Yoroppa kabutoebi ni okeru hassei jiki tokuiteki na small RNA no kaiseki

Title Sub Title Author Publisher Publication year Jtitle Abstract. Notes Genre URL. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org). ヨーロッパカブトエビにおける発生時期特異的なsmall RNAの解析 広瀬, 友香(Hirose, Yuka) 冨田, 勝(Tomita, Masaru) 慶應義塾大学湘南藤沢学会 2012-03 研究会優秀論文 真核生物におけるsmall RNAは遺伝子発現調節を行う分子であり, 様々な生命現象に関与していることからその重要性が認知されている. 20塩基前後からなるmicro RNA(miRNA)は形態や組織の形成, 30塩基前後からなるpiwiーinteracting RNA(piRNA)は生殖細胞の発達に必要な分子であることを始めとして, small RNAが発生に密接に関わっている様々な事例が報告されている. しかし, 先行研究ではモデル生物や特定の種類のsmall RNAに焦点をあてたものが多く情報に偏りがあり, 生体内には未だ同定されていないsmall RNAが存在する可能性がある. そこで, 本研究では幼生期に短期間で劇的に形態が変化するヨーロッパカブトエビを対象とし, 発生時期特異的に発現するsmall RNAを同定することでsmall RNAと発生の関わりについての新規知見を得ることを目的として研究を進めている. まず, 次世代シーケンサーによってカブトエビの各発生段階(卵, 幼生1-4令, 成体)における12-45塩基の配列情報を約4, 700万本取得し, piRNAが含まれる分画である25-45塩基長のsmall RNAについての解析を行った. 情報学的手法による他種で同定されたncRNAとの配列比較解析の結果, 他種のncRNAと85%以上の配列類似性を持っカブトエビsmall RNAは2, 200本存在した. そのうちtransfer RNA(tRNA)の一部に対して配列類似性を持つもの575本の中には, 発生過程の1ス テージ特異的に発現量(次世代シーケンサーによって得られたリード数)が高いものが8種存在して おり, non-coding RNA(ncRNA)の断片様の配列が発生時期特異的に発現している可能性が見いだされた. また, 遺伝子銃によって昆虫細胞にGFP発現ベクターを導入することで, small RNAの機能解明に向けたカブトエビへの遺伝子導入系の基盤を整えた. 今後カブトエビを対象とした遺伝子導入系が確立しsmall RNA候補の機能を考察することが可能となれば, small RNAと発生との関連性についての議論を深めることができると期待される. 先端生命科学プロジェクト 冨田勝研究会2011年度秋学期 Technical Report http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=0302-0000-0654.

-SFC-SWP 2011-A_002. ーヨー ロ ッパ カブ トエ ビ に お ける 発 生 時 期 特 異 的 なsmall 2011年. 度. RNAの. 解析. 秋学期 AUTUMN. ︽o 剛o ◎◎ ¶O ︾ o ① 臨o ヨ 5. 広瀬 友香. 環境情報 学部4年. 切 o o 副oξ ・. 先 端生命 科 学 プ ロジェクト. 慶應義塾 大学 湘 南 藤 沢 学 会.

研究会優秀論文推薦の ことば. カ ブ トエ ビ は 節 足 動 物 門 甲 殻 鋼 鯉 脚 目 に 属 し,約2億 な い こ と か ら"生 き た 化 石"と. 年 前 か らほ と ん ど形 態 を変 え て い. 呼 ば れ て い る.本 卒 業 論 文 で は 山 形 県 酒 田 市 で 採 取 可 能 な. ヨ ー ロ ッ パ カ ブ トエ ビ を 対 象 と し,カ ブ トエ ビ の 幼 生 の 発 生 初 期 に観 察 され る劇 的 な 形 態 変 化 に 関 わ るsmallRNAの. 同 定 を 目指 して い る. smallRNAに. よ る遺 伝 子 発 現 調 節 機 構 は 幅. 広 い 生 物 種 に 存 在 し多 様 な 細 胞 プ ロ セ ス に 関 与 して い る た め,近 年 大 変 注 目 され て い る. RNAが 生 命 に及 ぼす 影 響 の 一 端 を 理 解 す る た め に 重 要 な 研 究 対 象 で あ るs皿a 11RNAに ヨ0ロ. ッパ カ ブ トエ ビ の 発 生 時 期 特 異 的 なsmall. RNAの. 着 目 し,. 同定 に向 けて着実 に成果 を得 て い. る こ とか ら,本 卒 業 論 文 を 研 究 会 優 秀 論 文 と して 推 薦 す る.. 慶應 義塾大学 環境情報学部教授 冨田 勝.

2011年 度. 卒業論文. ヨ ー ロ ッ パ カ ブ トエ ビ に お け る 発 生 時 期 特 異 的 なsmall. RNAの. 慶應義塾大学 環境情報学部4年 広瀬 友香. 解析.

論文 要 旨. 真 核 生 物 に お け るsma11. RNAは. 遺 伝 子 発 現 調 節 を 行 う分 子 で あ り,様 々 な 生 命 現 象 に 関 与 し て. い る こ と か らそ の 重 要 性 が 認 知 され て い る.20塩 組 織 の 形 成,30塩. 基 前 後 か らな るmicro. 基 前 後 か ら な るpiwiーinteractingRNA(piRNA)は. あ る こ と を 始 め と して,small. RNAが. 形態や. 生 殖 細 胞 の 発 達 に必 要 な 分 子 で. 発 生 に密 接 に 関 わ っ て い る様 々 な 事 例 が 報 告 され て い る.. しか し,先 行 研 究 で は モ デ ル 生 物 や 特 定 の 種 類 のsmall りが あ り,生. RNA(miRNA)は. 体 内 に は 未 だ 同 定 され て い な いsmall. RNAに. RNAが. 焦 点 を あ て た も の が 多 く情 報 に 偏. 存 在 す る 可 能 性 が あ る.そ. こ で,本. 研. 究 で は 幼 生 期 に短 期 間 で 劇 的 に 形 態 が 変 化 す る ヨ ー ロ ッパ カ ブ トエ ビ を 対 象 と し,発 生 時 期 特 異 的 に 発 現 す るsmall RNAを. 同 定 す る こ と でsmall RNAと. 発 生 の関 わ りにつ い ての 新規 知 見 を得 る. こ と を 目的 と して 研 究 を進 め て い る. ま ず,次. 世 代 シ ー ケ ン サ ー に よ っ て カ ブ トエ ビ の 各 発 生 段 階(卵,幼. 生1-4令,成. 12-45塩 基 の 配 列 情 報 を約4,700万. 本 取 得 し,piRNAが. RNAに. 報 学 的 手 法 に よ る他 種 で 同 定 され たncRNAと. つ い て の 解 析 を行 っ た.情. の 結 果,他 種 のncRNAと85%以 そ の う ちtransfer RNA(tRNA)の. 含 ま れ る 分 画 で あ る25-45塩. 一 部 に 対 して 配 列 類 似 性 を 持 つ も の575本. RNA(ncRNA)の. の 中 に は,発 生 過 程 の 高 い も の が8種. 生,時. 存. 後 カ ブ トエ ビ を 対 象 と した. 補 の 機 能 を 考 察 す る こ と が 可 能 と な れ ば, sma11 RNAと. と の 関 連 性 に つ い て の 議 論 を深 め る こ と が で き る と期 待 され る.. RNA,発. 存 在 した.. 現 ベ ク タ ー を 導 入 す る こ と で, sma11 RNA. の 機 能 解 明 に 向 け た カ ブ トエ ビ へ の 遺 伝 子 導 入 系 の 基 盤 を 整 え た.今. Keywords:small. 基 長 のsmall. 断 片 様 の 配 列 が 発 生 時 期 特 異 的 に 発 現 して い る 可 能 性 が. 見 い だ さ れ た.ま た,遺 伝 子 銃 に よ っ て 昆 虫 細 胞 にGFP発. 遺 伝 子 導 入 系 が 確 立 しsma11 RNA候. お ける. の配 列 比 較 解 析. 上 の 配 列 類 似 性 を持 っ カ ブ トエ ビsmall RNAは2,200本. 1ス テ ー ジ 特 異 的 に 発 現 量(次 世 代 シ ー ケ ン サ ー に よ っ て 得 られ た リー ド数)が 在 し て お り,non-coding. 体)に. 期 特 異 的 な 発 現,ヨ. 2. ー ロ ッ パ カ ブ トエ ビ,遺. 伝 子銃. 発生.

目次. 論文要 旨. 2. 目次. 3. 図 表 リス ト. 5. 6. 第1章. 序論. 6. 1.1RNA研. 究 の重 要 性 7. 1.2small. RNAの. 多 様 性 と発 生 との 関 わ り. 1.3本 研 究 の 着 眼 点 と研 究 意 義. 対 象 と手 法 規small. 3 1. 2.1新. 3 { 1. 第2章. 10. RNA候. 補 の抽 出 に 向 け た情 報 学 的 解 析 3 1. 発 生 段 階 で の ヨ ー ロ ッ パ カ ブ トエ ビ の 回 収. 2.2.2次. 世 代 シ ー ケ ンサ ー に よ る配 列 情 報 の取 得. 3 1. 2.2.1各. 3 1. 2.2.3次 世 代 シ ー ケ ン サ ー で 得 られ た 配 列 情 報 の 解 析. 4 1. 種 のncRNAと. の配 列 類 似 性 の解 析. 2.2.5発. 現 パ タ ー ン解 析. 5 1. 2.2.4他. 7 1. 2.2遺 伝 子 銃 に よ る 遺 伝 子 導 入 法 の 検 討. 7 1. 2.2.1GFP発. 現 ベ ク ター の構 築. 2.2.3Cellfectin試 2.2.4遺. S2細. 9 1. 2.2.2Drosophila. 胞 の 培 養 と継 代. 薬 を 用 い たDrosophila. 伝 子 銃 を 用 い たDrosophila. S2細 S2細. 胞 へ の ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン__._19. 胞 へ の ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン. 3. 20.

1 2. 第3章. 結果 と議 論. 1 2. 3.1情. 報 学 的 解 析 に よ る 新 規small. RNA候. 補 の抽 出 1 2. 世 代 シー ケ ンサ ー に よっ て 出 力 され た 配 列 情 報 の プ ロフ ァイル. 3.1.2様. 々 なncRNAの. 3 2. 3.1.1次. 断 片 が存 在 す る 可能 性 とそ の 特 徴 9 2. 3.1.4発. fragmentの. 発 現 パ タ ー ンの変 化. 生 時 期 特 異 的 に 働 く 機 能 性small. RNA候. 1 3. 3.1.3ncRNA-like. 補 の抽 出 5 3. 3.2遺. 伝 子 銃 に よ るGFP発. 現 ベ ク ター の 導 入 5 3. 3.2.1Cellfectinに. よ るGFP発. 現ベ ク ター の 導 入 5 3. 3.2.2遺 伝 子 銃 に よ るDrosophila. 第4章. S2細. 胞 へ のDNA導. 結論. 入 法 の確 立. 38. 謝辞. 40. 参考文献. 42. 付録. 47. 4.

