PENGARUH SUBSTRAT DAN TEMPERATUR TERHADAP PARAMETER KINETIKA PADA PRODUKSI -SIKLODEKSTRIN OLEH ENZIM SIKLODEKSTRIN GLIKOSILTRANSFERASE

(1)

PENGARUH SUBSTRAT DAN TEMPERATUR TERHADAP

PARAMETER KINETIKA PADA PRODUKSI -SIKLODEKSTRIN

OLEH ENZIM SIKLODEKSTRIN GLIKOSILTRANSFERASE

Sri Rezeki Muria

Dosen Jurusan Teknik Kimia Fakultas Teknik Universitas Riau

Kampus Bina Widya Universitas Riau, Jalan H.R. Subrantas KM 12,5 Simpang Baru Pekanbaru. Email : sri_muria@yahoo.co.id

Abstrak

-siklodekstrin adalah siklik oligosakarida dengan berbagai macam aplikasi pada makanan, obat-obatan, kosmetik, pertanian dan industri kimia. Siklodekstrin glikosiltransferase adalah enzim yang mampu merubah tepung menjadi molekul -siklodekstrin. Dalam penelitian ini, enzim siklodekstrin glikosiltransferase dihasilkan oleh Basillus sp. C26 yang digunakan untuk memproduksi siklodekstrin dari tepung sagu sebagai substratnya. Produksi maksimum -siklodekstrin didapatkan dengan menggunakan konsentrasi enzim 10 U/g tepung sagu pada pH 8.5 dan temperatur 50o_{C. Pengaruh temperatur pada kinetika produksi -siklodekstrin oleh enzim} siklodekstrin glikosiltransferase telah diuji dengan memvariasikan temperatur antara 40-70o_{C dan} substrat 5-30 g/l. Km dan Vmax dihitung dengan Lineweaver_Burk plot menggunakan konsentrasi substrat dan temperatur yang berbedabeda. Dan didapatkan bahwa kecepatan awal produksi siklodekstrin meningkat jika temperatur meningkat. Meningkatnya kecepatan awal produksi -siklodekstrin seiring dengan meningkatnya temperatur pada konsentrasi substrat yang tinggi lebih cepat dari pada konsentrasi substrat yang rendah. Vmax meningkat dari 2.35 sampai 6,78 g -siklodekstrin/l/j ketika temperatur meningkat dari 40-65o_{C sedangkan}_K

m menurun dari 39,2 sampai 9,78 mg tepung sagu/ml ketika temperatur meningkat dari 40-60o_{C. Nilai} _K

m yang rendah menunjukkan bahwa antara enzim dan substrat mempunyai ketertarikan yang lebih kuat pada temperatur yang tinggi.

Kata kunci : -siklodekstrin, siklodekstrin glikosiltransferase, kinetika

1. Pendahuluan

Salah satu bidang penting dalam bioteknologi dan bioteknik adalah phenomena dari molekul yang dapat membentuk komplek dengan molekul lain yang berguna untuk menyeleksi, memisahkan dan melarutkan berbagai macam bio-molekul. Siklodextrin adalah salah satu molekul penting yang termasuk dalam kelompok molekul yang membentuk komplek dengan molekul lain (Moriwaki dkk., 2007). Siklodekstrin dapat disintesis secara enzimatis oleh enzim cyclodextrin glycosyltransferase atau 1,4- -D-glucopyranosyl transferase (CGTase). CGTase adalah enzim unik yang mampu mengubah

(2)

zat tepung dan gula menjadi siklodekstrin melalui reaksi siklisasi. Siklodekstrin berbentuk rantai melingkar yang terdiri dari 6, 7 atau 8 glukosa yang secara berurutan disebut -, - dan -siklodekstrin. Di dalam penelitian ini CGTase dari bakteri alkalopilik diisolasi dari tanah pertanian dan di identifikasi sebagai Bacillus sp. C26 digunakan untuk menghasilkan -siklodekstrin (Kitcha S., 2007). Dan telah dipelajari pengaruh jumlah enzim, konsentrasi substrat dan temperatur pada kinetika produksi -siklodekstrin oleh enzim CGTase.

