk produk mereka. Bahan enkapsulasi dapat terdiri dari berbagai macam tergantung keperluan serta tujuan dari produsen. Contoh bahan enkapsulasi yang sering digunakan adalah: lilin atau lemak, protein, karbohidrat dan beberapa polimer food grade seperti polipropilen, polistiren dan polibutadien (Lakis 2007).
Prinsip dasar terbentuknya material serbuk yang terenkapsulasi belum banyak diketahui secara pasti oleh para ahli, namun beberapa hipotesis mengenai simulasi proses yang terjadi dan faktor yang mempengaruhi telah banyak diajukan. Wang dan Langrish (2009) membahas hipotesis simulasi proses enkapsulasi pada spray drying dan menyatakan secara umum para ahli sepakat
10
oleh kemampuan difusi material dalam pelarut yang digunakan serta aktivitas permukaan dari material tersebut (Kim et al.2003).
Kemampuan difusi bahan menjadi hipotesis untuk menjelaskan terjadinya segregasi dalam proses enkapsulasi. Pada saat proses pengeringan dan penguapan pelarut terjadi maka material yang mudah larut dalam pelarut yang digunakan cenderung untuk bergerak dari luar ke dalam partikel serbuk yang terbentuk. Seiring dengan pengerasan material yang terjadi dari luar ke dalam, bahan yang mudah larut akan terbentuk sebagai inti dari partikel. Hipotesa kedua adalah kemampuan aktivitas permukaan dari material yang digunakan. Material yang memiliki aktivitas permukaan lebih besar cenderung akan bergerak ke luar pada saat penguapan dan berfungsi sebagai dinding enkapsulan.
Karbohidrat memiliki peran penting dalam proses enkapsulasi. Karbohidrat telah banyak digunakan untuk enkapsulasi flavor, mineral, vitamin dan probiotik. Kemampuan yang dimiliki karbohidrat untuk membentuk polimer fase amorphous dalam mengikat inti terenkapsulasi menjadi fungsi penting dalam proses enkapsulasi (Gharsallaoui et al. 2003; Lakis 2007). Fase ini disebut sebagai fase
glass transition. Proses pengeringan atau spray dryer menguapkan air atau pelarut yang digunakan dengan cepat sekali dan tidak memberi kesempatan bagi karbohidrat untuk berkristalisasi (Barreto 2008). Beberapa material karbohidrat yang sering digunakan dalam proses enkapsulasi adalah laktosa dan maltodekstrin (Lakis 2007).
Laktosa (Gambar 3) merupakan polimer disakarida yang terdiri atas monomer galaktosa dan glukosa. Produk ini banyak terkandung dalam susu atau susu skim. Bahan ini adalah bahan awal yang digunakan untuk membuat produk bionsektisida granular (Dulmage 1990). Bahan ini mulai tergantikan dengan beberapa kombinasi lain seiring dengan meningkatnya penelitian formulasi produk padat dari bioinsektisida B. thuringiensis. Maltodekstrin adalah produk
(a) (b)
Bahan dan Metode Penelitian
1. Kerangka Pemikiran
Bahan aktif bioinsektisida yang umum dihasilkan merupakan campuran dari kristal endotoksin dan spora bakteri. Permasalahan-permasalahan utama yang dihadapi oleh bahan aktif bioinsektisida B. thuringiensis adalah disebabkan
karakteristik kristal toksin yang berbentuk protein. Protein merupakan bahan yang tidak tahan panas dan dapat terdenaturasi oleh sinar matahari. Permasalahan lain adalah kendala aplikasi dan faktor alam pada saat aplikasi bahan yang dapat mengurangi efektifias kinerja bioinsekisida.
Proses enkapsulasi telah banyak diaplikasikan sebagai suatu cara untuk melindungi bahan aktif yang rentan terhadap kerusakan oleh lingkungan atau penyesuaian untuk memodifikasi waktu aktivasi dari bahan aktif terhadap target (Lakis 2007). Proses enkapsulasi didasarkan atas prinsip penyelubungan bahan aktif sebagai inti menggunakan bahan enkapsulan yang akan berfungsi sebagai dinding pelindung.
Penelitian-penelitian terdahulu dalam menghasilkan formulasi bioinsektisida
B. thuringiensis merupakan usaha untuk mencari alternatif lain dalam
menghasilkan formula produk selain bentuk cair yang memiliki banyak kekurangan teknis serta kendala dalam penggunaan. Produk formulasi padatan yang dapat dilarutkan yang dihasilkan dari rangkaian penelitian tersebut terbukti dapat meningkatkan efisiensi produk dalam waktu simpan, aplikasi dan kemampuan menstabilkan serta meningkatkan efektifitas bahan aktif dari produk bioinsektisida (Burges 1998).
Keunggulan lain dari penggunaan bahan enkapsulan menggunakan bahan-bahan organik adalah fungsinya sebagai atraktan atau umpan bagi serangga. Hal tersebut disebabkan karena pada umumnya formula bahan yang digunakan menyesuaikan dengan komposisi makanan yang biasa dikonsumsi oleh serangga tersebut. Dengan digunakannya bahan organik dalam formula juga mengurangi kekhwatiran akan timbulnya respon toksin bagi manusia.
permasalahan-permasalahan di atas menggunakan data pendukung dari rangkaian hasil penelitian sebelumnya sebagai pelengkap. Tahapan-tahapan percobaan pada penelitian dilakukan bertujuan untuk memberikan informasi lengkap berkaitan dengan proses produksi dan formulasi produk bioinsektisida.
Proses produksi bahan aktif dilakukan sesuai dengan hasil penelitian terdahulu menggunakan fermentasi cair. Proses pembuatan, enkapsulasi dan pengeringan dengan mesin spray dryer menggunakan tahapan prosedur yang telah
dikemukakan oleh Dulmage (1990) dengan beberapa penyesuaian. Dalam aplikasinya, produk yang dihasilkan diuji lanjut untuk memperoleh tingkat ketahanan yang dihasilkan terhadap sinar matahari dan pencucian hujan, berdasarkan prosedur yang dikemukakan oleh Tamez-Guerra et al. (2000) dengan beberapa penyesuaian.