図 表 リス ト. 2 1. ー ロ ッパ カ ブ トエ ビ の発 生 過 程 に お け る形 態 変 化. 図2:次. 世 代 シ ー ケ ン サ ー の デ ー タ解 析 の フ ロー チ ャ ー ト. 6 1. 図1:ヨ. 8 1. 図3:hrGFP発. 現 ベ ク タ0の. 構築 0 2. 伝 子 銃n)ERA. GIE-III. 図5:他. 種 で 同 定 さ れ たncRNAと. 6 2. 図4:遺. 類 似 性 の 高 いsmal1. RNAの. プ ロ フ ァイ ル 8 2. fragmentが. ア ラ イ メ ン トされ た 部 位 とそ の 数. 図7:tRNAーlike. fragmentの. 発 現 プ ロ フ ァ イ ル. 0 3. 図6:tRNA-like. 3 3. 図8:既. 知 のncRNAと. の 類 似 性 の な いsmal1. RNAの. 発i現 プ ロ フ ァ イ ル 7 3. 図9:Drosophila. 胞 へ のGFP発. 現 ベ クターの導入. 8 1占. 表1:hrGFP遺. S2細. 伝 子 増 幅 に用 い た プ ラ イ マ ー 配 列. 表3:既. 知 のncRNAと. テ ー ジ で 特 異 的 に 発 現 す るsmall. RNAの. 候 補. 5. 孟 4 QU. 表4:1ス. 類 似 した 配 列 の正 規 化 され た 総 リー ド数 上 位50種. ワ・ り臼. 世 代 シ ー ケ ンサ ー で 得 られ た 配 列 の ス ク リー ニ ン グ に お け る配 列 数. 2 9臼. 表2:次.

第1章. 1.1RNA研. 序論. 究 の重 要 性. 一 部 の ウイ ル ス を 除 く,現. 存 す る全 て の 生 物 で は 共 通 し た 遺 伝 情 報 伝 達 の 行 程 を 有 して い る.. こ の 行 程 は セ ン トラ ル ドグ マ と 呼 ば れ,遺 れ る こ と を 指 す.生. 伝 情 報 がDNA,. RNA,タ. ン パ ク質 とい う順 序 で 伝 え ら. 命 が 誕 生 して か らお よ そ35億. 年 の 間 に 生 物 は 進 化 を繰 り返 し,今 現 在 も 多 種. 多 様 な 生 物 が 様 々 な 環 境 下 で 生 存 して い る が,形. 態 や 生活 環 境 が全 く異 な る生 物 で あ って も同様. の 遺 伝 情 報 伝 達 シ ス テ ム を 有 して い る とい う こ と は,生. 物 の 進 化,そ. し て 生 き る仕 組 み を理 解 す. る 上 で 非 常 に 興 味 深 い 事 実 で あ る. セ ン トラ ル ドグ マ の 中 心 的 存 在 で あ るDNAの 明 され,4種 (Watson. 類 の 塩 基(A,T,. and Crick.,1953).膨. G, C)がDNAを. 構 造 は1953年. に ワ トソ ン と ク リ ッ ク に よ っ て 解. 構 成 し て い る 一 要 素 で あ る こ とが 明 らか と な っ た. 大 な 情 報 量 を 持 っDNAは. 遺 伝 情 報 の 設 計 図 と して 全 て の 細 胞 に 存 在. し,時 期 や 組 織 に 応 じて 必 要 な 情 報 の み が 転 写 され て 機 能 して い る.そ の 転 写 産 物 がRNAで RNAもDNAと (mRNA)は. 同 様 に4種. の 塩 基(A,. コ ドン と呼 ば れ る3つ. U, G, C)で. 構 成 され, RNAの. 一 種 で あ るmessenger. 認 識 し,対 応 す る ア ミ ノ酸 をribosomal. さ れ る こ と か らprotein coding gene,. tRNAやrRNAは. と か ら,non-coding. 呼 ば れ て い る.. RNA(ncRNA)と. の 起 源 で あ る"と 提 唱 す る,RNAワ. et al.,2005), RNAはDNAと. 現 制 御 を 行 う例 が 多 々 発 見 され た(Lau. ら,RNAの. タンパ ク質 に 翻 訳. 身 が酵 素活 性 を. et al.,1983),"RNAこ. ー ル ド仮 説 が 世 に 広 ま っ た(Gilbert,1986).ま. た,ゲ. ノム プ ロ. 上 が 転 写 され て い る こ とが 明 ら か. et al.,2001).真. 基 程 度 か ら成 るncRNAが. 合 成 経 路 の 探 索 を行 う こ と は,生. 多 い に 役 立 つ も の だ と考 え られ る.. 6. 遺伝 子発. 核 生 物 で は こ の 他 に も多 くのncRNAが. 生 体 内 で 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る こ と は 周 知 の 事 実 と な っ た.こ. 機 能,生. そ が 生命. タ ンパ ク質 翻 訳 の架 け橋 と して の役割 のみ で は な い. こ とが 示 唆 され る よ う に な っ た.更 に 、2000年 代 に は20-30塩. 定 され,ncRNAが. ・'1年 代 にRNA自. et al.,1982;Guerrier-Takada. ジ ェ ク トの 台 頭 に よ り高 等 真 核 生 物 の ゲ ノ ム で は 全 体 の70%以 と な り(Carninci. proteinの. タ ン パ ク質 に 翻 訳 され ず に機 能 して い る こ. タ ン パ ク 質 合 成 に 必 要 不 可 欠 な 分 子 で あ る と共 に,. 有 す る 例 が 発 見 さ れ た こ と か ら(Kruger. の コ ドン を. RNA(rRNA)とribosomal. 複 合 体 で あ る リボ ソ ー ム に 運 搬 す る こ とで タ ンパ ク 質 が 合 成 さ れ る.mRNAは. RNAは. RNA. の 塩 基 が 一 つ の ア ミ ノ 酸 に対 応 す る よ うに 配 置 され る こ と で,. タ ンパ ク 質 の 構 成 成 分 で あ る ア ミ ノ酸 の 組 成 を 表 して い る(Crick,1968).1nRNA上 transferRNA(tRNA)が. あ る.. 同. う した 背 景 か. 命 の進 化 や 生 命活 動 の メカ ニ ズ ムの解 明 に.

L2. small. RコNAの. 多 様 性 と発 生 と の 関 わ り. 先 に 示 し た よ う に,真 核 生 物 で は 多 種 のncRNAが. 数 多 く 同 定 さ れ て い る.中 で もtRNAとrRNA. は タ ン パ ク 質 合 成 に 直 接 的 に 関 わ る 物 質 で あ る が ゆ え に 、 生 体 内 のRNA量 そ の 他 に も ス プ ラ イ シ ン グ に 関 与 す るsmall 寄 与 す るsmall. nucleolar. RNA(snoRNA),そ. の 多 く を 占 め て い る.. nuclear RNA(snRNA)やncRNAの. 修 飾 を 行 う機 構 に. し て 遺 伝 子 の 発 現 制 御 を 行 うsmall. RNAが. 生体 内 で重. 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と が 知 ら れ て い る. small RNA研. 究 が 注 目 を 集 め る 先 駆 け と な っ た の は1998年. あ っ た(Fire. et al.,1998).. RNAiと. 2001;Tijsterman. 細 胞 内 で21塩. のRNAが. 基 前 後 のRNAに. 切 り取 ら れ,標 的 のmRNA et al.,. 境 ス トレ ス に 対 応 す. 伝 子 の発 現 調 節 の た め には 多 くの転 写制 御 因 子 が 関. 伝 子 発 現 制 御 と い う重 要 な 機 構 の 一 部 をncRNAで. も最 も小 さい ク ラス. 担 っ て い る と い う 事 実 は 多 く の 研 究 者 の 関 心 を 集 め た.こ れ ま で に 幅 広 い 生 物 種 で 多 種. のsma11 small. 遺伝 子 の発 現 を制 御 す る. も そ も 遺 伝 子 の 発 現 は 組 織 や 時 期,環. る た め に 厳 密 に 制 御 さ れ な け れ ば な ら ず,遺 の 中 で,遺. 発 見 で. 遺 伝 子 発 現 制 御 を 行 っ て い る こ と が 明 ら か と な っ た(Hutvagner. and Plasterk,2004).そ. わ っ て い る.そ. interference(RNAi)の. は 外 来 か ら 導 入 し た 二 本 鎖 のRNAが. 機 構 の こ と で あ り,後 に 二 本 鎖 のRNAは に 結 合 す る こ と でmRNAの. のRNA. RNAの RNAが. 同定 が進 み 、 そ の標 的へ の結 合様 式 や 生合 成 経 路 の特 徴 に よって 複数 の タイ プ の 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ て き た(Lin. He. and. Hannon,2004;Jinek. and. Doudna,. 2009). そ の 中 で も 最 も 情 報 が 蓄 積 し て い る の は,micro ら 構 成 さ れ るsmall miRNAが mature. ncRNAで,. 初 め て 同 定 さ れ た(R. miRNAと. な り(Y.. mRNAへ. and Plasterk,2005).. C. Lee et al.,1993).. miRNAは. miRNAはseed配. P Bartel,2004).同. 時 に,実. が生 体 内で 時期. ・組 織 特 異 的 に 発 現 し,細. に 線 虫 に お い てlin-4と. et al.,2001),. RISC複. 翻 訳 抑 制 や 分 解 を 行 う(Lin 列 と 呼 ば れ る5'末. の 結 合 に 重 要 で あ る こ と が わ か っ て お り,コ. 基 か. 端 か ら8塩. 合 体 に 取 り. He. and Hannon,. 基程 度 の 配 列 が. ン ピ ュ ー タ ー を 用 い た 標 的 予 測 も 広 く行 わ. 験 的 な 検 証 も 含 め た 多 く の 研 究 成 果 に よ り, miRNA 胞 分 化 、 形 態 発 達 、 ウ イ ル ス か ら の 生 体 防 御,腫. 成 、 代 謝 な ど の 多 く の 細 胞 プ ロ セ ス に 関 与 し て い る こ と が 明 ら か と な っ て き た(David 2004;Wienholds H.Zhu. い う. 複数 のプ ロセ ッシ ング過 程 を経 て. et al.,2003;Hutvagner. 結 合 し,標 的mRNAの. れ て い る(David. あ る. miRNAは18-24塩. 構 が 発 表 さ れ る 前 の1993年. Lee et al.,2003;Yi. 込 ま れ る こ と で 標 的 のmRNAに 2004;Wienholds. RNAi機. RNA(miRNA)で. and Plasterk,2005;Esquela-Kerscher. and Frank. J SIack,2006;Takane. 瘍 形. P Bartel,. and Kanai,2011;. et al.,2011).. 一 方 で,RNA研 (piRNA)は 2011;Girard. 究 の 中 で も 近 年 注 目 を 集 め て い る 分 子 の 一 つ で あ るpiwi-interacting. 生 殖 細 胞 特 異 的 に 発 現 す るRNA分 et al.,2006).. piRNAの. 子 で あ り,2006年. 塩 基 長 はmiRNAよ. 7. に 同 定 さ れ た(M.. り も 少 し 長 い,24-31塩. C. Siomi. RNA et al.,. 基 程 度 で あ り(Lin,.

