ISOLASI PROMOTER GEN CARBONIC ANHYDRASE (CA} PADA Amaranthus viridis (TIPE PHOTOSINTHESIS C4)

(1)

rul(

2t cs

I

LP.

2007 M

704

LAPORAN HASIL PEITIELITIAil TAHUH II PENELITIAN FUNDAMENTAL 2OO7

ISOLAST PROMOTER GEN CARBONTC ANHYDRASE (CA) PADA

Amaranthas vfadfs (TIFE FHOTOSII{THESIS C4}

Oleh

Dr. lr. Kacung Haryono. M$ Dr. lr. Didik Pudji Restanto, MS

Prof. Dr. Bambang Sugiharto. MSc

Dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi,

Departemen Pendidikan Nasional, $urat Perianiian Pelaksanaan Hibah Penelitian Tahun Anggaran 2U,7

Nomor : O4OISP2HrPPrBPzMnllf2Og7 tertanggal 29 M*ret 2@7

FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS JEMBER

2007

6EJS.B

{1Tr..1rSra

Rw#

\re

(2)

\.

,t

LAPOR,AN HASIL PENELITIAN TAHUN II

PENELITIAN FUNDAMENTAL 2OO7

ISOLASI PROMOTER GEN CARBONIC ANHYDRASE (CA} PADA Amaranthus viridis (TIPE PHOTOSINTHESIS C4)

Oleh

Dr. [r. Kacung Haryono, M$ Dr. lr. Didik Pudji Restanto, MS

Prof. Dr. Bambang Sugiharto. MSc

Dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan

Tinggi'

Departemen Pendidikan Nasional, $urat Perlanlian Pelaksanaan Hibah Penelitian Tahun Anggaran 2007

Nomor : 04OISPZH/PPJDPZMIIII/2OOT tertanggat 29 Maret 2007

FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS JEMBER

2007

---'- _i

(3)

PENELITIAN FUNDAMENTAL 2OO7

Jr t r(1 r -l_I<

'i

.iudul Penelitian

2

Ketua

Peneliti

a.

Nama Lengkap

b.

Jenis Kelamin C. NIP

d.

PangkaUGolongan

e,

Jabatan Fungsional

t.

Fakultas

g,

Perguruan Tinggi

h.

Pusat Penelitian

3

.Jumlah Tim Peneliti

"4

il-okasi Penelitian

ISOLASI PROMOTER GEN

GARBONTC ANHYDRASE (CA)

PADA Amaranthus viridis {TIPE PHOTOSINTHESIS Cr)

Dr.

lr.

Kacung Haryono, MS Laki-laki

132 135 201

Lektor I Ill-C

Pertanian

Univercitas Jember

Biologi Molekuler

3 (tiga) orang

Puslit Biologi Molekuler Unei

{0

bulan

Rp. a0.000.000

Jember, 10 November 2007 Ketua Tim Peneliti

Dr.

lr.

Kacung NIP 132 t3$ 2s Keriasama dengan

lnstitusi

Lain

lhllasa Penelitian

ts lr,aya yang diperlukan

Fakultas Pertanian kan I

iaFJ*r

:l

(4)

lsoLASl

PROMOTER GEN CARBONIC ANHYDRASE {CA} PADA A,maranthus viridis (TIPE PHOTOSINTHESIS C4)

RINGK.ASAN

Carbonic Anhydrase (CA) (EC 4.2.1.1) adalah ensim yang mengandung

I-

,3.g

mengkatalis secara bolak balik reaksi antaraCO2 + _{HzO ---}HCOa- +

CA

tersebar

pada

eukaryot

seperti

verlebrate

dan

tanaman. untuk : -:. a

ryotik

seperti

archebacteria

dan

eubacteria.

Ensim

ini

dapat

: ,

as

<asikan tiga gen

famili

yaitu CA atfa. beta dan gama {Hewet-Emmett dan

-=s- an

1996)

Pada tanaman Ca, CA mengkarversi CO2 meniadi HCOs dalam mesofil"

3 "

a-:crat dan

phosphoenol

pyruvate (PEP)

bersamaan

dengan

PEP

:ET,:xiiase (PEPC) untuk membentuk

asam

Ca (oksaloaeetat) yang kemudian

r

"t-,='si

menladi aspartatdan

malat

dalam bundle sheath cell dan mengalami r,i," i-E.o(silasi dengan menqeluarkan COz

untuk

bergabung dengan riboluse

:

::*:scrate

(RUBP) dalam siktus

Cr.