Proses produksi bioinsektisida menghasilkan informasi dalam proses pengoperasian mesin, pengetahuan bahan dan karakteristik produk yang dihasilkan. Uji lanjut yang dilakukan bertujuan untuk memperoleh informasi tambahan tentang performa produk di lapangan pada saat aplikasi. Luaran yang didapatkan dari hasil penelitian ini diharapkan dapat dimanfaatkan dengan baik oleh produsen bioinsektisida dalam proses produksi dan bagi para petani dalam penggunaan produk ini nantinya. Kerangka pemikiran pada penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 4.
2. Alat dan Bahan
Bahan yang dipergunakan untuk memproduksi bahan aktif spora dan kristal toksin adalah: isolat Bacillus thuringiensis subsp. aizawai dari koleksi kultur IPB,
media NA (Nutrient Agar), etanol 95%, media limbah cair tahu, air kelapa,
mineral-mineral: MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, ZnSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, CaCO3,
CuSO4, urea. Bahan yang dipergunakan untuk produksi mikroenkapsulasi
14
kran, larva Crocidolomia pavonana dan produk bioinsektisida komersial merk
Bactospeine (Bacillus thuringiensis subsp. berliner).
Gambar 4 Kerangka pemikiran pada penelitian
Alat yang dipergunakan untuk produksi bahan aktif adalah inkubator shaker,
labu Erlenmeyer, peralatan gelas, ose, wadah penyimpan, penyaring dan cawan petri. Alat yang dipergunakan untuk produksi mikroenkapsulasi bioinsektisida adalah wadah penyimpan kedap udara dan wadah penampung, spray dryer,
kemudian mikroskop cahaya mikro dan Scanning Electron Microscope (SEM)
untuk pengataman karakterisasi produk yang dihasilkan. Alat yang dipergunakan untuk mengukur pengaruh lingkungan terhadap aktivitas produk adalah: cawan petri, penyemprot parfum, alat penyemprot tanaman dan kertas tisu.
3. Tempat penelitian
4. Metode Penelitian
Tahapan percobaan yang dilakukan sebagai berikut: 1) Proses produksi bahan aktif bioinsektisida
a. Proses Fermentasi
Media fermentasi yang digunakan adalah limbah cair tahu yang berfungsi sebagai sumber nitrogen dan karbon serta air kelapa sebagai sumber karbon yang bersifat gula siap fermentasi. Prosedur penyiapan media fermentasi dilakukan berdasarkan penelitian Aryati (2011) menggunakan sistem kultivasi media cair. Perbandingan optimum antara karbon dan nitrogen pada media telah ditetapkan 7:1 berdasarkan hasil penelitian Dulmage et al. (1990). Rachmawati (2011) menyatakan bahwa perbandingan antara jumlah limbah cair tahu dan air kelapa yang digunakan dalam media fermentasi untuk menghasilkan bahan aktif dengan toksisitas tertinggiadalah 4:1, sedangkan kebutuhan jumlah kebutuhan mineral untuk fermentasi B. thuringiensis disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Komposisi kebutuhan mineral pada medium fermentasi B.t
Komponen medium Konsentrasi
CaCO3 1.00 g/l
MgSO4. 7 H2O 0.30 g/l
MnSO4. 7 H2O 0.02 g/l
ZnSO4. 7 H2O 0.02 g/l
FeSO4. 7 H2O 0.02 g/l
Sumber :Dulmage & Rhodes (1971)
Medium fermentasi berupa limbah cair tahu dan air kelapa dicampurkan dengan seluruh mineral, lalu disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121
oC tekanan 1 atm selama 20 menit. Media yang sudah steril dimasukan ke
dalam labu Erlenmeyer sebanyak 5% volume total. Keasaman (pH) medium kemudian diperiksa dengan menggunakan indikator universal, pH optimum pertumbuhan B. thuringiensis antara 6 sampai 7. Proses fermentasi dimulai dengan menginokulasikan media fermentasi dengan biakan B. thuringiensis
subsp. aizawai dari agar miring, lalu diinkubasikan pada suhu ruang di atas
mesin shaker dengan kecepatan 180 rpm selama 72 jam. Hasil fermentasi
16
menggunakan kapas. Penyaringan bertujuan untuk memisahkan padatan yang masih terdapat dalam media, keberadaan padatan ini dapat mengganggu proses pengeringan pada mesin spray dryer. Selanjutnya larutan hasil fermentasi yang
telah disaring ini disebut larutan yang mengandung bahan aktif berupa campuran kristal δ-endotoksin dan spora bakteri B. thuringiensis.
b. Karakterisasi bahan aktif hasil fermentasi
Parameter yang dianalisis pada tahap ini adalah meliputi jumlah spora dengan metode VSC, perhitungan LC50 dan nilai potensi IU (International Unit)
menggunakan metode uji hayati. Standar yang digunakan untuk analisis toksisitas adalah produk komersial Bactospeine yang mengandung B. thuringiensis Berliner. Data toksisitas dianalisis dengan menggunakan model Probit pada software Polo-pc. Prosedur penentuan parameter tersebut dapat dilihat pada Lampiran 1.