2007),Argonauteの Siomi. and M.. サ ブ フ ァ ミ リ ー で あ るPIWIタ. C. Siomi,2009).興. 味 深 い の は,. ン パ ク 質 に 結 合 す る こ と が 知 ら れ て い る(H.. piRNAが. トラ ン ス ポ ゾ ン の 一 種 で あ る レ トロ トラ ン. ス ポ ゾ ン の 抑 制 に 関 わ っ て い る と い う 点 で あ る(Lin,2007).ト 約45%,マ. ウ ス は 約40%,シ. Vieira,2006),生. ラ ン ス ポ ゾ ン は ヒ トの ゲ ノ ム 中 の. ョ ウ ジ ョ ウ バ エ は 約15∼22%も. 存 在 す る と 言 わ れ て お り(Biemont. and. 殖 細 胞 に お け る トラ ン ス ポ ゾ ン の 抑 制 機 構 は 子 孫 を 残 す た め の 極 め て 重 要 な 戦 略. と 言 え る. こ れ ま で に 多 く のpiRNAは. ヒ ト,マ. ウ ス,ラ. ッ ト,シ. 有 性 生 殖 を 行 う 生 物 に お い て 同 定 さ れ て い る(Girard 2007).更. に,雌. 雄 同 体 で あ る 線 虫 で は21URNAと. サ ブ フ ァ ミ リ ー のPRG-1と 2006;G.Wang. et al.,2006;Saito. 称 さ れ る,Uか. 相 互 作 用 し,生. and Reinke,2008;Batista. ョ ウ ジ ョ ウ バ エ,ゼ. ブ ラフ ィ ッシ ュ等 の. et al.,2006;Houwing. ら 始 ま る21塩. et al.,. 基 のRNAがPIWI. 殖 細 胞 で 発 現 し て い る こ と が 報 告 さ れ(Ruby. et al.,2008),こ. れ ま で に 定 義 され て い たpiRNAの. et al., 塩 基 長 の. 特 徴 と は 異 な る 分 子 が 生 殖 細 胞 の 発 達 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る よ う に な っ た.線 は 後 に,26G. endo-siRNAと. 呼 ば れ る,. Gか. ら 始 ま る26塩. に 発 現 し て い る こ と も 明 ら か と な っ た(T,Han ン パ ク 質 郡 も あ る こ と も ふ ま え る と,こ. 2006;Schwartz. et al.,2008),. ン の 状 態 の 変 化 な ど,多. 基 の配 列 が接 合 子 の発 達 や 精子 形 成 時. et al.,2009).未. れ か ら のpiRNA研. 他 に も ヘ テ ロ ク ロ マ チ ン 化 を 誘 導 す るsmal1 small RNAは. RNA等. 虫 で. だ 機 能 未 知 のpiRNAに. 関与 す る タ. 究 の 飛 躍 が 期 待 さ れ る.. が 発 見 さ れ た こ と に よ り(D.. H. Kim. 標 的 へ の 結 合 に よ る 翻 訳 の 制 御 や 標 的 の 分 解,ク. et al., ロマ チ. 面 的 な メ カ ニ ズ ム を 通 して 遺 伝 子 発 現 制 御 を 行 っ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ. れ る よ う に な っ た(Chapman. and Carrington,2007;Farazi. 細 胞 プ ロ セ ス も 多 岐 に 渡 る こ と か ら,small. et al.,2008).更. RNAが. にsmall. RNAが. 作 用 す る. 様 々 な 生 命 現 象 の 一 旦 を 担 っ て い る と言 っ て. も 過 言 で は な い.. 動 物 に と っ て 極 め て 重 要 な 生 命 現 象 の ひ と つ と言 え る発 生 と は 受 精 卵 の 細 胞 分 割,分 形 成 とい っ た 生 物 が 成 体 へ 成 長 す る ま で の 一 連 の 過 程 を さす.smal1 に 関 与 し て い る こ と は 上 述 し た 通 り で あ る が,そ. RNAが. 化,形. 態. 様 々 な細 胞 プ ロセ ス. の 一 っ が"発 生"で あ る(Sun. and. Tsao,2008;. Stefani and Frank J SIack,2008). これ ま で に 無 脊 椎 動 物 に お け る発 生 と の 関 連 を 示 した 研 究 は,線 た モ デ ル 生 物 を 中 心 に 行 わ れ て き た.例. え ば,let-7と. い うmiRNAは. に つ れ て 発 現 量 が 増 加 す る こ とが 知 られ て お り,let-7を 繰 り返 し成 体 に な る こ とが で き な い(Reinhart で あ るLIN28の et al.,2000). とLIN28の. 虫や シ ョウジ ョウバ エ とい っ 線 虫 の発 生 ステ ー ジ が進 む. 欠 損 した 線 虫 で はLarva. et al.,2000).-方. で,発. 3とLarva. 4を. 生 過 程 に 関 わ る タ ンパ ク 質. 発 現 量 は発 生 ス テ ー ジ が 進 む に つ れ て 減 少 す る こ と が 報 告 さ れ て い る(Reinhart Let-7とLrN『28の. 発 現 量 の 変 化 はlet-7のdaf-1Z. 訳 制 御 を介 し たLIN28の. 発現制御. 結 合 に よ るpre-let-7の 分 解 の 促 進 に よ っ て 引 き起 こ さ れ る と言 わ れ て お り,こ. 8. の2つ.

の 分 子 に よ る ネ ガ テ ィ ブ フ ィ ー. ドバ ッ ク ル ー プ が 発 生 を 制 御 し て い る 一 つ の 例 で あ る. (Viswanathan. et al.,2008;Rybak. 2010).そ. et al.,2008;Piskounova の 他 に も,線. et al.,2008;Heo. 虫 で は 発 生 初 期 に 発 現 す るlinー4や. 同 定 さ れ て い る(Wienholds. and Plasterk,2005;Resnick. and Plasterk,2005).こ. の よ う に,モ. et al.,. 神 経 の 左 右 対 称 性 に 関 わ るmiR-273が. et al.,2010)-更. ブ ラ フ ィ ッ シ ュ に お い て も 発 生 に 関 わ る 複 数 のmiRNAが. et al.,2008;Resnick. に,シ. 存 在 す る(Aravin. デ ル 生 物 の 発 生 過 程 で は 様 々 なmiRNAが. ョ ウ ジ ョ ウバ エ や ゼ et al.,2003;Wienholds 機 能 して い る こ とが. 報 告 さ れ て い る. miRNA以. 外 に もpiRNAは. small modulatory. double. 生 殖 細 胞 の 発 達 に 必 要 で あ る こ と や(Klattenhoff. strand RNA(smRNA)は. て い る こ と が 報 告 さ れ た こ と か ら(Kuwabara 役 割 を 担 っ て い る こ と は 明 ら か で あ る.一 特 定 の 種 類 のsma11 に 占 め るsmall. RNAの. RNA,特. にmiRNAに. and Theurkauf,2008),. 神 経 の 発 達 に 必 要 な 遺 伝 子 を 転 写 レベ ル で 制 御 し et al.,2004;2005), 方 で,先. small RNAが. 行研 究 はモ デ ル 生物 を対 象 と してい る ものや. 焦 点 を あ て た も の が 多 い.そ. 役 割 を 網 羅 し て い な い 可 能 性 が あ り,発. 括 的 な 理 解 が 望 ま れ て い る.. 9. 発 生 に おい て 重 要 な. の た め,既. 知 の知 見 は発 生. 生 に お け る 機 能 性small. RNAの. 包.