2. Tinjauan Pustaka

Tepung sagu adalah alternative substrat yang dapat digunakan untuk memproduksi siklodekstrin, karena tepung sagu mempunyai biaya produksi yang rendah dan hasil produksi yang tinggi bila dibandingkan dengan jenis tepung yang lain (Charoenlap dkk., 2004). Siklodekstrin dapat disintesis secara enzimatik dengan menggunakan enzim cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase). Siklodekstrin adalah siklik nonreduksi yang terdiri atas 6, 7 atau 8 residu glukosa yang dihubungkan dengan ikatan -1,4 untuk -, - dan -siklodekstrin secara berurutan (Jemli dkk., 2007). Siklodekstrin mempunyai kemampuan khusus bertindak sebagai wadah molekul yang memerangkap atau menjerat molekul hidropobik didalam rongga bagian dalamnya. Zat ini telah banyak digunakan untuk stabilisasi, pelarut, penyerap bau dan penguat rasa dari berbagai komponen penting didalam industri makanan, obat-obatan, kosmetik, pertanian dan industri kimia. CGTase dapat memproduksi campuran -, - dan -siklodekstrin dalam ratio yang berbeda-beda. Namun sebagian besar CGTase menghasilkan siklodekstrin sebagai hasil yang utama. -siklodekstrin diketahui lebih cocok untuk digunakan di dalam industri, sejak pencakupan komplekskompleks dipersiapkan dengan mudah dan sangat stabil berkat solubilitas dari -siklodekstrin yang rendah didalam air. Aktifitas CGTase dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti temperatur, pH, konsentrasi substrat dan hasil. Ketika temperatur meningkat kecepatan reaksi kimia juga meningkat karena temperatur meningkatkan kecepatan gerak molekul dalam reaksi tersebut. Hal ini menimbulkan meningkatnya interaksi antara enzim dan substratnya. Namun jika temperatur terlalu tinggi, enzim menjadi rusak dan tidak akan bisa mengikat dan mengkatalis reaksi-reaksinya (Santos dkk., 2007).

(3)

3. Metode Penelitian 3.1. Bahan

Tepung sagu digunakan untuk produksi enzim dan siklodekstrin. Bacillus sp. C26 digunakan untuk memproduksi enzim CGTase (Kitcha S., 2007). Dan semua bahan-bahan kimia lainnya sesuai dengan perhitungan analitis yang dibutuhkan.

3.2. Bagian dari Proses Penelitian

a. Produksi enzim CGTase dari Bacillus sp.C26

Bakteri Bacillus sp.C26 di inokulasi didalam media Horikoshi II broth terdiri dari 1,0% tepung sagu, 0,5% ekstrak yeast, 0,5% pepton, 0.1% KH2PO4, 0.02% MgSO4⋅7H2O

and 1.0% Na2CO3 (Illias dkk., 2002) dan di inkubasi pada 37oC, 200 rpm. Larutan hasil

fermentasi tersebut di panen setelah 48 jam proses inkubasi. Selanjutnya dilakukan proses sentrifugasi dengan kecepatan 8.000 rpm 4oC selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh digunakan sebagai larutan enzim yang belum murni. Ammonium sulfat padat ditambahkan kedalam larutan supernatan tersebut pada suhu 4oC dan lapisan yang mengendap diperoleh pada saturasi 80% diambil dengan cara sentrifugasi. Selanjutnya endapan tersebut dilarutkan dalam 20 ml larutan buffer phosfat pH 7,0 pada suhu 4oC dan larutan yang didapat di dialysis dengan menggunakan sebuah membran 8.000 Da molecular cut-off pada suhu 4oC dalam buffer yang sama. Enzim yang dimurnikan sebagian tersebut selanjutnya digunakan untuk proses produksi -siklodekstrin.