2) Proses mikroenkapsulasi bioinsektisida
Bahan enkapsulan yang digunakan adalah laktosa dan maltodekstrin. Laktosa merupakan standar bahan enkapsulan yang umum digunakan dalam produk bioinsektisida berdasarkan penelitian Dulmage (1990). Maltodekstrin dipilih karena memiliki harga yang murah, bahan berasal dari karbohidrat serta kemudahan untuk memperoleh bahan tersebut.
a. Penetapan kondisi operasi spray dryer
Spray dryer bekerja dengan prinsip pengeringan dan aliran siklon sentrifugasi untuk menghasilkan produk serbuk. Bahan yang akan dikeringkan harus memiliki kekentalan dan kelarutan yang baik agar proses pemompaan sampel pada penyemprot proses atomisasi berjalan dengan lancar sehingga dihasilkan partikel yang baik. Suhu optimum yang digunakan untuk pengeringan sampel pada tabung inlet dan outlet juga harus ditentukan untuk menghasilkan
mutu serbuk yang diinginkan, karena setiap alat dan bahan yang akan dikeringkan memiliki karakteristik masing – masing (Dulmage 1990).
enkapsulan yang optimum adalah antara 5% sampai 10% (Burges 1998). Konsentrasi maltodekstrin yang digunakan adalah konsentrasi tertinggi (10%) karena menghasilkan kekentalan yang terbesar diantara konsentrasi bahan enkapsulan yang dikeringkan. Parameter operasi alat pada konsentrasi dan kekentalan yang tertinggi dapat mewakili parameter operasi untuk bahan dengan konsentrasi dan kekentalan yang lebih rendah. Parameter yang diukur pada tahap ini adalah analisis kekentalan larutan yang dihasilkan, kecepatan pompa penyemprot, suhu inlet dan suhu outlet mesin spray dryer.
Larutan hasil fermentasi yang mengandung bahan aktif disaring dengan kapas untuk memisahkan padatan dan dituangkan ke dalam wadah yang terpisah-pisah. Bahan enkapsulan maltodekstrin ditambahkan ke setiap larutan yang berada dalam wadah sebanyak 10% (b/v) sesuai dengan volume larutan fermentasi. Larutan kemudian ditambahkan larutan Tween 1% dan kemudian diaduk menggunakan stirer selama 30 menit.
Larutan kemudian dikeringkan dengan alat spray dryer (Gambar 5). Mesin mini spray dryer yang digunakan merupakan desain Prof. Dr. Ir Gumbira Said MADeV. Mesin memiliki spesifikasi sebagai berikut tinggi dan lebar tabung inlet
14.4 dm x 3.9 dm, tinggi dan lebar tabung inlet 6.6 dm x 2.0 dm, menggunakan sumber pemanas kompor gas dan blower mesin jet serta pompa kecil. Parameter laju alir divariasikan antara 30 ml/menit sampai 60 ml/menit, suhu outlet 100 oC sampai 150 oC , dan suhu inlet 50 oC sampai 100 oC. Setiap kombinasi parameter diperhatikan apakah ada penyumbatan (clogging) pada alat penyemprot dan
tabung inlet serta outlet. Penentuan sifat bebas alir dari serbuk yang dihasilkan
dilakukan dengan pengamatan visual. b. Pemilihan bahan enkapsulan
18
Prosedur penentuan mutu serbuk adalah dengan memperhatikan dan membandingkan sifat bebas alir dari serbuk yang dihasilkan, sedangkan prosedur penghitungan rendemen dapat dilihat pada Lampiran 1.
Gambar 5 Mesin spray dryer
c. Karakterisasi produk bioinsektisida mikroenkapsulasi
Produk terbaik dari analisis tahap sebelumnya dilihat karakteristik yang dimiliki. Parameter yang dianalisis adalah nilai VSC untuk jumlah spora yang dihasilkan, uji hayati untuk nilai toksisitas LC50 dari produk dan nilai potensi IU
dari toksin yang dimiliki oleh produk, keberadaan lapisan film, morfologi permukaan partikel serbuk dan uji fitotoksisitas produk. Pengamatan lapisan film dilakukan pada permukaan daun yang diberikan produk kemudian diamati dengan mikroskop cahaya mikro. Morfologi permukaan serbuk yang terbentuk dilihat dengan menggunakan mikroskop SEM. Prosedur analisis uji hayati, potensi dan VSC disajikan pada Lampiran 1.
dianalisis menggunakan metode perbandingan nilai tengah Tukey-Kramer menggunakan perangkat lunak CoStat. Data toksisitas dianalisis dengan menggunakan model Probit pada perangkat lunak Polo-pc.
Lapisan film yang dihasilkan diamati secara visual. Sampel produk bioinsektisida dan larutan fermentasi dilarutkan ke dalam larutan Agristick 0.1%. Kontrol yang digunakan adalah kontrol positif Agristick 0.1%. Daun brokoli dipotong dengan luas 4 cm x 4 cm. Daun lalu dicelupkan ke dalam masing-masing larutan dan dikeringanginkan. Permukaan daun diamati secara visual dan kemudian difoto.
Uji fitotoksisitas dilakukan pada tanaman brokoli organik. Permukaan daun dewasa pada tanaman ditandai dengan luas tertentu. Sampel produk bioinsektisida dan larutan fermentasi dilarutkan ke dalam larutan Agristick 0.1%. Kontrol yang digunakan adalah kontrol positif Agristick 0.1%. Masing-masing larutan disemprotkan pada hanya satu permukaan daun secara merata dan dijemur dibiarkan di bawah sinar matahari selama 72 jam.