1.3本 研 究 の着 眼 点 と研 究 意 義. 本 研 究 で は 非 モ デ ル 生 物 で あ り,"生 cancriformis(T. し た.カ. cancriformis)の. き た 化 石"と 呼 ば れ る,ヨ. 発 生 時 期 特 異 的 に 働 く機 能 性small. ー ロ ッパ カ ブ トエ ビTriops RNAを. 同 定 す る こ と を 目的 と. ブ トエ ビは 節 足 動 物 門 甲 殻 鋼 総 脚 目 に 属 す る 生 物 で あ り,化 石 の 形 態 か ら約2億. 年前か. ら現 在 ま で 形 質 が ほ とん ど変 化 して い な い と推 測 され る こ とや 卵 が 乾 燥 体 制 を 持 っ て い る こ と な ど,ユ. ニ ー ク な 特 徴 を 有 し て い る.ま. こ る こ と が 知 られ て い る(図1).1令 に な る.尾. 鞭 の 変 化 も 著 し く,幼. た,カ か ら4令. ブ トエ ビ の 幼 生 期 で は 短 時 間 で 劇 的 な 形 態 変 化 が 起 ま で は わ ず か26時. 間 程 度 で 成 長 し,体 長 も約2倍. 生 初 期 に観 察 され る ノ ー プ リ ウ ス 眼 が 後 期 に か け て 退 化 す る に. 従 っ て 複 眼 の 形 成 が 行 わ れ る こ と も例 と して 挙 げ られ る(図1).前 の 形 成 に 関 連 したsmall. RNAの. 変 化 す る カ ブ トエ ビ で はsma11. 存 在 が 報 告 され て い る こ と か らす る と,発 RNAが. ダ イ ナ ミ ッ ク か つ 巧 妙 に 発 生,特. 伝 子 群 を 制 御 して い る 可 能 性 が あ る と考 え られ る.よ す るsmall RNAを る.更. 同 定 す る こ とで,発. に こ の 時 に,こ. が 長 いsmall. RNAを. 述 し た よ うに 既 に 形 態 や 組 織. っ て,カ. 生 過程 で形 態 が劇 的 に. に形 態形 成 に 関 与す る遺. ブ トエ ビ の 発 生 時 期 特 異 的 に 発 現. 生 に 関 与 す るsmall RNAの. 新 規 知 見 を 得 られ る と期 待 され. れ ま で に 形 態 形 成 と の 因 果 関 係 が よ く 知 られ て い るmiRNAよ 対 象 とす る こ とで,新. 規 機 能 性small. RNAを. り も配 列 長. 同 定 で き る の で は な い か と考 え. て い る.. ヨ ー ロ ッパ カ ブ トエ ビ の 発 生 時 期 特 異 的 に 発 現 す る機 能 性small 能 性small RNA候 small RNAの. RNAを. 同 定 す る た め に は,機. 補 の 選 定 と候 補 配 列 の 発 現 確 認 と機 能 の 推 定 が 必 要 で あ る と考 え られ る.近 年,. 同 定 に 向 け た ス テ ップ と して 次 世 代 シ ー ケ ン サ ー の デ0タ. に 行 わ れ て い る.次 世 代 シ ー ケ ン サ ー に よ る解 析 はncRNAの ー タ 量 も 多 い こ と か ら機 能 性small. RNA候. を用 い た配 列解 析 が頻 繁. 配 列 情 報 を得 る こ とがで き る上 にデ. 補 を選 定 す る た め の 手 法 と して 適 し て い る .更. 生 段 階 毎 の 次 世 代 シ ー ケ ン サ ー に よ る デ ー タ を 取 得 す る こ と が で き れ ば,正 数 の 比 較 に よ っ て お お よ そ の 発 現 量 の 変 化 を 追 う こ と が で き る.情 ncRNAと. の 比 較 解 析 結 果 や リー ド数 の 変 動 を 指 標 と して,カ. に,発. 規 化 され た配 列 の本. 報 学 的 手 法 に よ る他 種 の. ブ トエ ビ の機 能 性small. RNA候. 補を. 絞 る こ とが 可 能 とな る と考 え られ る. 情 報 学 的 手 法 に よ り予 測 され たsmall. RNAが. 実 際 に生体 内で機 能 してい るか を明 らか にす る た. め に は 更 に い くつ か の ス テ ップ を 経 る 必 要 で あ る と考 え られ る.ま 生 体 内 で 発 現 し て い る の か を確 認 す る.RNAの Polymerase. Chain Reaction(RT-PCR)や. を 行 う こ と で,予 測 され たRNAの. ず,予. 測 され たsmaU. 発 現 を確 認 す る 方 法 と し て はReverse. RNAが. Transcription. ノ ザ ン プ ロ ッ ト法 が 広 範 的 に 用 い られ て い る.両. 者 の実 験. 配 列 や 塩 基 長 の 確 認 や 発 現 量 の 定 量 が 可 能 と な る.本 研 究 の 目. 的 で あ る 時 期 特 異 的 に 発 現 す るsmall. RNAを. 同 定 す る た め に は,発. 10. 生 時 期 ご と に 抽 出 し たtotal.

RNAを. 用 い て ス テ ー ジ 間 で の 発 現 量 の 変 動 を 追 う必 要 が あ る た め,こ. 発 現 が 確 認 さ れ た 後 に着 目す べ き はsmall RNAの 目 的 の 遺 伝 子 の 発 現 を 増 加,も. 機 能 性 で あ る.遺 伝 子 の機 能 を 知 る た め に は,. し くは 減 少 させ た 後 に,細. 胞 や組 織 の表 現型 の変 化 の観 察 や 他 の. 遺 伝 子 の 発 現 量 を 定 量 して 比 較 す る と い っ た 手 法 が と られ る.こ い て 発 現 が 確 認 され た 新 規smaU. RNA候. こ で,将. 来 的 に カ ブ トエ ビ に お. 補 が ど の よ うな 機 能 を 有 して い る か を 考 察 す る た め に は,. 外 来 か らの 遺 伝 子 導 入 系 を 構 築 し,sma11 子 導 入 法 の 中 で も遺 伝 子 導 入 装 置(遺. れ ら の 手 法 は 有 用 で あ る.. RNAの. 発 現 を 変 化 させ る 必 要 が あ る.そ. 伝 子 銃;gene. gun)を. 銃 に よ る 遺 伝 子 導 入 系 を 確 立 す る こ とが 出 来 れ ば,機. こで私 は遺 伝. 用 い た 遺 伝 子 導 入 に 着 目 した.遺. 能 性small. RNA候. 伝子. 補 の 発 現 量 を増 減 させ た. 時 の カ ブ トエ ビ の 表 現 型 を 追 うこ とに よ り,発 生 時 期 特 異 的 に 発 現 す るsmall RNA候. 補 の生 体 内. で の 役 割 に つ い て 議 論 す る こ と が 可 能 で あ る. 本 研 究 で は ヨー ロ ッパ カ ブ トエ ビ に お け る 発 生 時 期 特 異 的 に 働 くsmall. RNAを. 同 定 す る た め に,. 上 述 した 研 究 方 法 の うち 次 世 代 シ ー ケ ン サ ー に よ っ て 得 られ た 配 列 の 解 析 と遺 伝 子 銃 に よ る 遺 伝 子 導 入 系 の 基 盤 の 構 築 を 試 み た.本 特 異 的 に働 くsmaU. RNA候. 卒 業 論 文 で は 結 果 の3.1に. 補 の 抽 出 に っ い て,3.2に. け て 行 っ た 実 験 結 果 を 報 告 し,発. て 遺 伝 子 銃 を 用 い た 遺 伝 子 導 入 系 の構 築 に 向. 生 に お け るsmall RNAの. 11. て情 報 学 的手 法 を用 いた発 生 時期. 機 能 の 可 能 性 に つ い て 議 論 した い..

Body length increases two-fold in one day. ンヲ. ` Egg. 一 ist instar. ー. 2^dinstar. 3rd instar. 4tA instar. Adult. ー → Involution of Nauplius eye. ー Growth. of tall. Development. 一. 一. of compound. FO-mation. 図1=ヨ. →. of eggs. ー ロ ッパ カ ブ トエ ビ の 発 生 過 程 に お け る 形 態 変 化. ヨー ロ ッパ カ ブ トエ ビの 発 生 過 程(卵,幼 示 した.幼. eyes. 生1ー4令,成. 生 時 の 写 真 に お け る 白 い バ ー は100ｵm,成. 体)の 撮 影 写 真 と発 生 過 程 で 観 察 され る 形 態 変 化 の 一 例 を 体 の 写 真 に お け る 黄 色 い バ ー は500ｵmを. 12. 表 し て い る..

第2章. 2.1新. 対 象 と手 法. 規small. RNA候. 補 の 抽 出 に 向 けた 情 報 学 的解 析. 2.2.1各 発 生 段 階 で の ヨ ー ロ ッ パ カ ブ トエ ビ の 回 収 ヨー ロ ッパ カ ブ トエ ビ は 山 形 県 酒 田 市 で 採 取 し,水 温20℃,ラ した.次. 世 代 シ ー ケ ン サ ー 用 の サ ン プ ル と し て,卵. 成 体 を2匹 で は,本. 回 収 した.本. 解 析 に 用 い た 成 体 サ ン プ ル の シ0ケ. れ は エ サ の 赤 虫(ユ. 可 能 性 が 示 唆 され た(付 録1).更. ス リカ の 幼 虫 で あ り,昆 に こ のsmall. RNAの. 共 に減 少 し て い く様 子 が 観 察 され た(付 録1).先 RNAを. を約1000個,幼. 来 昆 虫 鋼 双 翅 目に 属 す る 生 物 の み が 持 つ と さ れ る2S. て お り,そ. イ トを14.5h/day照 生1-4令. 射 して 飼 育. を そ れ ぞ れ500匹,. ン スデ ー タ取 得 前 に行 った 実験 結 果 rRNAが. カ ブ トエ ビ体 内 に も 蓄 積 し. 虫 鋼 双 翅 目 に 属 す る)由 来 の も の で あ る. 発 現 量 はエ サ を 与 えて か らの時 間 の経 過 と. 行 研 究 で は 線 虫 のRNAi法. の一 つ として特 定 の. 高 ・asさ せ た 大 腸 菌 を エ サ と し て 線 虫 に 与 え る 手 法 が 確 立 され て い る こ と(Timmons. 2001)や. 生 体 内 に 取 り込 ん だ 食 物 のmiRNAが. か ら も(L.Zhang. 宿 主 のmRNAに. et al.,2011),エ サ 由来 のsmall RNAは. 生1-4令. 作 用 す る 例 が 報 告 され て い る こ と. 研 究 や 食 物 を 取 り込 ん だ 生 物 に と っ て 有 用. で あ る こ と も あ る が,本 研 究 で は,カ ブ トエ ビ 由 来 のRNAを る た め に,幼. et al.,. は エ サ を 与 え て い な い 個 体,成. 出 来 る 限 り精 度 良 く シ ー クエ ン ス す. 体 に 関 して は エ サ を 与 え て か ら約19時. 間後. の 個 体 を 対 象 と した.. 2.2.2次. 世 代 シ ー ケ ン サ ー に よ る配 列 情 報 の 取 得. 回 収 した 個 体 はTRIzol(lnvitrogen社)を. 使 用 して, totalRNAを. よ る 解 析 は 外 注 した.配 列 取 得 ま で は,1)12-45塩. 基 の 分 画 のRNAを. 末 端 に タ グ 配 列 を 連 結 し,逆 転 写 反 応 に よ っ てcDNAラ (GAIIx)に. 政 策 ・メ デ ィ ア 研 究 科. 精 製,2)RNAの5'末. イ ブ ラ リー を 作 成,3)Genome. よ っ て 配 列 決 定 を 行 う,と い う手 順 で 進 め ら れ た.な. 製 は慶應 義 塾 大 学 大 学 院. 調 製 し,次 世 代 シ ー ケ ン サ ー に. お,個. 端 と3' Analyzer Ilx. 体 の 回 収 とtotal RNAの. 調. 博 士課 程 の高 根 香 織 氏 が行 った サ ン プル を用. い た.. 2.2.3次. 世 代 シ ー ケ ン サ ー で 得 られ た 配 列 情 報 の 解 析. 次 世 代 シ ー ケ ン サ ー に よ り得 られ た 配 列 情 報 か ら発 生 時 期 特 異 的 に 働 くsmall RNA候. 補 を絞 る. に あ た り,ま ず 配 列 の ク オ リテ ィ ー の 低 い も の や リー ド数 の 少 な い も の を 除 去 した(図2,step 1-2).配. 列 の ク オ リテ ィー はGAIIxの. 解 析 出 力 フ ァ イ ル の ひ とつ で あ るFAsTQフ. 13. 1-1,. ァイ ル の 情 報.