b. Produksi -siklodekstrin

Disini dipelajari faktor-faktor yang mempengaruhi proses produksi -siklodekstrin termasuk jumlah enzim yang digunakan, konsentrasi tepung sagu dan temperatur. Campuran reaksi yang digunakan dalam produksi -siklodekstrin terdiri dari tepung sagu yang dilarutkan dalam 50 ml buffer glysin-NaOH pH 8,5 di gelatinisasi pada suhu 70oC selanjutnya ditambahkan enzim dan di inkubasi sesuai dengan suhu yang telah ditetapkan. Pengaruh jumlah enzim diuji pada konsentasi 10, 20, 30 dan 40 U/g tepung sagu. Pengaruh konsentrasi tepung sagu yang digunakan diuji pada 5, 10, 20 dan 30 g/l. Selanjutnya pengaruh temperatur pada produksi -siklodekstrin diuji pada suhu 40o_{C, 45}o_{C, 50}o_C,

(4)

c. Analisis konsentrasi -siklodekstrin

Sampel diambil dan dihentikan reaksinya dengan cara dididihkan pada 100oC selama 5 menit. -siklodekstrin diukur menggunakan metode phenolphthalein assayed oleh metode Keneko dkk. (1987) didalam Sian dkk. (2005) berdasarkan pada pengurangan intensitas warna dari phenolphthalein setelah membentuk kompleks dengan -siklodekstrin. Intensitas warna diukur pada 550 nm dengan menggunakan spektrofotometer.

d. Determinasi Parameter Kinetika

Parameter kinetika untuk reaksi katalisis dari enzim CGTase diukur menggunakan kecepatan reaksi awal dari produksi -siklodekstrin (Vo) pada konsentrasi 5-30 g/l tepung sagu pada berbagai temperatur. Parameter kinetika pada model Michaelis-Menten, Km dan

Vmax dihitung menggunakan Lineweaver-Burk plot. 4. Hasil dan Pembahasan

4.1. Pengaruh Jumlah Enzim CGTase

Hasil -siklodekstrin yang didapat melalui reaksi dari enzim CGTase dan substratnya sangat penting untuk aplikasi didalam industri yang cukup potensial. Pengaruh jumlah enzim CGTase pada hasil dan kecepatan awal produksi -siklodekstrin diuji untuk memilih jumlah enzim yang paling cocok untuk produksi -siklodekstrin. Proses dijalankan menggunakan 10 g/l tepung sagu yang dilarutkan dalam 50 ml bufer glysin-NaOH pH 8,5 dan jumlah enzim yang digunakan 10, 20, 30 dan 40 U/g tepung sagu. Dan campuran tersebut di inkubasi pada temperatur 50oC. Hasilnya ditunjukkan pada Gbr.1. dari grafik tersebut terlihat bahwa 10 U/g tepung sagu memberikan hasil produksi -siklodekstrin lebih tinggi jika dibandingkan dengan 20, 30 dan 40 U/g tepung sagu. Hasil ini cocok dengan hasil yang diperoleh oleh peneliti lain menggunakan enzim CGTase dari

Klebsiella pneumoniae AS-22 (Gawande dan Patkar, 2001). Mereka menemukan bahwa jumlah enzim yang optimal adalah 10 U/g tepung dan penambahan enzim melebihi jumlah tersebut tidak menunjukkan adanya peningkatan hasil dari produksi siklodekstrin.

(5)

Gbr. 1. Pengaruh jumlah enzim CGTase pada produksi -siklodekstrin menggunakan tepung sagu sebagai substrat.

Gbr.2 menunjukkan hasil dan kecepatan awal dari produksi -siklodekstrin dibandingkan dengan jumlah enzim yang digunakan. Terlihat bahwa dengan meningkatnya jumlah enzim yang digunakan menyebabkan penurunan jumlah hasil produksi -siklodekstrin. Sedangkan pada sisi lain terlihat kecepatan awal produksi -siklodekstrin meningkat dengan meningkatnya jumlah enzim yang digunakan. Hal tersebut hanya terjadi pada kondisi awal proses saja sebab ketika proses produksi dilanjutkan terlihat bahwa kecepatan produksi menurun secara signifikan dengan meningkatnya jumlah enzim CGTase seperti yang ditunjukkan pada Gbr.1. Martins dan Kaul (Martins dan Hatti-Kaul, 2002) juga menemukan bahwa dengan meningkatnya jumlah enzim yang digunakan pada produksi -siklodekstrin menurun secara drastis dan menjadi tak terdeteksi pada jumlah enzim 30 U/g.