3) Pengaruh lingkungan terhadap toksisitas produk bioinsektisida
Pengujian ini bertujuan melihat kemampuan bahan enkapsulan mempertahankan aktivitas bahan aktif bioinsektisida dari pengaruh lingkungan. Rancangan percobaan yang digunakan uji efektifitas bahan enkapsulan dan bahan tambahan pada formulasi produk adalah masing–masing untuk mengukur pengaruh perlakuan jenis bahan yang digunakan pada ketahanan terhadap UV, ketahanan lekat produk terhadap curah hujan dan efektifitas patogen dari produk-produk yang dihasilkan. Masing-masing percobaan dilakukan 3 kali pengulangan menggunakan rancangan percobaan faktorial dalam rancangan acak lengkap (RAL). Model yang digunakan adalah:
Yijk = µ + Ai+ Σij
i = 1,2,3 j = 1,2,3 Keterangan :
Yijk = Variabel respon dari hasil observasi ke-k yang terjadi karena pengaruh bersama taraf ke-i faktor perlakuan
20
Ai = pengaruh taraf ke-i faktor perlakuan jenis tepung
Σij = Galat percobaan dari perlakuan ke-i pada ulangan j
Masing-masing data yang didapatkan akan dianalisis ANOVA untuk melihat pengaruh masing-masing faktor perlakuan. Perlakuan yang menunjukkan perbedaan nyata dalam pengaruhnya terhadap respon yang diamati dianalisis lanjut menggunakan analisis beda nilai tengah Tukey-Kramer. Data dianalisis menggunakan perangkat lunak CoStat.
a. Produksi larva dan pemeliharaan serangga uji (Nailufar 2011)
Serangga uji yaitu larva C. pavonana yang digunakan dalam penelitian ini
adalah koloni yang diperbanyak di Laboratorium Fisiologi dan Toksikologi Serangga, Departemen Proteksi Tanaman, IPB. Imago C. pavonana dipelihara
dalam kurungan plastik kasa berbingkai kayu (50 cm x 50 cm x 50 cm) dan diberi pakan berupa larutan madu 10% yang diserapkan segumpal kapas kemudian digantungkan di dalam kurungan secara berkala. Daun brokoli yang tangkainya dicelupkan dalam tabung film berisi air diletakkan di dalam kurungan sebagai tempat peletakan telur. Kelompok telur pada daun brokoli dikumpulkan setiap hari. Setelah telur menetas, larva dipindahkan ke dalam wadah plastik (35 cm x 26 cm x 6 cm) berjendela kasa yang dialasi kertas stensil, dan diletakkan daun brokoli bebas pestisida sebagai pakannya. Larva instar kedua digunakan untuk pengujian. Bila tidak digunakan untuk pengujian, sebagian larva dipelihara lebih lanjut dalam wadah plastik berisi daun brokoli atau dimatikan dengan cara didinginkan pada suhu -2 oC. Menjelang berpupa, larva dipindahkan ke dalam wadah plastik lain yang berisi serbuk gergaji steril sebagai medium untuk berpupa. Pupa beserta kokonnya dipindahkan ke dalam kurungan plastik-kasa seperti di atas sampai muncul imago untuk pemeliharaan selanjutnya.
b. Uji hayati dengan simulasi hujan (Tamez-Guerra P et al.. 2000)
instar dua. Pengamatan jumlah mortalitas larva dilakukan per 24 jam selama 96 jam disertai dengan penggantian daun dan alas tisu.
c. Uji hayati dengan simulasi paparan sinar matahari (Tamez-Guerra P et al..
2000).
Hasil dan Pembahasan
1. Proses produksi bahan aktif bioinsektisida
a. Proses fermentasi
Produksi bahan aktif yang digunakan untuk produk bioinsektisida diperoleh dengan proses fermentasi bakteri Bacillus thuringiensis. Bahan aktif yang
dimaksudkan adalah protein kristal δ-endotoksin dan spora bakteri. Untuk memproduksi endotoksin komposisi media yang digunakan dalam proses fermentasi berpengaruh langsung terhadap tingkat toksisitas dan formulasi produk yang dihasilkan (Burges 1998). Jenis media yang dapat digunakan dalam proses fermentasi telah banyak diteliti dan Burges (1998) telah memberikan ulasan terhadap beberapa jenis komposisi media yang banyak digunakan dalam produksi bioinsektisida B. thuringiensis.
Media yang umum digunakan dalam proses produksi adalah media cair dan media semi padat. Proses fermentasi menggunakan media cair lebih mudah dilakukan daripada media semi padat untuk menghasilkan produk yang akan diolah lebih lanjut untuk keperluan formulasi produk. Hal tersebut disebabkan media cair dapat mengurangi proses lanjutan yang diperlukan untuk menyiapkan bahan aktif.
Penggunaan media sintetik yang terdiri dari isolat bahan–bahan murni, dapat digantikan dengan menggunakan media alami dari alam. Media alami dapat diperoleh dari limbah atau hasil samping agroindustri yang masih mengandung nutrisi lengkap atau menggunakan bahan sumber nabati atau hewani lainnya. Contoh media yang berasal dari limbah dan dikembangkan untuk fermentasi B. thuringiensis adalah media limbah pengolahan kacang-kacangan dan limbah
darah sapi (Obeta & Okafor 1984) serta padatan dari limbah pengolahan air (Brar
et al. 2007).
masih tergolong tinggi, sehingga apabila dibuang ke badan air akan memiliki potensi pencemaran dengan menurunkan mutu air yang cukup besar.
Air kelapa banyak dimanfaatkan sebagai salah satu sumber media fermentasi karena mengandung gula-sederhana dan vitamin serta mineral (Tabel 4). Prabakaran et al. (2007) menyebutkan fermentasi dengan media air kelapa
dapat menghasilkan tingkat toksisitas dan jumlah spora yang sama dengan menggunakan media konvensional. Priatno (1999) dan Sriganti (2000) juga memperoleh hasil yang sama dalam menggunakan air kelapa sebagai media fermentasi B. thuringiensis, bahwa air kelapa dapat digunakan sebagai bahan baku
media fermentasi B. thuringiensis. Penggunaan air kelapa dan limbah cair tahu
dapat mengurangi biaya yang dibutuhkan untuk memproduksi bioinsektisida B. thuringiensis.
Tabel 3 Komponen kimiawi limbah cair tahu dan air kelapa
Komponen
b. Karakteristisasi bahan aktif hasil fermentasi
Analisis karakteristik yang dilakukan terhadap larutan hasil fermentasi adalah jumlah kandungan spora (viable spore count/ VSC) dan analisis LC50 serta
potensi dari uji hayati terhadap larva Crocidolomia pavonana. Jumlah spora yang
dihasilkan dapat menggambarkan keberadaan kristal endotoksin yang dimiliki oleh bahan aktif yang didapatkan.