を 元 に 算 出 し た(Cock ス エ ラ ー(N)が 時 に,本. et al.,2010).こ. の 時,ク. オ リ テ ィ ー が20未. 含 ま れ て い る も の を 除 去 し た.次. 研 究 で 対 象 と し て い る25-45塩. に,リ. 満 の も の と,配. ー ド数 が10未. 列 中 にシ ー ケ ン. 満 の 配 列 を 除 去 し た.同. 基 の 分 画 に 含 ま れ る 配 列 を 抽 出 し(図2,step2),今. 後 の. 解 析 の 対 象 と し た. 次 世 代 シ ー ケ ン サ ー に よ っ て 読 ま れ た リ ー ド に は,分 て 本 来 の 配 列 と 末 端 の 塩 基 が 異 な るisofb㎜ の 配 列 類 似 性 に よ っ てisoformの 当 た り で ア ラ イ メ ン ト し,配 お,本. 解 途 中の 産物 や シー ケ ン スエ ラー に よ っ. が 大 量 に 存 在 し て い る と 予 想 さ れ る.そ. グ ル ー プ 化 を 行 っ た.ssearch(Pearson,2000)を. 列 間 の 類 似 性 が90%以. こ で,配. 用 いて 全配 列 を総. 上 で あ る も の を 同 一 グ ル ー プ と 見 な し た.な. 研 究 の 全 て の マ ッ ピ ン グ 解 析 は 次 世 代 シ ー ケ ン サ ー に よ っ て 得 ら れ た リ ー ド の3'末. ー ケ ンスエ ラー で あ る可 能性 を考 えて. ,3'末. 列 間. 端 の1塩. 端 が シ. 基 の ミ ス マ ッ チ は 類 似 性 の 算 出 か ら除 く こ. と と し た. ヨ ー ロ ッ パ カ ブ mitochondria. DNA,. ト エ ビ は ゲ ノ ム が 解 読 さ れ て い な い が,expressed rRNAの. 公 開 さ れ て い る.更 のinternal. に,こ. transcribed. 情 報 の 一 部 がNational. Center. れ ま で に 自 ら ク ロ ー ニ ン グ,シ. spacer(ITS)領. of Biotechnology. 域 の 配 列 情 報 を 得 て い る.そ. こ にITSの ー ド(図2. 分 解 産 物 を 除 こ う と 考 え た. 配 列 情 報 を 加 え た 全4554本 ,step2)を. ァ レ ン ス 配 列 に90%以. NCBIか. こ で,取. 上 あ た っ て い る リ ー ド を 除 い た.こ. よ る ア ラ イ メ ン ト を 実 行 し,90%以. 得 可 能 な ヨー ロ ッ パ カ られ た 配 列 中 に 含 ま れ る で あ り,そ. ッピ ングす る際 は まず 全 リ. よ る ロ ー カ ル ア ラ イ メ ン トを 行 い,リ. い て は リ フ ァ レ ン ス の マ ッ ピ ン グ 部 位 の 上 流 ・下 流50bpを 2007)に. て. ッ パ カ ブ トエ ビ. ら 取 得 し た 配 列 は 計4,553種. を マ ッ ピ ン グ の 対 象 と し た.マ. ク エ リ ー と し てBLAST(blastn)に. tag(EST)や. Information(NCBI)に. ー ケ ン ス し て,ヨ0ロ. ブ トエ ビ の 配 列 情 報 に マ ッ ピ ン グ さ れ た リ ー ド を 除 去 す る こ と で,得 mRNAやncRNAの. sequence. の 時 に90%に. フ. 達 し な か っ た リー ドに つ. 含 む 配 列 と 共 にClustalW(Larkin. et al.,. 上 マ ッ ピ ン グ さ れ た も の を 更 に 除 去 し た(図2,step. マ ッ ピ ン グ さ れ た も の を 除 く 際 に は,isofb㎜. の グ ル ー プ 情 報 を 参 照 し,そ. 3).. の リ ー ドのisofo㎜. も. 同 時 に 除 く こ と で 配 列 数 の 絞 り込 み を 行 っ た. こ れ よ り以 降 は 機 能 性small. RNA配. 列 候 補 を 絞 る た め に,グ ル ー プ 化 し たisoformの. 中 か ら最 も. リ ー ド数 の 高 い も の を 代 表 配 列 と し て 解 析 に 用 い た.. 2.2.4他. 種 のncRNAと. の 配 列 類 似 性 の 解 析. 次 に,こ れ ま で に 選 別 し たsma11. RNA候. と の 配 列 の 類 似 性 を 調 べ た(図2,step. 補 の 性 状 解 析 を 行 う た め,他 種 で 同 定 さ れ て い るncRNA 4).近. 子 制 御 を 行 っ て い る こ と が 報 告 さ れ(R6ther ncRNAの pre-miRNAか. 断 片 候 補 が 機 能 性small らmature. miRNAへ. RNAで. 年,様 and. 々 なncRNAか Meister,2011),配. あ る 可 能 性 が あ る.更. ら 由 来 し たsmall. 遺 伝. 列 の類 似 性 を元 に抽 出 した に, pre-miRNAと. 類 似 した 配 列 は. の プ ロ セ ッ シ ン グ の 過 程 で 生 成 さ れ たmiRNAのisofb㎜. 14. RNAが. で あ る.

可 能 性 が 高 い.本. 研 究 で はmiRNAと. は 異 な る 発 生 に 関 わ るsmall. 目 的 で も あ る た め,miRNAのisofbm1を. et al.,2009).取. 166,373本,tRNAが28,482本, が2241本,snoRNAが4,984本,. を 既 知 のncRNAに ncRNAと. precursor. snRNAが3,951本,そ し て 扱 っ た.そ. 対 し て ア ラ イ メ ン ト し た.85%の. smal1 RNAが. (ア ラ イ メ ン ト さ れ た 数 を そ のSOで. 登 録 さ れ て い るRNAの. る,と. ブ トエ ビsma11. ま た,tRNAに. の 基 準 に よ っ て,カ. 類 似 し た 配 列 の 特 徴 解 析 と し て,ア. 予 測 し,small. RNAが. piRNAが. mature. miRNA. で あ っ た.研 用 い て,全. 究. リー ド. RNAを. た,. ア ライ メ ン ト. 複 数 の リフ ァ レ ン ス に ア ライ メ ン ト さ れ. RNAに. も 多 く ア ラ イ メ ン ト さ れ て い たSO 総 数 で 割 っ た 値 が 高 い も の)を 類 似 し て い るncRNAを. ラ イ メ ン ト さ れ たtRNA配. ア ラ イ メ ン ト さ れ た 部 分 がtRNAの. 性 が あ る の か を 調 べ た.tRNAの. miRNAが4,610本,. 指 標 と し てsmall. 列 の 類 似 率 が 最 も 高 い も の を 選 択 す る,2)最. い う2つ. 訳 は,. 3.0よ. 満 の も の は"類 似 性 の な い 配 列"と 見 な し た.ま. に よ っ て 分 類 し た.こ. た 場 合 は,1)配. database. 類 似 性 を 持 っ も の を 本 研 究 に お け る"既 知 の. Ontology(SO)を. の 時,. で あ り,内. ssearch(Pearson,2000)を. よ っ て 登 録 さ れ て い るSequence. さ れ たRNA種. RNA. の 他 のRNAは272,890本. の 後,. 類 似 性 の あ る 配 列"と 見 な し,85%未. fRNAdbに. デ ー タ はfunctional. 得 し た 配 列 は 合 計510,055本. rRNAが26,524本,. で は こ れ ら を 既 知 のncRNAと. 見 つ け る こ とが一 つ の. 区 別 す る と い う意 味 で も こ の 解 析 は 有 用 で あ る.. 解 析 に お い て リ フ ァ レ ン ス 配 列 と し た 既 知 のncRNAの り 取 得 し た(Mituyama. RNAを. 選 択 す. 決 定 し た. 列 か ら二 次 構 造 を. 二 次 構 造 の ど の 部 分 で 切 断 され た 可 能. 二 次 構 造 予 測 に はtRNAscan-SE(Lowe. and Eddy,1997)を. デ ー タ セ ッ トの 生 物 種 が 真 核 生 物 の み に と ど ま ら な い こ と か ら,general. tRNA. mode1を. 用 い, 使 用 して予. 測 を 行 っ た.. 2.2.5発. 現 パ タ ー ン 解 析. small. RNAの. 発 現 パ タ ー ン を 予 想 す る た め に,正. 視 化 を 行 っ た(図2,step (step 1)で. 5).各. の 変 動 をCluster al.,2004)で Average法. 発 生 段 階 で 得 ら れ た リ ー ド数 を 配 列 情 報 に 信 頼 性 の あ る 配 列 数. 割 っ た 数 値 を 正 規 化 し た 値 と し た.正. ー ド数 の 合 計 値 で 割 る こ と で 3.0(de. Hoon. ,各. 規 化 し た リ ー ド数 を 用 い て 変 動 パ タ ー ン の 可. 規 化 し た リ ー ド数 を 全 発 生 段 階 で の 正 規 化 し た リ. ス テ ー ジ に お け る リ ー ド が 全 体 に 占 め る 値 を 算 出 し た.こ. et al.,2004)に. よ る ク ラ ス タ リ ン グ 後 に,. ヒ ー トマ ッ プ を 作 成 す る こ と で 可 視 化 し た.な を 用 い た.. 15. お,. JAVA. Cluster. 3.0の. Tree view(de. の 値. Hoon. et. ク ラ ス タ リン グ は.

