Oleh :
Didik Wahyudi(1), Sutarno (2), Artini Pangastuti (2) 1. Akademi Analis Kesehatan Nasional Surakarta
QUORUM SENSING
Suatu proses yang memungkinkan bakteri dapat berkomunikasi dengan mensekresikan molekul sinyal
yang disebut autoinducer atau molekul sinyal sebagai
bahasa.
Proses ini memungkinkan suatu populasi bakteri dapat mengatur ekspresi gen tertentu, tingkah laku dan fenotipiknya, yang bergantung kepada jumlah populasi
Beberapa Peneliti Sistem Quorum Sensing Bakteri
Indiana University
Clay Fuqua
Yonsei University, Seoul, Korea Selatan. Yaya Rukayadi Allison L Adonizio Florida International University Miami Massachusetts University Djordjevic DENMARK UNIVERSITY Fajar Mustika School of Life Sciences andTechnology - ITB
SISTEM QUORUM SENSING BAKTERI
MENGENDALIKAN EKSPRESI GEN
BIOLUMINESCENS
SEKRESI VIRULENSI FACTOR PRODUKSI PIGMEN
(Taga dan Bassler, 2003).
SPORULASI
PEMBENTUKAN BIOFILM
QUORUM SENSING BLOCKING
Ekstrak
Alpina galanga
1. sistem quorum sensing, dapat dikembangkan
untuk pengendalian infeksi yang dilakukan
dengan mencegah pengumpulan massa
bakteri atau merusak sistem komunikasinya.
2. Produksi Eksopretease dikendalikan oleh
sistem quorum sensing, sehingga produksi
eksoprotease bisa dijadikan indikator sistem
BIOFILM BAKTERI
Biofilm adalah istilah yang digunakan untuk menggambarkan
suatu lingkungan kehidupan yang khusus dari sekelompok
mikroorganisme, yang melekat ke suatu permukaan, menjadi
mikrolingkungan yang unik.
Ada lima tahap perkembangan biofilm P. aeruginosa 1. initial attachment 2. irreversible attachment 3. maturation I 4. maturation II 5. dispersion
Pseudomonas aeruginosa
Phylum : Proteobacteria
Class : GammaProteobacteria Order : Pseudomonadales
Family : Pseudomonadaceae
Penyebab Nosokomial infeksi
paling tinggi dibandingkan
bakteri jenis lainnya (26%)
(Bagian Mikrobiologi Klinik
RSPM Jakarta, 1998).
Lengkuas (Alpinia galanga L)
Klas :Monocots Order :Zingiberales Family :Zingiberaceae Catherine (2002) Khasiat:antibakteri, anti fungi, anti tumor, analgenikum, anti kembung, obat penyakit kulit. sakit perut , radang
Zat Kimia yang terkandung dalam
Ekstrak etanol Alpinia galanga L
• eskuifelandren.
• fenolik
• ester asam lemak
• asam lemak
• galanal A
• galanal B,
• galanolakton,
• terpen, dan lain-lain.
• asetokavikol asetat,
• p-coumaril siasetat,
• asam palmitat,
• eugenol,
• asetosiugenol asetat,
• bisabolene,
• farnesen,
RUMUSAN PERMASALAHAN
1. Apakah ekstrak Alpinia galanga L mampu menghambat sistem
quorum sensing (produksi eksoprotease, jumlah sel bakteri
dan produksi biofilm) pada Pseudomonas aeruginosa?
2. Berapakah konsentrasi ekstrak Alpinia galanga L yang paling efektif dalam menghambat sistem quorum sensing (produksi eksoprotease, jumlah sel bakteri dan produksi biofilm) pada
Pseudomonas aeruginosa?
3. Apakah terdapat perbedaan kemampuan penghambatan sistem quorum sensing pada Alpinia galanga L yang diperoleh dengan pelarut polar (eatanol) dan semi polar (etil asetat)?
Sistem Quorum sensing Pseudomonas aeruginosa
Acyl Homoserin lactone,
Esktrak Alpinia galanga L
Ekspresi Gen untuk Faktor Virulensi
Pembentukan Biofilm
Patogen
Penyakit Infeksi
Sistem Quorum Sensing dihambat! Bakteri Tidak membentuk Faktor Virulensi dan Biofilm
Tidak Menjadi Patogen
HIPOTESIS
Ekstrak Alpinia galanga L mempunyai kemampuan dalam menghambat sistem quorum sensing (produksi
eksoprotease, jumlah sel bakteri dan produksi biofilm) pada Pseudomonas aeruginosa.
Ada perbedaan kemampuan penghambatan sistem quorum
sensing pada Pseudomonas aeruginosa oleh ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut polar (eatanol) dan semi polar
Waktu dan Tempat Penelitian
Laboratorium Bakteriologi dan Kimia Farmasi AAK
Nasional Surakarta pada bulan November 2009 - Juni 2010. Jl. Yos Sudarso 338 Surakarta 57155.