24
Jenis spora B. thuringiensis tertentu dapat memiliki toksisitas langsung
terhadap larva atau membantu kerusakan yang diakibatkan δ-endotoksin pada
pencernaan serangga (Tang et al. 1995; Johnson 1996; Glare & O’Callaghan
2000). Akan tetapi perbandingan jumlah spora yang dihasilkan antara dua bakteri yang berbeda tidak dapat dijadikan parameter untuk menentukan bakteri mana yang memiliki tingkat toksisitas terbaik. Tingkat toksisitas sesungguhnya yang dimiliki oleh bahan aktif dapat diperoleh melalui uji hayati.
Tabel 4 Kandungan nutrisi air kelapa
Komponen Jumlah
Asam nikotinat (mg/l) 0.600 Asam pantotenat (mg/l) 0.520 Biotin (mg/l) 0.020
Sumber: Tuleckle (1961) dan Ketaren (1978) diacu dalam Priatno (1999)
Perbedaan nilai tersebut apabila dipandang dari sisi toksisitas produk yang dihasilkan, semata-mata hanyalah menggambarkan adanya toksin kristal yang dihasilkan akan tetapi tidak menggambarkan perbedaan jumlah yang dihasilkan atau tingkat toksisitas yang dihasilkan. Hal tersebut disebabkan karena jumlah spora tidak dapat dipergunakan untuk membandingkan tingkat toksisitas antar sampel karena jumlah spora tidak berbanding lurus dengan tingkat toksisitas yang dihasilkan (Nelly 2012). Akan tetapi nilai spora penting untuk melihat perkembangan bakteri dan pembentukan kristal endotoksin pada proses fermentasi. Hal tersebut disebabkan karena pembentukan kristal endotoksin berjalan pada masa sporulasi. Oleh karena itu perbandingan jumlah spora yang dimiliki dua sampel yang berbeda tidak dapat dipergunakan untuk membandingkan tingkat toksisitas yang dimiliki masing-masing sampel.
Tabel 5 Perbandingan karakteristik sampel pada hasil penelitian ini, hasil penelitian sebelumnya dan produk komersial.
LC50 standar pada percobaan sebelumnya = 0.05 x 10-6 (g/ml)
Daun yang digunakan pada pengujian ini adalah daun brokoli, daun yang digunakan pada penelitian sebelumnya adalah daun sawi hijau.
Nilai LC50 merupakan parameter yang digunakan untuk mengukur dosis
yang dibutuhkan dari bahan aktif untuk membunuh 50% populasi serangga. Dulmage (1990) menyatakan bahwa untuk menyatakan tingkat toksisitas yang dimiliki oleh bioinsektisida B. thuringiensis tidak cukup hanya melalui
pengukuran LC50, akan tetapi diperlukan juga nilai potensi. Nilai LC50 dari suatu
26
oleh bahan aktif yang berbeda pada satu saat pengukuran yang sama, sedangkan untuk hasil pengukuran yang dilakukan pada waktu yang berbeda digunakan nilai potensi.
Hasil perhitungan potensi yang dimiliki sampel uji berasal dari rasio perbandingan nilai LC50 antara sampel dan LC50 standar yang diukur pada waktu
yang sama. Rumus perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 1. Perhitungan potensi memerlukan produk bahan aktif standar yang memiliki nilai potensi yang telah terukur. Produk standar yang digunakan pada percobaan ini dan percobaan sebelumnya adalah sama dan memiliki nilai potensi 16000 IU/mg.
Nilai LC50 yang dihitung adalah berdasarkan bobot total padatan dari
larutan fermentasi. Sesungguhnya pengukuran LC50 akan lebih akurat jika hanya
berdasarkan bobot kristal endotoksin dan spora. Akan tetapi, pengukuran bobot kristal endotoksin dan spora saja dari larutan fermentasi cukup sulit dilakukan, oleh karena itu, digunakan asumsi bobot total padatan. Kandungan yang terdapat dalam total padatan larutan fermentasi adalah total sel hidup, total spora, padatan
media fermentasi dan kristal δ-endotoksin. Jumlah total padatan pada larutan
fermentasi adalah 0.01 g/ml.
Nilai LC50 yang dimiliki larutan fermentasi pada percobaan ini adalah
sebesar 0.062 g/ml. Hal tersebut berarti untuk mematikan 50% serangga dengan jumlah total 10 ekor serangga diperlukan sekitar 5 ml cairan fermentasi. Jumlah tersebut terlalu kecil untuk keperluan aplikasi di lapangan. Hal tersebut mendukung alasan diperlukannya sebuah produk yang lebih terkonsentrat untuk keefektifan penggunaan.
Dibandingkan dengan yang didapatkan oleh Aryati (2011) (Tabel 5) nilai LC50 yang didapat pada percobaan ini lebih besar. Hasil LC50 yang lebih besar
menandakan tingkat toksisitas yang lebih kecil. Oleh karena itu, semakin kecil nilai LC50 maka semakin baik tingkat toksisitas yang dimiliki.
Nilai potensi yang diperoleh adalah 7.7 IU/mg. Nilai potensi akan berbanding terbalik dengan nilai LC50. Semakin besar nilai potensi yang dimiliki,
LC50 standar pada percobaan ini lebih kecil (0.03) dibandingkan dengan
percobaan sebelumnya (2.5). Nilai LC50 standar pada percobaan ini juga
mengalami peningkatan dibandingkan pengukuran pada percobaan sebelumnya. Perbedaan hasil toksisitas (LC50 dan potensi) yang didapatkan dibandingkan
dengan percobaan sebelumnya diduga disebabkan karena metode yang digunakan pada penelitian ini berbeda dengan yang digunakan oleh Aryati (2011). Metode uji hayati pada percobaan ini mencoba menghindari pengaruh selain toksin bahan aktif kepada mortalitas larva C. pavonana. Penggantian daun dan alas tisu perhari
dapat menghindari kekeringan, stress berlebihan dan tumbuhnya jamur yang dapat menyebabkan kematian pada larva. Jenis daun yang digunakan sebagai media penempelan bahan aktif pada penelitian ini juga berbeda dengan yang digunakan oleh Aryati (2011). Pada penelitian ini digunakan brokoli sedangkan penelitan sebelumnya menggunakan daun sawi hijau (ceisin).