1リlumina Genome. Anaリyzer. n X(12-45. nt). Total reads. Step 1. 1-1:Sequence. No 》. quality(〉=20),1-2:Read numbers(〉=10). Y. Yes. ▼ Step 2 Read. length:25-45. nt. Yes Step3 No. Not matched to cDNA sequences. γ. >. Yes Step 4 Similarity search. for fRNA. db. v. W Known. ncRNA-like. small RNAs. Other small RNAs. 1ノ. W Expression. 図2・. pattern analysis. 次 世 代 シ ー ケ ンサ ー の デ ー タ解 析 の フ ロー チ ャ ー ト. Step 1ー1に て ク オ リテ ィ ー の 低 い も の(<20),1ー2に. て リー ド数 の 少 な い も の(<10)を. る 配 列 を抽 出 し,Step 2で は25-45 ntの み を 選 別 した.そ る 配 列 を含 む グル ー プ を 除 去 して,残. の後, Step 3で はisoformの. 除去す る ことで信頼 性 の あ グル ー プ 化 とcDNAに. っ た グル ー プ の 代 表 配 列 を そ の 後 の 解 析 に 用 い た.Step. あた. 4で 既 知 のncRNA. に 配 列 が 類 似 し て い る か 否 か に よ っ て 配 列 の 特 徴 を 分 類 し,step 5で は そ れ ぞ れ に お い て リー ド数 を 元 に した 発 現 パ ター ン解 析 を行 っ た.. 16.

2.2遺 伝 子 銃 に よ る遺 伝 子 導 入 法 の 検 討. 2.2.1GFP発. 現 ベ ク タ ー の構 築. ほ 乳 類 細 胞 で の 発 現 ベ ク タ ー で あ るphrGFP 伝 子 をPCRに. て 増 幅 し た.こ. ト とXholサ. vector(Agilent. の 時 に 用 い たForward,. イ トを 含 む よ う に 設 計 し た(表1).そ. Technologies社)を. Reverseプ の 後,. 鋳 型 に, hrGFP遺. ラ イ マ ー は そ れ ぞ れ にEcoRIサ. SUPRECTM-02(TaKaRa社)に. イ. てPCR産. 物 を 精 製 し た. ま た,hrGFPを. 組 み 込 む 発 現 ベ ク タ ー に はpAc5.1/V5-His. ク タ0はDrosophilaの で あ り,プ hrGFP遺. A(lnvitrogen社)を. ア ク チ ン プ ロ モ ー タ ー が 組 み 込 ま れ た,恒. のベ. 常 的 な タ ン パ ク質 発 現 ベ ク タ ー. ロ モ ー タ ー 下 流 に 複 数 の 制 限 酵 素 サ イ トが 存 在 す る. 伝 子 をpAc5.1/v5-His. 産 物 とpAc5.1/V5-His 泳 動 し,目. Aベ. Aベ. ク タ ー に 組 み 込 む た め に,EcoRIとXholに. ク タ ー の 制 限 酵 素 処 理 を 行 っ た.両. サ ン プ ル を1%Agarose. 用 い て ゲ ル か らDNAを. 精 製 し た.次. に,. Ligation. を 構 築 し た.こ のhrGFP発. Biosystems社)に. 養 し た.そ. 精 製 し, ElcoRIとXholを. の 後,QIAprep. に 取 得 す る た め に,hrGFPが ク タ ー を そ れ ぞ れDH5α. MiniPrep. 後 に,遺. 株(TaKaRa社)に. Kit(QIAGEN社)に. 用 い た 制 限 酵 素 処 理 とABI3100. よ る イ ン サ ー ト の 確 認 を 行 っ た.最. column(GE. 組 み 込 ん だ発 現ベ ク ター. 現 ベ ク タ ー を 大 腸 菌 コ ン ピ テ ン トセ ル で あ る,DH5α. ト ラ ン ス フ ォ ー メ ー シ ョ ン し,培. gelで 電 気. Kit Ver.2 solution I(TaKaRa社). と 二 つ の 精 製 産 物 を 混 合 す る こ と で 双 方 を ラ イ ゲ ー シ ョ ン し,hrGFPを. ミ ドDNAを. てhrGFPのPcR. 的 の 産 物 が 含 ま れ る と 予 想 さ れ る バ ン ド を ゲ ル か ら 切 り 出 し てGFX. Healthcare社)を. (QIAGEN社)を. 採 用 し た.こ. DNA. て プ ラ ス. Sequencer(Applied. 伝 子 導入 に用 い るサ ン プル を大 量. 挿 入 さ れ て い る こ と が 確 認 さ れ た プ ラ ス ミ ド とpAc5.1/V5-His 株 に ト ラ ン ス フ ォ ー メ ー シ ョ ン,培. 用 い て 精 製 し た.構. 養 し,. 築 し た ベ ク タ ー の 全 体 図 を 図3に. 17. QIAGEN 示 す.. PIasmid. Aベ Midi. Kit.

表1:hrGFP遺 Forwardプ る.制. 伝 子 増 幅 に 用 い た プ ライ マ ー 配 列. ラ イ マ ー の 太 字 で 記 され た塩 基 はEcoRI,. 限酵 素 認 識 サ イ トよ り下 流 がhrGFP遺. Reverseプ ラ イ マ ー の太 字 部 分 はXhol認. 識 サ イ トを 示 して い. 伝 子 に ア ニ ー ル す る部 位 に 相 当 す る.. プ ライ マ ー の種 類. プ ライマ ー配列. Forward. 5'-CGCGAATTCATGGTGAGCAAGCAGATCCTGAA-3. Reverse. 5'-ATACTCGAGTTACACCCACTCGTGCAGGCTGC-3'. hrGPP. 0 pA. PAC. Ampiclリlt. pUC磁. 図3:hrGFP発 phrGFP. vectorよ. りhrGFP遺. の 上 流 に はDrosophila由. 現 ベ ク タ ー の構 築. 伝 子 を ク ロ ー ニ ン グ し, pAcS.1/V5-xis 来 の ア ク チ ン プ ロ モ ー タ ー が 存 在 す る.. 18. Aベ. ク タ ー と ラ イ ゲ ー シ ョ ン を 行 っ た. hrGFP.

2.2.21)rosophila. S2細. 胞 の 培 養 と継 代. 構 築 し た ベ ク タ ー を 導 入 す る こ と に よ っ てGFP蛍 め に,Drosophila melanogasterの. Schneider. 2(S2)細. 光 を 観 察 す る こ とが で き る の か を 検 証 す る た. 胞(lnvitrogen社)を. 用 い た.. Drosophila. S2細. 胚 の 初 代 培 養 か ら 由 来 し た 培 養 細 胞 株 で あ り(Schneider,1972),. CO2を. 胞 はDrosophila 必 要 と せ ず,. R.T.で 培 養 が 可 能 で あ る. 培 地 はSchneider's Heat-inactivated. Drosophila. Fetal Bovine. Medium(SD. Serum(FBS,. ー 滅 菌 し た も の を使 用 した. medium,. Invitrogen社)を10%FBSに. の 間 隔)で. 継 代 を 行 っ た.継. 物 質 で あ るPenicillin/Streptomycinを. 代 の2回. 全 体 の0.5%に. ウ シ の 血 清 で あ る,. な る よ う に 混 合 し,フ. .液 体 窒 素 下 で 凍 結 し て い たDrosophila. 半 分 程 度 融 解 し た 上 で フ ラ ス コ 中 の 培 地 に 広 げ た.そ ン グ(約2∼3日. Invitrogen社)と. S2細. の 後 は,80%コ 目 以 降 はSD. 胞 は37℃. 染 色 す る こ と で,生. ま でR.T.で. で ラ イ セ ー トを. ン フ ル エ ン トに な る タ イ ミ. medium+10%FBSに. 静菌 性 抗 生. な る よ う に 加 え た 培 地 で 培 養 を 行 っ た.ま. 継 代 時 に は 血 球 計 算 盤 を 用 い て 細 胞 数 を 測 定 し た.こ の 時,細 胞 をTrypan 社)で. ィル タ. 細 胞 の み の カ ウ ン トを 可 能 に し た.細. Blue. た,. Strain O.4%(GIMBO. 胞 数 が0.5∼5.0×106個/m1に. な る. 培 養 を 行 っ た.. 2.2.3Cellfectin試. 薬 を 用 い たDrosophila. S2細. ま ず 始 め に,構 築 し た ベ ク タ ー 由 来 のGFPの II Reagent(lnvitrogen社)を. 胞 へ の トラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 発 現 を-Drosophila. S2細. 用 い た ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン を 行 っ た.. 脂 質 分 子 で,CellfectinとDNAを 取 り込 ま れ や す く な る.ま. 混 合 しDNA脂 た,Cellfectin試. 胞 で 確 認 す る た め,Cellfectin Cellfectin試i薬. は 陽 イオ ン性 の. 質 複 合 体 を 形 成 す る こ と に よ っ てDNAが. 細 胞 へ. 薬 は 昆 虫 細 胞 へ の トラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン に 広 範 的 に 用. い ら れ て い る. 導 入 対 象 で あ るDrosophila 導 入 す る プ ラ ス ミ ドは3.2.1で. S2細. 胞 は3.0×106個/mlに. 構 築 し たGFP発. が 組 み 込 ま れ て い な いpAc5.1/V5-His II Reagentの. プ ロ ト コ ル を 参 照 し,プ. 培 地 に か け,R.T.で5時 培 養 を 続 け た.こ Axiovert. 200に. 現 ベ ク タ ー と,コ ク タ ー を 用 意 し た.ト. ラ ス ミ ド とCellfectinの. 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た.そ. の 時 点 を0時. てGFP蛍. Aベ. 培 養 さ れ た 状 態 で6well. 間 と し て,24時. の 後,. 間,48時. 光 を 観 察 し た.. 19. ン ト ロ ー ル と し てhrGFP遺. medium+10%FBSを. 間,72時. 伝 子. ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン はCellfectin. 混 合 物(DNA脂 SD. plateに 分 注 し た.. 質 複 合 体)を 加 え て,. 間 後 に 細 胞 を50m1と. 静 か に R.T.で っ て,.