Laboratorium Mikrobiologi, Media Reagensia Balai dan
Laboratorium Kimia Balai Laboratorium Kesehatan
Yogyakarta (Lab. rujukan Nasional bidang Mikrobiologi Klinik, ISO 17025:2005). Bulan Desember 2009 – Juni 2010.
Analisis Data
Ekstraksi Alpinia galanga L
isolasi & Persiapan Bakteri Uji Persiapan Media Biakan
Uji Penghambatan Quorum Sensing
Uji pembentukan Biofilm: Microtiter Plate Polivinil Clorida (PVC) Kurva Pertumbuhan
BAKTERI UJI
Bakteri strain. Pseudomonas aeruginosa diperoleh dari
Pseudomonas aeruginosa yang diisolasi dari Rumah Sakit
Lengkuas (Alpinia galanga L)
Alpinia galanga
L (Lengkuas) yang digunakan
dalam penelitian ini adalah jenis Lengkuas
merah besar berumur 4 – 5 bulan, yang
didapatkan dari Perkebunan Tanaman Obat di
Kecamatan Jatiyoso, Kabupaten Karanganyar,
Persiapan Media Biakan
Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Luria-Bertani (LB) dilengkapi dengan 0,5% glukosa dan 2 %
susu skim (media AB, mengandung 2,5 mg tiamin /
liter). semua strain yang diinkubasi pada 37 ° C.
Alpinia galanga L 1 kg DIPARUT & DIKERINGKAN
100 g rimpang diekstrak dalam 500ml etanol 70%
selama 24 jam
DISARING,
Filtrat dievavorasi dengan Rotary Evaporator
40C Vakum
Setelah kering di tambah 10 ml etanol dan 20 ml
heksana
Dikocok, lapisan etanol dikeringkan jadi kristal
di Larutkan dalam etanol 1% (1:100 w/v)
inokulasi P. aeruginosa ke media agar dengan
spot plate
media LB Agar + 0,5% Glukosa +
2% susu skim
Ditunggu sampai dingin dan keras
Inkubasi pada suhu 30 C 24 jam
Adanya zona hambatan disekitar koloni indikasi
adanya enzim eksoprotease
Pengujian Kuantitatif aktivitas enzim eksoprotease P. aeruginosa
Endapan dipisahkan, filtrat akan membentuk warna bila direaksikan dengan NaOH.
Intensitas warna diukur dengan spektrofotometer OD 440 nm.
Tujuan untuk mengetahui aktivitas enzim eksoprotease P. aeruginosa. Prinsip pengujian berdasarkan
metode Hanlon dan Hodges (1981); kemampuan enzim protease untuk
menghidrolisis Azocasein.
Residu azocasein yang tidak dapat terhidrolisis oleh enzim eksoprotease akan diendapkan oleh tricloro acetic acid
Pengukuran Pertumbuhan Bakteri
Kurva pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa diukur dengan spektofotometer (OD 600nm)
Kultur P.a terhambat diinkubasi dalam 10 ml TSBYE 32C, 24 jam 0,1 ml kultur di TSBYE dipindahkan ke 10 ml LB Broth VORTEX 100µl dipindahkan ke microtiter Plate PVC Ditutup dan diinkubasi pada 32C, 20 – 40 jam
Kekeruhan sel dipantau menggunakan microtiter pembaca pada OD 595 Di bandingkan dengan kontrol Pewarnaan dengan kristal violet 1%, lalu dicuci Analisis kuantitatif
NO NAMA OBAT KODE
POTENSI OBAT (µ GRAM)
HASIL
1 Amoxycillin AML 10 Resisten
2 Amoxycillin Clav.Acid AMC 30 Resisten
3 Cefriaxone CRO 30 Sensitif
4 Ceffazidime CAZ 2 Resisten
5 Clindamisin DA 5 Resisten
6 Ciprofloxacine CIP 5 Resisten
7 Penicillin G P 30 Resisten
8 Sulfamethaxazole SXT 100 Resisten
9 Fosfomycin FOS 50 Sensitif
10 Trimetrhoprim W 5 Resisten
11 Streptomycin SXT 10 Resisten
12 Meropenem MEM 30 Sensitif
13 Imipenem IPM 30 Sensitif
14 Nalidic Acid NA 30 Resisten
15 Amikacin AK 300 Resisten
16 Cloramphenicol C 30 Resisten
17 Gentamycin CN 10 Sensitif
18 Netilmycin NET 15 Sensitif
19 Novobiocin NV 5 Resisten
20 Cephalothin KF 20 Resisten
21 Cefuroxime CXM 30 Resisten
22 Kanamycin KF 15 Resisten
23 Cefepime FEP 30 Sensitif
24 Cefoxitin FOX 30 Resisten
25 Coumpounds CMP 300 Sensitif
26 Ofloxacin OFL 30 Resisten
27 Piperacillin PPR 100 Sensitif H asi l Uji S en si ti vi tas an ti b io ti k P. ae rug ino sa H asi l Iso lasi d ar i R SU Dr . M o e w ar d i S u rak ar ta