Gbr. 2. Pengaruh jumlah enzim CGTase pada hasil dan kecepatan awal dari produksi -siklodekstrin menggunakan tepung sagu sebagai substrat.

0 0.5 1 1.5 0 10 20 30 40 50 5 10 20 30 40 Kec ep at an a w al (g /L /h ) H as il -s ik lo de ks tr in ( % )

Jumlah enzim CGTase(U/g)

hasil -siklodekstrin (%) Kecepatan awal (g/L/h) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 K on se nt ra si -C D (g /L ) Waktu (jam)

(6)

4.2. Pengaruh Konsentrasi Substrat dan Temperatur

Pengaruh konsentrasi substrat menggunakan enzim sebanyak 10 U/g tepung sagu dan 5-30 g/l tepung sagu sebagai substrat dalam campuran tersebut dengan memvariasikan temperatur antara 40-70oC telah dilakukan. Hasilnya ditunjukkan pada Gbr.3-9. Dengan meningkatnya konsentrasi substrat didalam campuran reaksi menyebabkan meningkatnya produksi -siklodekstrin pada setiap temperatur yang digunakan. Ketika temperatur meningkat produksi -siklodekstrin juga meningkat. Kim dkk. (Kim dkk., 1997) juga menemukan bahwa seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat menyebabkan konsentrasi -siklodekstrin yang dihasilkan juga meningkat.

Gbr.3. Pengaruh konsentrasi tepung sagu pada proses produksi -siklodekstrin menggunakan 5-30 g/l tepung sagu sebagai substrat pada temperatur 40oC.

0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 25 -s ik lo de ks tr in (g /L ) Time (h) 5 g/L 10 g/L 20 g/L 30 g/L 0 2 4 6 8 10 12 14 0 5 10 15 20 25 30 -s ik lo de ks tr in (g /L ) Waktu (jam) 5 g/L 10 g/L 20 g/L 30 g/L

(7)

0 5 10 15 0 5 10 15 20 25 30 -s ik lo de ks tr in (g /L ) Waktu (jam) 5 g/L 10 g/L 20 g/L 30 g/L 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 5 10 15 20 25 30 -s ik lo de ks tr in (g /L ) Waktu (jam) 5 g/L 10 g/L 20 g/L 30 g/L 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 25 30 -s ik lo de ks tr in ( g/ L) Waktu (jam) 5 g/L 10 g/L 20 g/L 30 g/L

(8)

Gbr.8. Pengaruh konsentrasi tepung sagu pada proses produksi -siklodekstrin menggunakan 5-30 g/l tepung sagu sebagai substrat pada temperatur 65o_C.

Dalam penelitian ini ditemukan bahwa temperatur optimum untuk produksi -siklodekstrin adalah 65oC karena ketika temperatur meningkat lebih dari 65oC produksi -siklodekstrin menurun hamper 20% pada 70o_{C. Hal tersebut terjadi karena enzim telah}

rusak pada temperatur yang lebih tinggi dibuktikan dengan menurunnya hasil produksi -siklodekstrin. Matioli dkk. (2001) juga menemukan bahwa stabilitas enzim CGTase dari B. firmus strain 37 yang terbaik terjadi pada 60o_{C dan aktifitas spesifiknya yang tertinggi}

adalah pada 65o_{C. Aktifitas dan stabilitas yang baik pada temperatur yang tinggi}

menunjukkan potensi untuk diterapkan didalam sektor industri. Pada industri yang mengkonversi tepung menjadi siklodekstrin, ini lebih diinginkan enzim yang aktif pada temperatur yang lebih tinggi, karena ini akan mengurangi resiko kontaminasi oleh mikroorganisme. 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 25 30 -s ik lo de ks tr in ( g/ L) Waktu (jam) 5 g/L 10 g/L 20 g/L 30 g/L 0 2 4 6 8 10 12 14 0 5 10 15 20 25 30 -s ik lo de ks tr in ( g/ L) Waktu (jam) 5 g/L 10 g/L 20 g/L 30 g/L

(9)