2.2.4遺 伝 子 銃 を 用 い たDrosophila. S2細 胞 へ の トラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン. 遺 伝 子 銃 は パ ー デ ィ クル ガ ン と も呼 ば れ,金. 粒 子 の 周 りにDNAコ. ー テ ィン グ したサ ン プル を. ヘ リ ウ ム の 圧 力 を 用 い て 対 象 に 遺 伝 子 を 導 入 す る こ とが で き る 装 置 で あ る.遺 子 導 入 は,エ. レ ク トロ ポ レー シ ョ ン な ど に よ る遺 伝 子 導 入 が 難 しい と され る,植. 入 の 例 が 多 い 一 方 で,動. 物 や 微 生 物 へ の 応 用 も期 待 され て い る.Drosophila. 用 い て 遺 伝 子 導 入 し た 例 は 報 告 さ れ て い な い た め,カ は 遺 伝 子 銃 を 用 い たDrosophila 時 を 同 様 のGFP蛍. ブ トエ ビ を 対 象 と した 実 験 を 行 う前 に ま ず. 同 様 にGFP発. 培 養 さ れ た 状 態 で35 mm. GIE-III(株 式 会 社 タ ナ カ)を 使 用 した(図4).ま. 100%EtOH存. 在 下 で 超 音 波 破 砕 し た も の を 用 意 し,サ M. NaClと 加 え て,打. ム 噴 出 時 間 を0.025,ヘ. 共 に 混 合 した.そ. の 後,20分. ち 込 み 用 のDNA溶. 以 上 氷 冷 し,ス. 間,72時. ピ ン ダ ウ ン して 上 清 を 除 き. 間 後 に 細 胞 を50mlと. 伝 子 銃IDERA. 20. 養. 日 に セ ッ トし た.以 上 の 条 件 で 作 成 したDNA. 蛍 光 を観 察 した.. 図4=遺. mm(BIORAD)は. 伝 子 銃 に よ る遺伝 子 導入 はヘ リウ. medium+10%FBS+05%Penicillin/Streptomycinを. 間 と して,48時. 粒 子1.0. ャ ン バ ー 内 の 減 圧 度 を一82.6kPaに 設 定 し,培. 細 胞 の ま か れ た プ レ ー トを 設 置 す る ス テ ー ジ は4段. の 時 点 を0時. ず,金. 伝. ン プ ル と コ ン ト ロー ル ベ ク タ ー を20%. 液 を 作 成 した.遺. リ ウ ム 圧 を0,343MPa,チ. 溶 液 を 導 入 し,導 入 後 にSD. plateに 分 注 し た,. 現 ベ ク タ ー と コ ン トロ ー ル ベ ク タ ー を 用 い た.遺. 子 銃 はIDERA. た.こ. 胞 に遺伝 子 銃 を. S2細 胞 へ の トラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン に お い て もCellfectin試 薬 利 用. S2細 胞 は3.1×106個/mlに. 導 入 す る プ ラ ス ミ ドは3.2.3と. 100%EtOHを. S2細. 物 へ の遺 伝 子 導. 光 が 観 察 され る か を 検 証 し た.. 導 入 対 象 で あ るDrosophila. PEG6000/2.5. 伝 子 銃 に よ る遺 伝. GIE.--1. 加 え てR.T.で 培 養 し っ て, Axiovert 200に てGFP.

第3章. 3.1情. 結 果 と議 論. 報 学 的 解 析 に よ る 新 規small. RNA候. 補 の抽 出. 3.1.1次 世 代 シ ー ケ ン サ ー に よ っ て 出 力 さ れ た 配 列 情 報 の プ ロ フ ァ イ ル 次 世 代 シ ー ケ ン サ ー に よ っ て 出 力 され た 配 列 は 卵 で 約1,580万 令 は480万. リー ド,3令. る と4,660万 た 後 に,全. は570万. リー ドで あ っ た(表2).ク. リー ド数 に 着 目す る と22塩. の も の が 多 か っ た.22塩. 満,リ. 述 した 通 り,piRNAは. Siomi et al.,2011),近. い る例 が 報 告 され た た め(Yan. の よ うなpiRNAを. 列 種 で は27塩. 基. の 真 核 生 物 と 同 様 に カ ブ トエ ビ に. に,26-27塩. 基 の配 列 は既 知 の 知見 に よ る と. のsmall. RNAが. 体 細 胞 組 織 に お い て も発 現 して 基 の 配 列 中 に もpiRNA. ブ トエ ビ は 環 境 に よ っ て 単 一 生 殖 と 有 性 生 殖 を使 い 分 け て い る た 常 に 興 味 深 い.ま. た,26ー27塩. が 多 い だ け で な く,配 列 種 も 多 く存 在 す る た め(付 録2),piRNAの RNAも. 満 の もの を 除い. 生 殖 細 胞 特 異 的 に 発 現 して い る こ と が 知 られ て. 年, piRNA様. 有 して い る の か,非. 配 列 が 由 来 し て い るsmall. 計す. の ス テ ー ジ で も傾 向 は ほ. et al.,2011),本 解 析 で 対 象 して い る26-27塩. が 存 在 し得 る か も しれ な い.カ. リー ド,2. リー ドで,合. ー ド数 が10未. 基 に ピー ク が 見 られ,配. 画 に 相 当 し,他. 存 在 す る 可 能 性 が あ る.更. 画 に 相 当 す る.前. い る が(M,C.. 基 と26-27塩. は340万. リー ド,成 体 は1,250万. オ リ テ ィ ー が20未. 基 の 配 列 はmiRNA分. お い て も様 々 なmiRNAが. め,ど. は440万. 発 生 段 階 の 配 列 情 報 の 塩 基 長 の 分 布 傾 向 を見 た(付 録2).ど. ぼ 同 じで,全. piRNA分. リー ド,4令. リ0ド,1令. し くはmRNAやncRNAの. 基 の 配 列 は リー ド数. よ うに ク ラ ス タ ー か ら様 々 な. 断 片 が存 在す る こ とに よ って 配 列 種. が バ ラ エ テ ィ ー に 富 ん で い る 可 能 性 が あ る. そ の 後,ス ク リー ニ ン グ の 過 程 を経 て,各 発 生 段 階 に お い て1∼2万 全 ス テ ー ジ で は68,459種 ド数 は 全 体 の17.1%に. の 配 列 に絞 る こ と が で き た(表2).こ. あ た る7,966,706本. と な っ た(表2).こ. 配 列 類 似 性 解 析 と発 現 パ タ ー ン 解 析 を行 っ た.. 21. の 配 列 種 に 絞 る こ とが で き,. れ は 全 体 の0.8%に れ ら を 対 象 と し,既. あ た り,全 知 のncRNAの. リー.

表2:次. A:Number. 世 代 シ ー ケ ン サ ー で 得 ら れ た 配 列 の ス ク リー ニ ン グ に お け る配 列 数. of all reads 1SI instar. Egg. Ali. 15,781,859. 3,420,862. 31d instar. 2°dinstar. 4th insYar. 5,743,096. 4,413,933. Adult. Step 1-1. 15,433,168(97.8%) 3,406,457(99.6%). 4,739,531(99.6%). 5,724,859(99.7%). 4,398,923(99.7%). 12,489,894 12,212,555(97.8%). Step 1-2. 10,064,308(63.8%) 1,818,632(53.2%). 2,652,443(55.7%). 3,495,159(60.9%). 2,579,915(58.4%). 9,040,728(72.4%). Step 2. 6,502,668(41.2%). 1,464.803(42.8%). 1,479,616(31.0%). 2,185,833(38.0%). 1,468,899(33.3%). 5,712,481(45.7%). Step 3. 1,574,140(10.0%). 650,701(19.0%). 693,162(14.6%). 880,046(15.3%). 598,209(13.6%). 1,884,202(15.1%). Total. 4,760,840. 7,966,7Q6(17.1%). B:Number. ofunique. reads. Egg All. lgtinstar. 2na instar. 3婚instar. 3,879,337. i,075,510. 1,420,038. 1,520,162. 4也instar. 1,267,942 1,512',797(99.5%) 1,262,513(99.6%). Adult. 2,179,420 2,059,230(94.5%). Step. 1-1. 3,658,274(94.3%). 1,069,714(49.5%). 1,410,975(99.4%). Step. 1-2. 163,103(4.2%). 36,676(3.4%). 50,400(3.5%). 52,458(3.4%). 39,529(3.1%). 87,348(4.0%). Step. 2. 117,721(3.0%). 32,887(3.1%). 39,031(2.7%). 45,589(3.0%). 31,039(2.4%). 68,603(3.1%). Step. 3. 28,400(0.7%). 13,672(1.3%). 15,433(1.1%). 17,441(1.1%). 11,247(0.9%). 21,435(1.0%). Tc)ta豊. 68,459(d.8%). 22.

3.1.2様. 々 なncRNAの. 断 片 が 存 在 す る可 能 性 と そ の 特 徴. 信 頼 性 の 高 い リ ー ド と し て 抽 出 し た68,459種 ncRNAに. 対 し て ア ラ イ メ ン ト し た.こ. 片 で あ る 可 能 性 の あ るsmall ぶ)と. RNA(以. 見 な し た と こ ろ,2200種. 体 の3.3%に. の 配 列 をfRNAdbに. の 時,85%以 下, ncRNAーlike. が 既 知 のncRNAと. あ た る(図5A).ま. た,リ. 登 録 さ れ て い る 約50万. 本 の. 上 配 列 の 類 似 性 が あ っ た も の をncRNAの. 断. fragmentも. ー ド数 の 総 和 は 全 体 の20.2%を. ア ラ イ メ ン ト さ れ た リ フ ァ レ ン ス 配 列 のRNA種. 本,rRNAが. お よ そ17%の365本,. pre-miRNAが. ncRNAに. 呼. れ は全. 占 め て い た(図5B).更. に,. を 分 類 し た 結 果,tRNAが26%の575. お よ そ3%の58本. あ るpiRNAは. sma11 RNAと. 類 似 性 の あ る 配 列 と し て 分 類 さ れ た.こ. small RNAが. 分 画 に 含 ま れ る 代 表 的 なRNAで. し く はncRNA-1ike. 約1%の19本. で あ っ た.ま. で あ り,全. た,25-45塩. 基 の. 体 の 半 数 は そ の 他 のlong. あ た る も の だ っ た(図5C).. ス ク リ ー ニ ン グ に よ っ て 抽 出 さ れ た 配 列 の う ち,ncRNAに か っ た が(図5B),そ. 類 似 性 の あ っ たsmall. の 中 に は 比 較 的 リ ー ド数 が 高 い も の が 存 在 し て い た.こ. テ ー ジ で の 正 規 化 さ れ た リ ー ド数 が 高 い も の50種 で あ っ た(表3).tRNAは. は 少 な. れ らの 中 か ら全 ス. と ん ど がtRNA-like. タ ン パ ク 質 合 成 に 必 要 な 分 子 で あ る た め,生. も 非 常 に 存 在 量 が 多 く,そ. fragment. 体 内 のtotal RNAの. 中で. の た め に 分 解 産 物 も 大 量 に 存 在 す る と 考 え ら れ る.rRNAもtRNAと. じ よ う に 翻 訳 系 に 必 須 の 分 子 で あ る た め,存 ビ の5.8S,18S,28S. を 抽 出 す る と,ほ. RNA. rRNAに. 在 量 が 多 い.し. 同. か し 本 解 析 で は ヨ ー ロ ッ パ カ ブ トエ. マ ッ プ さ れ る リ ー ド を 除 去 し て い る た め に(図2,. step 3),5S. rRNA. の 断 片 候 補 が 抽 出 さ れ た も の だ と 考 え ら れ る. ま た,そ. の 他 に もpreーmiRNAの. 存 在 が 確 認 さ れ た(表3).こ. pre-miR-96にi類. 似 し て い るtcf--66825やBombyx. pre-〃2'R-2630に. 類 似 し て い るtcf--1726が. たmiR-96やmiR-263aの3'末 カ ブ トエ ビsmall (図5D),こ. 端 に3∼4塩. RNAの. れ ら はmature. moril,. Daphnia. Duplex,. 基 が 付 加 さ れ た 配 列 で あ り,更. 塩 基 長 の 分 布 を 見 て み て み る と25塩 miRNAのisofo㎜. とi類似 し て い た カ ブ トエ ビsmall RNAの. 保 存 さ れ て い る も の の,配 piRNAに. で あ る 可 能 性 が 高 い. miRNA中. 既 知 のsmall. RNAの. melanogasterの. RNAはmiRNAのisofb㎜ 中 でpiRNAに. にpre-miRNAに. miRNA配. でmature. 類 似 し たsmall. も そ も ほ 乳 類 で はpiRNAが. 列 は種 間 で高 く保 存. miRNAの. 領 域 を含 む 配 列. RNA(既. 知 の 知 見 に よ るpiRNAの. small RNAと. 呼 ぶ)は19本. piRNAは. et al.,2006),. っ て カ ブ トエ ビ のpiRNA-like. 本 研 究 の 対 象 と し た25-45塩. 代 表 格 と し て 今 後 着 目 し て い き た い と 考 え て い る.. 23. と非. 生 成 され る ク ラ ス タ ー が 生 物 種 間 で. 列 ご と の 保 存 性 は 低 い こ と が 報 告 さ れ て お り(Girard. あ る か は 未 知 で あ る が,. 類 似 した. で あ る と 考 え ら れ る.. 類 似 し た 配 列 が 少 な か っ た 原 因 の 一 つ と 考 え ら れ る.よ. fragmentがpiRNAで. Drosophila. scapularisの. 基 長 の も の が 非 常 に 多 い こ とか ら. 塩 基 長 を 考 慮 す る と 分 解 産 物 で あ る 可 能 性 は 低 い の でpiRNA-like 常 に 数 が 少 な か っ た(図5B).そ. Ixodes. リ ー ド数 の 多 い 配 列 と し て 含 ま れ て い た.こ れ ら は 成 熟 し. さ れ て い る こ と が 知 ら れ て い る こ と か ら もprecursor. 一 方 で カ ブ トエ ビsmall. の 中 に は,. 基 に含 ま れ る.