Selera dan respon larva terhadap daun yang menjadi bahan makanan berbeda-beda. Oleh karena itu, dapat mempengaruhi respon mortalitas larva terhadap bahan aktif yang dicobakan (Meade & Hare 1993). Hal tersebut juga didukung oleh hasil penelitian Sari (2002) yang mengemukakan bahwa pertumbuhan larva C. pavonana pada daun brokoli jauh lebih baik dibandingkan pada daun sawi hijau. Larva yang tumbuh pada daun sawi hijau lebih banyak mengalami kegagalan untuk berkembang menjadi pupa. Hal tersebut diduga karena kandungan nutrisi yang dimiliki oleh brokoli lebih baik dibandingkan dengan daun sawi hijau (Tabel 6). Kondisi larva yang kurang sehat karena pakan yang kurang baik dapat ikut menimbulkan pengaruh kepada respon mortalitas yang diamati, sehingga respon mortalitas yang diukur bukan karena pengaruh bahan aktif semata. Hal tersebutlah yang diduga mempengaruhi nilai LC50 pada
penelitian sebelumnya menjadi lebih rendah.
Penyebab lain adalah keragaman antar populasi larva yang digunakan. Dulmage (1990) menyatakan bahwa nilai pengukuran LC50 memiliki kendala
28
pengaruh terhadap keragaman tersebut adalah faktor biologis pada saat pemeliharaan, faktor genetis atau adanya respon kekebalan dari serangga.
Tabel 6 Kandungan nutrisi daun untuk pengujian (per 100 g bagian yang dapat dimakan)
Kandungan Brokoli Sawi hijau
Protein(g) 3.6 1.7
Lemak(g) 0.5 0.4
Karbohidrat(g) 3.6 3.4 Vitamin B1(mg) 0 0.04 Vitamin C(mg) 3.0 3.0
Sumber : Sari (2002)
Uji hayati dilakukan pada larva C. pavonana. Larva tersebut dipergunakan
karena pemeliharaan dan proses mendapatkan larva yang lebih mudah dibandingkan serangga uji yang lain. Serangga tersebut disebut juga ulat krop kubis. Serangga C. pavonana tergolong serangga polifagus yang artinya serangga
tersebut dapat menyerang lebih dari satu jenis tanaman; dalam hal ini semua tanaman yang tergolong kubis-kubisan. Tanaman yang terserang dapat termakan habis dan minimal menurunkan mutu dan nilai jual yang dimiliki oleh tanaman.
Chapman (1998) menjelaskan bahwa saluran pencernaan serangga umumnya terbagi tiga bagian : bagian depan (stromodeum), bagian tengah (mesentron) dan bagian belakang (proktodeum). Kondisi keasaman saluran pencernaan dapat berbeda-beda tergantung dari preferensi makan serangga. Umumnya saluran pencernaan bagian depan cenderung memiliki pH asam dan bagian tengah cenderung netral dan mengandung sistem buffer. Saluran pencernaan bagian belakang untuk serangga pemakan tumbuhan memiliki pH basa. Bagian saluran pencernaan ini diduga merupakan lokasi aktivitas toksin dari δ endotoksin, karena kondisi pH yang diperlukan untuk proses aktivasi endotoksin sesuai.
kulit berada dalam kondisi lapar disebabkan harus melalui tahap puasa pada saat penggantian kulit. Hal ini juga dapat mempermudah pengukuran toksisitas disebabkan larva berpeluang besar untuk segera mengkonsumsi toksin yang berada pada permukaan daun. Hasil uji hayati yang didapatkan hanya berlaku terhadap serangga yang diuji dan tidak untuk serangga lain. Hal tersebut disebabkan karena sensitifitas setiap serangga terhadap bahan aktif toksin yang sama berbeda.
2. Proses mikroenkapsulasi bioinsektisida
a. Penetapan kondisi operasi mesin spray dryer
Proses mikroenkapsulasi bioinsektisida dilakukan menggunakan alat spray dryer. Penggunaan metode ini menghasilkan keuntungan ekonomis yang lebih tinggi, proses yang lebih cepat, serbuk yang dihasilkan lebih halus dan mudah untuk peningkatan skala dibandingkan peralatan mikroenkapsulasi lainnya (Gharsallaoui et al. 2007). Eslamian dan Ashgriz (2011) menyatakan bahwa karakteristik serbuk yang dihasilkan dari proses pengeringan semprot bergantung dari kondisi operasi mesin (suhu, kelembaban dan tekanan) dan karakteristik larutan (kekentalan dan konsentrasi). Pada tahap ini parameter-parameter tersebut digunakan untuk mencari kondisi optimum pengoperasian mesin spray dryer.
Konsentrasi bahan enkapsulan yang digunakan untuk optimasi proses mikroenkapsulasi adalah 10% maltodekstrin. Konsentrasi tersebut digunakan karena merupakan konsentrasi dengan kekentalan tertinggi yang dibuat untuk produk mikroenkapsulasi pada percobaan ini. Penggunaan konsentrasi tertinggi bertujuan sekaligus untuk menetapkan kondisi operasi untuk konsentrasi yang lebih rendah.
30
diasumsikan dapat mewakili parameter yang digunakan untuk kekentalan rendah, karena kekentalan rendah memiliki karakter yang lebih mudah dioperasikan oleh alat pengering dan alat atomisasi. Kekentalan yang dihasilkan oleh konsentrasi 5% adalah 14.7 cp sedangkan konsentrasi 10% adalah 26.7 cP.