4.3. Pengaruh Konsentrasi Substrat dan Temperatur terhadap Parameter Kinetika Proses Produksi -Siklodekstrin

Kecepatan awal produksi -siklodekstrin telah dihitung menggunakan waktu produksi -siklodekstrin dari 0 sampai 6 jam. Hasil ditunjukkan pada Gbr.10. Dari gambar tersebut terlihat bahwa kecepatan awal (Vo) produksi -siklodekstrin meningkat ketika temperatur ditingkatkan. Peningkatan kecepatan awal pada produksi -siklodekstrin yang diikuti oleh peningkatan temperatur pada konsentrasi substrat yang tinggi nilainya lebih tinggi jika dibandingkan pada konsentrasi substrat yang rendah. Matioli dkk., (2001) mempelajari aktifitas enzim CGTase dari Bacillus firmus strain 37 sebagai fungsi temperatur untuk produksi siklodekstrin menemukan bahwa dengan meningkatnya temperatur produksi -siklodekstrin juga meningkat.

Parameter kinetika dari produksi -siklodekstrin dihitung dengan menggunakan persamaan Michaelis-Menten. Kecepatan awal produksi -siklodekstrin, Vo (g/l.jam) untuk berbagai konsentrasi substrat, S (g/l), digunakan pada persamaan Michaelis-Menten. Dimana Vmax adalah kecepatan reaksi

maksimum (g/l.jam) dan Km adalah konstanta Michaelis-Menten (g/l). dalam

kinetika Michaelis-Menten, Vmax berhubungan dengan kondisi dimana setiap

molekul enzim yang ada jenuh terhadap substratnya. Nilai Km menggambarkan

ketertarikan antara substrat dan enzim.

Table.1. menunjukkan pengaruh temperatur pada nilai Vmax dan Km. Ketika

temperatur meningkat Vmax juga meningkat tapi sebaliknya Km menurun. Nilai Vmax

meningkat dari 2,3 menjadi 6,78 g -siklodekstrin/l/jam ketika temperatur meningkat dari 40 sampai 65oC, sebaliknya Km menurun dari 39,2 menjadi 9,78 g

tepung/l ketika temperature dinaikkan dari 40 menjadi 60oC. Pada temperatur 70oC didapat hasil yang sebaliknya dimana nilai Vmax menurun nilai Km meningkat

karena enzim CGTase telah rusak pada temperatur tersebut dan hasil produksi -siklodekstrin menurun dari 16,055 g/l pada 65o_{C menjadi 13,085 g/l pada 70}o_C.

Nilai Km yang rendah mengidentifikasikan ketertarikan yang lebih tinggi enzim

CGTase dengan substratnya terjadi pada temperatur yang lebih tinggi. Dapat disimpulkan bahwa kenaikkan temperatur tidak hanya meningkatkan kecepatan reaksi tetapi juga mempertinggi kemampuan enzim untuk mengikat substratnya. Ratio Vmax/Km memberikan sebuah ide praktis bagi effisiensi katalitik yaitu

(10)

seberapa sering molekul berikatan dengan substrat dan terjadi reaksi yang menghasilkan produk (Salami dkk., 2008).

Gbr.10. Pengaruh temperatur pada kecepatan awal dari proses produksi -siklodekstrin menggunakan 5-30 g/l tepung sagu sebagai substrat. Diinkubasi pada temperatur 40-70oC.

Table.1. Nilai Vmax dan Km dari produksi -siklodekstrin pada temperatur 40-70oC.

5. Kesimpulan

Kinetika pada produksi -siklodekstrin oleh enzim CGTase dari Bacillus sp. C26 telah dipelajari. Dengan meningkatnya jumlah enzim CGTase yang digunakan dapat meningkatkan kecepatan reaksi tetapi sebaliknya hasil -siklodekstrin yang didapatkan semakin menurun. Jumlah optimum dari enzim CGTase yang digunakan untuk mendapatkan hasil produksi -siklodekstrin yang tinggi adalah 10 U/g. Dengan meningkatnya jumlah konsentrasi substrat didalam campuran reaksi menyebabkan meningkatnya produksi -siklodekstrin pada semua temperatur yang digunakan. Ketika temperatur meningkat nilai Vmax juga meningkat tapi sebaliknya nilai Km menjadi

menurun. 0 2 4 6 35 40 45 50 55 60 65 70 75 Vo (g ββββ -si kl od ek st ri n/ L. h) Temperatur (o_C) 5g/L 10g/L 20g/L 30g/L Temp. (oC) Vmax (g β-siklodekstrin/l/ jam) Km (g tepung/l) Vmax/Km 40 45 50 55 60 65 70 2,35 4,57 4,98 5,57 6,33 6,78 6,33 39,2 20,7 15,9 11,9 9,78 9,89 18,47 0.06 0.22 0.31 0.47 0.65 0,69 0,34