CA merupakan ensim pertama dalam Si. *S :anaman Ca.

Penelitian

Tahun

ll

bertujuan mendapatkan fragmen

cDNA

CA

dari

':-a*a:'l

_bayam_rala_(Amaranthus_vmdis)_{yang telah}_disequensing_dan_diketahui

. _{e€€iaran nya.}_{Urutan nukleotida tersebut digunakan untuk mendesain}primer

(:

_e-ar_<iri_{(reverse) dan}_digunakan_{mengamplifikasi ujung limanya (5'}end).

Totat

RNA

digunakan dalam pembuatan single strand cDNA

:.s:DNA) sebagai templet untuk

PCR.

Primer didesign dari bagian homologi ::E

-

cagian

konservatif

pada

tingkat

asam

amino dengan

menggunakan

:"3:-e'o€ CA dari

F.

bfdentis,

F.

pinglei dan

Licopersicum esculentum. .3,* -aian diturunkan

menladi

primer yaitu Forward

(5'

GCA TGC

TCT

GAT

:

Kcnsentrasi total RNA sebesar 15,76 ug/ul dengan kemumian

1,90.

Hasil

(5)

lhrd{at homologi dengan

F.

Bidentis sebesarS5o/o, dengan

F

pringteisebesar 82,

&ngan

L. Esculenfum sebesar 88o/o dan dengan spinach sebesar gia/o.

Stretegi lain metakukan analisis PCR dengan menggunakan primer yang

ffesain

dari fragmen yang sudah diketahui sequennya kearah reverse (LR) dan df'aeangkan dengan

Pl

yang didesain dari bagian promoter CA MAVACS dari

F

bklentis.

Hasil PCR didapati fragmen DNA sekitar 3000

bp

diharapkan

ruupakan

promotor CA dari

A.

Viridis.

" , -' t'.7 il !.i

:J -;- r:- i.J ji

)' r1I*&iilLI?lAFl

t..ari *iI;iil;iajfrffi

ilt

l

i

il

f t:

(6)

THE ISOLATTON OF GENE CARBONIC ANHYDRASE (CAl PROMOTER AT A,maranthus viridis (C4 PHOTOSYNTHETIC TYPE)

SUMMARY

carbonic

Anhydrase (CA-EC

4.2.1.1\

isnzinc-containing enzyme that catalyzes the reversible reaction

CO2

+

H2O

---- HCO3- +

H+.

CA is widely distributed throughout nature, from eukaryotes such as vertebrates, invertebrates

and plans,

to

prokaryotes such as archabacteria _{and eubacteria. The enzyme}is

classified into three independent

CA

gene famities designated alfa, beta dan gamma CA (Hewett-Emmett and thasian, 1gg6).

ln

c4

plants,

cA

_converts

coz to

_HCos-

in

the

_mesophyll_cytosol. Bicarbonate and phosphoenol-pyruvate (PEP) are combined by PEP carboxylase

(PEPC) to form

a

C+ _{acid (oxaloacetate acid) which is then converted}_to_either

aspartate or _{malate, which enters the bundle sheath cell.and is}_{decarboxylated.}

The released COz then is combined with RUBp as in Ca plants.

The first years _{of the}research was isolated of the cDNA fragment

of

CA

from A. viridis. lt was as a probe for screening promoter

in

5' end.

RNA total

was

used

to

make singte strand cDNA (sscDNA)

as a

template for

PCR.

Primers have been designed

from

conservative region

at

the amino

acid

level of

F.

bidentis. F. pringlei dan Licopersicum esculentum. then it were

constructed based on nucleotide sequences

of

fonnrard primer

(5'

GCA

TGC

TCT

GAT TCT

cGA

GT

' 3

and

reverse primer (

5'

ccc

AAG AGA

_TAc

AT-f

CAC

AGC

'3).

The

concentration

of

total RNA was 15.76 ug/ul with ouality

1.90.

cDNA fragment has

been

isolated around 375

bp.

The fragment

have been sequenced and'analized

for

homologv level.

The

cDNA fragment around 375 bp have homology around 85%, 82o/o ,88o/o and 91% with F.bidentis CA, F.

pingleiCA,

L. esculentum CAand Splnach CA, respectively.

(7)

f*krfi.s.

Around 3000 bp single band was found,

trofiloter from A. viridis

hopetully the fragment as CA