Tabel 7 menunjukan hasil produk yang didapatkan pada kondisi operasi mesin spray dryer yang divariasikan. Kecepatan suplai larutan yang terbaik
didapatkan pada kecepatan 50 ml/menit. Kondisi yang diinginkan adalah kecepatan suplai yang tinggi agar dapat mengurangi waktu pengeringan tanpa menurunkan mutu serbuk yang didapat. Proses pengeringan didasarkan pada penguapan partikel cair larutan yang telah melalui proses atomisasi. Panas akan menguapkan air dengan cepat dan menyebabkan lapisan bahan enkapsulasi menyelubungi bahan aktif.
Tabel 7 Pengaruh kondisi operasi mesin spray dryer terhadap mutu produk yang dihasilkan dengan konsentrasi maltodekstrin 10%.
Keterangan : (-) tidak ada, (+++) tampak sekali, (++) tampak, (+) kurang tampak.
Alat jet penyemprot yang berada pada tabung outlet bekerja berdasarkan
Hasil percobaan optimasi suhu inlet menunjukan bahwa sampel larutan
bioinsektisida memiliki titik suhu penguapan partikel cairan untuk pembentukan serbuk terbaik adalah pada suhu inlet 120 oC (Tabel 7). Suhu yang lebih rendah
pada kondisi operasi ini akan menghasilkan partikel serbuk yang mengalami pengeringan tidak sempurna sehingga mengakibatkan pelengketan (clogging)
pada dinding tabung inlet dan outlet. Suhu yang lebih tinggi akan mengakibatkan
proses pengeringan terlalu tinggi, sehingga kerusakan bahan aktif dan serbuk terjadi. Tabel 7 menunjukan bahwa suhu inlet yang lebih tinggi dari 120 oC
mengurangi mutu bebas alir serbuk. Proses pengeringan pada tabung inlet akan
berlangsung cepat, sehingga dapat meminimalisasi kerusakan yang diakibatkan pada bahan aktif.
Hasil tersebut sesuai dengan yang diperoleh oleh Alamilla-Beltran et al.
(2005), yakni suhu yang digunakan pada saat pengeringan juga berpengaruh terhadap morfologi partikel yang dihasilkan. Penelitian tersebut menjelaskan bahwa partikel yang dikeringkan pada suhu rendah antara 100 oC sampai 110 oC memiliki kecenderungan untuk membentuk partikel serbuk yang utuh dan tidak hancur. Penggunaan suhu yang tinggi (170 oC-200 oC) akan menyebabkan pembentukan partikel matriks enkapsulasi yang tidak sempurna. Suhu yang terlampau tinggi akan mengakibatkan proses penguapan air dari partikel berlangsung sangat cepat dan pada akhirnya partikel matriks yang terbentuk akan pecah.
Suhu optimum tabung outlet yang didapatkan adalah 70 oC (Tabel 7). Suhu outlet merupakan hal yang harus diperhatikan. Hal tersebut disebabkan sampel
lebih lama tinggal pada tabung outlet. Kecepatan aliran udara sentrifugasi di
dalam tabung outlet lebih kecil dibandingkan dengan tabung inlet, sehingga
menyebabkan serbuk lebih lama jatuh ke tempat penampungan. Suhu yang terlalu tinggi pada tabung outlet dapat merusak aktifitas bahan aktif. Peningkatan suhu outlet yang melebihi suhu optimum menimbulkan resiko kerusakan bahan aktif
32
pemanasan. DE (Dekstrosa Ekuivalen) yang dimiliki oleh suatu bahan karbohidrat diduga memiliki hubungan erat dengan kelengketan yang dimiliki produk pada saat pengeringan. Karakter kelengketan bahan tersebut juga berkaitan erat dengan perubahan fase transisi seperti plastik. Hal tersebut diperkuat oleh pernyataan Forssell (2004), yakni sifat dan karakteristik yang dimiliki maltodekstrin berhubungan erat dengan nilai DE yang dimiliki. Nilai DE menggambarkan seberapa besar tingkat pemutusan rantai karbon yang dilakukan oleh enzim untuk membentuk molekul yang lebih kecil. Maltodekstrin yang memiliki nilai DE semakin kecil akan memiliki sifat dan karakteristik yang mirip dengan pati, sebaliknya semakin besar nilai DE maka sifat dan karakteristik yang dimiliki akan semakin mirip dengan larutan glukosa (Sun et al. 2010). Hasil analisis bilangan DE pada bahan maltodekstrin menunjukkan maltodekstrin pada penelitian ini memiliki DE 19. Sehingga bahan maltodekstrin yang digunakan memiliki karakteristik seperti larutan glukosa.
Truong et al. (2004) menjelaskan mengenai pengaruh fase transisi gelas pada kelengketan produk karbohidrat di dalam penelitiannya. Hasilnya adalah penjelasan bahwa karbohidrat memiliki karakteristik suhu perubahan fase transisi gelas menjadi seperti plastik (Tg) dan suhu terbentuknya bahan yang lengket (Ts).
Ketika suhu pengeringan bahan lebih tinggi dari suhu Ts maka bahan mengalami
perubahan material amorf dari fase seperti kaca menjadi lebih fleksibel seperti plastik. Apabila suhu pengeringan lebih tinggi dari Tg yang dimiliki bahan, maka
bahan akan bersifat lengket dan menempel pada dinding tabung sehingga menurunkan rendemen yang didapat serta mutu produk yang dihasilkan. Penelitian tersebut juga menjelaskan bahwa suhu Ts memiliki kisaran 10 oC
sampai 23 oC lebih tinggi dari Tg. hasil penelitian tersebut juga menjelaskan
bahwa rendemen produk yang didapatkan dari bahan karbohidrat yang mudah lengket dapat ditingkatkan dengan cara mencari kondisi operasi optimum dari
spray dry berdasarkan konsep fase transisi gelas yang dimiliki oleh bahan.