(11)

Ucapan Terima Kasih

Ucapan terima kasih penulis persembahkan untuk keluarga dan semua pihak yang telah memberikan bantuan materil maupun berupa moril kepada penulis untuk menyelesaikan makalah ini.

Daftar Pustaka

1. Moriwaki, C., Costa, G.L., Pazzetto, R., Zanin, G.M., Moraes, M.M., Portilho, M. and Matioli, G. 2007. “Production and characterization of a new cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus firmus isolated from Brazilian soil” Process Biochem. 42 :1384-1390

2. Santos, A.M.P., Oliveira, M.G. and Maugeri, F. 2007. “Modelling thermal stability and activity of free and immobilized enzymes as a novel tool for enzyme reactor design” Bioresour. Technol. 98 :3142-3148

3. Kitcha, S. 2007. Production of cyclodextrin glycosyltransferase from alkalophilic

Bacillus sp. C26 isolated from soil. Tesis Magister, Prince of Songkla UniversityThailand

4. Illias, R.M., Fen, T.S., Abdulrashid, N.A., Yusoff, W.M.W., Hamid, A.A., Hassan, O. and Kamaruddin, K. 2002. “Cyclodextrin glucanotransferase producing alkalophilic

Bacillus sp. G1: its cultural condition and partial characterization of the enzyme”

Pakistan J. Bio. Sci. 5 :688-692

5. Sian, H.K., Said, M., Hassan, O., Kamaruddin, K., Ismail, A.F., Rahman, R.A., Mahmood, N.A.N. and Illias, R.M. 2005. “Purification and characterization of cyclodextrin glucanotransferase from alkalophilic Bacillus sp. G1” Process Biochem. 40 :4101-4411

6. Gawande, B.N. and Patkar, A.Y., 2001. “Purification and properties of a novel raw starch degrading-cyclodextrin glycosyltransferase from Klebsiella pneumoniae AS-22” Enzyme Microb. Technol. 28 :735-43

7. Martins, R.F. and Hatti-Kaul, R. 2002. “A new cyclodextrin glycosyltransferase from an alkaliphilic Bacillus agaradhaerens isolate: purification and characterization”

Enzyme Microb. Technol. 30 :116-124

8. Kim, T. J., Kim, B. C. and Lee, H. S., 1997. “Production of cyclodextrin using raw corn starch without a pretreatment” Enzyme Microb. Technol. 20 :506-509

9. Matioli, G., Zanin, G.M and Moraes, F.F., 2001. “Characterization of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus firmus strain no.37” Appl. Biochem. Biotechnol. 1 :91-93

10. Salami, M., Yousefi, R., Ehsani, M, R., Dalgalarrondo, M., Chobert, J, M., Haertle, T., Razavi, S, H., Saboury, A, A., Naslaji, A, N., Movahedi, A, A, M. 2008. “Kinetic characterization of hydrolysis of camel and bovine milk proteins by pancreatic enzymes” Int. Dairy J. 18 :1097-1102

11. Jemli, S., Messaoud, E. B., Ayadi-Zouari, D., Naili, B., Khemakhem, B. and Bejar, S. 2007. “A β-cyclodextrin glycosyltransferase from a newly isolated Paenibacillus pabuli US 132 strain: purification, properties and potential use in bread-making”

Biochem. Eng. J. 34: 44-50.

12. Charoenlap, N., Dharmsthiti, S., Sirisansaneeyakul, S. and Lertsiri, S. 2004. “Optimization of cyclodextrin production from sago starch”. Bioresour. Technol. 92: 49-54.