Kurva Pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa Jam ke Absorbansi Jumlah Bakteri Log Jumlah Bakteri 0 0.124 8,9 x 105 5.94939 2 0.119 9,8 x 105 5.98900 4 0.137 3,2 x 106 6.50515 6 0.243 7,7 x 107 7.88649 8 0.482 8,2 x 108 8.91381 10 0.752 1,8 x 1010 10.25527 12 1.066 8,7 x 1011 11.93952 14 1.123 9,8 x 1011 11.99123 16 1.162 3,3 x 1011 11.51851 18 1.104 9,8 x 1011 11.99123 20 1.178 6,2 x 1011 11.79239 22 1.089 8,4 x 109 9.92427 24 1.092 1,4 x 109 9.14612 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Ab so rba ns i Jam ke
Rata-rata Luas zona bening yang terbentuk di sekitar koloni Pseudomonas
aeruginosa dengan pemberian ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut Etanol
pada medium pertumbuhannya
Konse ntrasi
Rata-rata Diameter Rata-rata Luas Zona Bening (mm) Koloni (mm) Zona Bening (mm) 0% 13.7 18.0 107.7 2% 12.3 16.3 90.1 4% 10.7 14.7 79.6 6% 8.7 10.7 30.4 8% 8.0 0.0 0.0 10% 5.0 0.0 0.0 12% 4.0 0.0 0.0 kontrol 2% 4% 6% 8% 10% 12%
Rata-rata Luas zona bening yang terbentuk di sekitar koloni Pseudomonas
aeruginosa dengan pemberian ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut etil
asetat pada medium pertumbuhannya
Konse ntrasi
Rata-rata Diameter Rata-rata Luas Zona Bening mm Koloni (mm) Zona Bening (mm) 0% 13.0 17.0 94.3 2% 12.0 15.3 71.2 4% 11.3 13.3 38.8 6% 9.0 11.0 31.4 8% 7.0 0 0 10% 6.7 0 0 12% 4.7 0 0 kontrol 2% 8% 10% 12% 6% 4%
No Perlakuan Rata-rata
0 Kontrol 0.872a
1 kontrol + DMSO 0.737a
2 6% Ekstrak dengan pelarut etanol 0.726a
3 8% Ekstrak dengan pelarut etanol 0.655b
4 6% Ekstrak dengan pelarut Etil Asetat 0.705a
5 8% Ekstrak dengan pelarut etil asetat 0.671b
Nilai Rata-rata produksi enzim eksoprotease P. aeruginosa pada beberapa perlakuan dengan ekstrak A. galanga L.
Kurva produksi enzim eksoprotease Pseudomonas aeruginosa
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 U /m l Jam kekontrol kontrol + DMSO 6% Ekstrak etanol 8% ekstrak etanol 6% Ekstrak Etil Asetat 8% ekstrak etil asetat
Pengukuran Pertumbuhan P. aeruginosa pada berbagai perlakuan 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 OD ( 600nm ) Jam Ke
kontrol kontrol + DMSO 6% Ekstrak etanol 8% ekstrak etanol 6% Ekstrak Etil Asetat 8% ekstrak etil asetat
kontrol (0) ekstrak 6% pelarut etanol (1) ekstrak 6% pelarut etil asetat (2) ekstrak 8% pelarut etanol (3) ekstrak 8% pelarut etil asetat (4)
20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam
2.548a 2.503a 1.746b 1.503b 1.722b 1.488b 1.582b 1.226b 1.606b 1.254b Rata-rata Produksi biofilm (berdasarkan Optical Density) pada P.
aeruginosa yang terhambat pada media yang ditambahkan ekstrak A. galanga L dengan pelarut etanol dan etil asetat pada konsentrasi
6% dan 8%.
Rata-rata Produksi biofilm pada Pseudomonas aeruginosa yang terhambat pada media yang ditambahkan ekstrak Alpinia galanga L
dengan pelarut etanol dan etil asetat pada konsentrasi 6% dan 8%.
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000
20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam 20 jam 40 jam kontrol Ekstrak 6% pelarut etanol Ekstrak 6% pelarut Etil Asetat Ekstrak 8% pelarut etanol Ekstrak 8% pelarut Etil Asetat O D ( 595n m)
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 kontrol ekstrak 6% pelarut etanol ekstrak 6% pelarut Etil Asetat ekstrak 8% pelarut etanol ekstrak 8% pelarut Etil Asetat O D ( 595n m)
KESIMPULAN
• Ekstrak Alpinia galanga L mampu menghambat uorum
sensing pada P. aeruginosa (pada konsentrasi 8% mampu
menghambat produksi eksoproteasenya namun tidak
menghambat pertumbuhan selnya, dan pada konsentrasi 6% mampu menghambat pembentukan biofilmnya).
• Tidak ada perbedaan kemampuan penghambatan
quorum sensing pada Pseudomonas aeruginosa oleh
ekstrak Alpinia galanga L dengan pelarut polar (etanol) dan semi polar (etil asetat).