Salah satu model yang menunjukkan hubungan antara DE dan Tg adalah
yang dihasilkan pada penelitian Langrish et al.. (2007). Pada penelitian tersebut
didapatkan antara kedua parameter adalah Tg=176.35-1.4 DE. Melihat bahwa DE
yang digunakan pada penelitian tersebut tidak berbeda jauh dengan yang digunakan pada penelitian ini, maka diasumsikan rumus tersebut dapat digunakan juga untuk bahan maltodekstrin yang digunakan pada penelitian ini. Hasilnya adalah maltodekstrin yang digunakan pada penelitian ini memiliki Tg= 148.35 oC.
Suhu optimum pada Tabel 7 menunjukkan bahwa pengoperasian berlangsung di bawah suhu tersebut sehingga menjelaskan mengapa hasil serbuk yang diperoleh pada suhu tersebut lebih baik dan tidak mengalami pelengketan dibandingkan percobaan pada suhu yang lebih tinggi.
Rumus tersebut menggambarkan mengapa bahan-bahan yang memiliki kadar glukosa tinggi atau memiliki DE sangat tinggi, molekul sakarida dengan bobot molekul rendah yang tinggi serta kandungan asam organik yang tinggi sulit untuk dikeringkan dan dibuat produk serbuk menggunakan spray dryer. Truong et al.. (2004) menjelaskan bahwa bahan-bahan tersebut memiliki sifat termoplastik yang tinggi pula. Bahan-bahan tersebut akan memiliki titik Tg yang sangat rendah
sekali, sehingga pada saat pengeringan menggunakan spray dryer akan mengalami penumpukan dan pelengketan pada dinding alat. Hal tersebut dikuatkan dengan hasil penelitian Adhikari et al.. (2006) yang mendapatkan bahwa bahan-bahan karbohidrat dengan berat molekul sangat rendah memiliki tingkat kelengketan yang tinggi ketika dikeringkan, sehingga tidak dapat diproduksi menjadi serbuk menggunakan spray dryer.
Pendekatan lain yang dapat digunakan untuk meramalkan kondisi operasi optimum dari bahan karbohidrat berkaitan dengan karakteristik Tg yang dimiliki
adalah rasio bobot molekul yang terkandung dalam bahan. Hal tersebut dijelaskan oleh Takeiti et al.. bahwa DE tidak dapat digunakan secara mutlak untuk
meramalkan karakteristik yang dimiliki oleh maltodekstrin atau bahan karbohidrat untuk digunakan dalam aplikasi. Salah satu cara yang lebih tepat adalah dengan rasio distribusi massa yang terkandung dalam maltodekstrin. Maltodekstrin dapat mengandung sakarida dengan rasio massa besar dan kecil berbeda tergantung jenis pati yang digunakan dan hidrolisis enzim yang berlangsung. Hal tersebut juga dikonfirmasi oleh Avaltroni et al. (2004) yang mengemukakan bahwa
34
dengan Derajat Polimerisasi (DP) yang tinggi, akan tetapi dengan konsentrasi yang lebih kecil dibandingkan dengan maltodekstrin yang mengandung DE lebih tinggi. Bahan maltodekstrin yang memiliki nilai DE sama, tetapi memiliki rasio berat molekul sakarida yang terkandung berbeda akan menghasilkan bahan dengan karakteristik berbeda pula. Griffin dan brooks (1989) mengemukakan bahwa sakarida dengan massa besar berpengaruh terhadap stabilitas dan solubilitas yang dihasilkan, sedangkan sakarida dengan massa kecil berpengaruh terhadap viskositas, kristalinitas dan kemanisan produk yang dihasilkan. Secara ringkas Marchal et al.. (1999) menjelaskan hubungan antara karakteristik tersebut
sebagai berikut :
1. Higroskopisitas antara bahan dengan panjang Derajat Polimerisasi (DP) berbeda adalah DP3>DP4=DP7>DP5>DP6>DP11>DP2.
2. Viskositas akan meningkat seiring dengan peningkatan DP. 3. Derajat kemanisan akan menurun seiring dengan peningkatan DP
4. Kestabilan waktu simpan akan meningkat seiring dengan peningkatan DP. Umumnya DP di atas 7 sampai 12 akan menunjukkan waktu simpan yang lebih baik.
Penelitian pendugaan karakteristik dari rasio bobot molekul dilakukan dengan menggunakan pendekatan permodelan. Roos dan Karel (1991) mengemukakan tentang hubungan antara rasio bobot molekul dan kemampuan bahan untuk dibekukan. Avaltroni et al. (2004) dalam penelitiannya menjelaskan mengenai hubungan antara rasio bobot molekul dan Tg serta viskositas yang
dihasilkan dengan model matematika tertentu. b. Pemilihan bahan enkapsulan
Bahan karbohidrat dapat digunakan sebagai bahan enkapsulan bioinsektisida karena selain mudah terdegradasi juga dapat berfungsi sebagai daya tarik konsumsi bagi serangga. Kemampuan daya tarik konsumsi itu disebabkan karena karbohidrat merupakan bahan alami yang terkandung di dalam daun yang merupakan pakan alami dari serangga.
adalah laktosa. Laktosa memiliki kemampuan untuk membentuk lapisan amorf melindungi inti bahan aktif. Kekurangan yang dimiliki adalah harga yang dimiliki cukup mahal, sehingga dapat menaikan harga produk yang dihasilkan. Maltodekstrin adalah produk turunan pati yang lebih murah dan sudah banyak digunakan sebagai bahan enkapsulan pada industri makanan, farmasi dan obat-obatan dan probiotik.
Konsentrasi bahan enkapsulan yang digunakan adalah laktosa 5% (b/v), maltodekstrin 5% (b/v) dan 10% (b/v). Sampel dikeringkan dengan mesin spray dryer menggunakan kondisi operasi optimum yang dihasilkan pada percobaan
sebelumnya.