近 年 の 研 究 成 果 で は,遺. 伝 子 発 現 制 御 を 行 うsmall. RNAはmiRN『Aの. よ うにprimary. miRNA. (pri-miRNA)と. して 転 写 され た 後 に プ ロセ ッ シ ン グ の 過 程 を 経 て 機 能 す る も の ば か り で な く,成. 熟 したncRNAか. ら切 り 出 され て 生 成 され る も の が 多 数 存 在 す る こ とが 報 告 され て お り(Ender. al.,2008;Rother にtRNA. and Meister,2011),. fragmentに. ncRNAの. 断 片 の 生 成 過 程 や そ の 機 能 性 は 非 常 に 興 味 深 い.特. 関 す る 情 報 は 近 年 次 々 に 明 ら か と な っ て い る.tRNAは. ら ア ン チ コ ドンル ー プ で 切 断 さ れ や す く,更 ン ル ー プ が 切 断 が 促 進 され,5'tRNA て い る(D,M.. Thompson. で あ るelF4Gに. に,ス. そ の三 次構 造 の特 徴 か. ト レ ス 環 境 下 で はmature. fragmentと3'tRNA. and Parker,2009).そ. い う リボ ヌ ク レ ア ー ゼ がtRNAを. 基 のtRNA. ア ンチ コ ド. の 他 に も ス ト レス 環 境 下 で 活 性 化 す るAngiogeninと. 分 断 化 し,生. 成 され た5'tRNA. fragmentはmature. tRNAの5'末. か ら生 成 さ れ て 機 能 し て い る こ とが 報 告 され て い る(Y.S. 塩 基 程 度 のfragmentは. tRNAの. fragmentが 生 成 さ れ や す い こ とが 知 ら れ. fragmentが. 作 用 す る こ と に よ り翻 訳 制 御 を 行 っ て い る こ とや(lvanov. に 関 与 す る19-22塩. et. 端3'末. を 受 け て 生 成 され る 可 能 性 も示 唆 され て い る が(Sobala. et al.,2011),細. 胞 増殖. 端 や, pre-tRNAの3'末. Lee et al.,2009).ま. 一 度 ア ン チ コ ドン部 分 で 切 断 され た 後 に, Dル. キ ャ ップ結 合複 合 体. た, tRNA由. ー プ やTル. and Hutvagner,2011),既. 端. 来 の20. ー プで 再度 切 断 知 の 機 能 性tRNA. fragmentの 一 般 的 な 傾 向 は 明 らか に な っ て い な い. 本 研 究 に お い て 発 見 さ れ たtRNA-like tRNA-like. fragmentはpreーmiRNA-like. され て い る傾 向 は 見 られ ず,様 は 一 見,丘aglnentの. fragmentの. fragmentの. 6).こ. よ うに 特 定 の 塩 基 長 のsmall RNAが. れ. 一 般 的 傾 向 が 明 らか と な っ て い な い と い う既 知 の 知 見 と合 致 す る 結 果 の よ う. tRNAの5'末. fragmentが. ア ライ メ ン ト され た 部 位 を 調 べ て み る. 端 か ら 由 来 し た 可 能 性 の あ るsmall. RNAが. 最 も 多 い こ とが わ か っ た(図. れ は 構 造 面 か らす る と最 も切 断 さ れ や す い ア ン チ コ ドン ル ー プ で 切 断 さ れ た 断 片 が 意 外 に. も 少 な い と い う興 味 深 い 結 果 で あ り,こ れ に 関 して は3っ ひ とっ は,"生. の 側 面 か ら考 察 す る こ とが 可 能 で あ る.. 体 内 で は 実 際 に ア ン チ コ ドン で 切 断 され る 断 片 が 多 い が,次. 世代 シー ケ ンサ ー の 配. 列 解 析 に は 本 来 の 様 相 が 反 映 され て い な い 可 能 性 が あ る"と い う観 点 で あ る リtRNAは 様 々 な 修 飾 を 受 け る こ と が 知 られ て い る た め に 断 片 化 さ れ たtRNAも 想 され る.も に く い,も れ る.2つ. 生体内で. そ の修飾 が 残 っ て い る と予. し も ア ン チ コ ドン で 切 断 され た 断 片 や3'末 端 か ら 由 来 した 断 片 が ク ロ ー ニ ン グ さ れ し く は シ0ケ. 目 は,"tRNA. ン ス され に く い 特 徴 を 有 し て い る な ら,そ fragmentはmature. tRNAの. 性 か ら見 た 側 面 で あ る.既. 知 の 知 見 で はtRNA. 究 で 発 見 され たtRNA-like. fragmentも5'末. の は 他 に 比 べ て 多 い が(図6),塩 tRNAは. ず. ア ライ メ ン ト. 々 な 塩 基 長 の 断 片 が 存 在 して い る こ とが わ か っ た(図5D).こ. に 感 じ られ る が,一 方 で カ ブ トエ ビ のtRNA-like と,mature. 特 徴 に つ い て も 解 析 し て み る と,ま. れ に 起 因 した 結 果 だ と 考 え ら. 様 々 な 部 位 か ら切 り取 られ て い る"と い う可 能. fragmentの. 塩 基 長 や 切 断 部 位 は様 々 で あ り,本 研. 端 か らD-stemとAnticodon-stemの. 基 長 の 特 徴 は な か っ た(図6D).こ. 部 分 で切 断 され る も. れ ら を ふ ま え る と, mature. ア ン チ コ ドン部 分 で 切 断 され や す い と して も,そ の 後 に 再 度 プ ロセ ッ シ ン グ され て 短 い 断. 24.

片 が 生 成 され て い る 可 能 性 が あ る.短. い 断 片 が 生 成 され る 意 義 と して 機 能 性sma11. 関 与 して い る な ら ば 非 常 に 面 白 く,5'末. に3'末 端 にCCAが. 在 して い な い.本. 核 生 物 に お け るtRNAの3'末. 核 生 物 で はpre-tRNAか tRNAが. tRNAの3'末. して い る が,カ. RNAが. 存 在 す る 可 能 性 が あ る.よ. っ て,そ. 端 に あ た るCCAは. 伝 子 の3'末 端 に もCCAは ブ トエ ビsmall RNAの3'末. ア ラ イ メ ン トされ な い こ と に よ っ て 類 似 率 が 低 下 しtRNA-like. か っ たsmall. 端 へ のCCAの. ら リー ダ ー 配 列 が 切 断 され た 後. 登 録 され て い る 真 核 生 物 のtRNA遺. 解 析 で は 類 似 性 の 評 価 を85%と. 生成. 生 成 され る こ と が 知 られ て い る(Sobala. れ ゆ え に真 核 生 物 の ゲ ノ ム 中 に はmature. コ ー ド され て お らず ,fRNAdbに. CCAが. 後 に,"真. 付 加 す る こ と に よ っ てmature. and Hutvagner,2011).そ. 生成が. 端 か ら 由 来 した と考 え られ る カ ブ トエ ビfragmentが. され る生 物 学 的 意 味 の 解 明 も 望 ま れ る.最 付 加 を考 慮 す る必 要 性"が 挙 げ られ る.真. RNAの. fragmentと. 存 端の. して抽 出 され な. の 点 を 考 慮 し て 解 析 を行 う こ と でtRNA. の 切 断 に つ い て よ り深 い 議 論 を 行 う こ とが 今 後 の 課 題 で あ る. 以 上 の よ うにncRNAと. 類 似 した 配 列 中 に はncRNAの. も短 いsmall RNAのisoformが. 断 片 とmiRNAに. 代 表 さ れ る25塩. 存 在 して い る 可 能 性 が あ る こ と が わ か り,更 にtRNAと. 列 に 関 して は そ の ア ラ イ メ ン ト部 位 か ら複 雑 な 生 成 過 程 が 考 察 され た.tRNA 様 々 な 生 物 種 に お い てrRNA(D. 認 され て お り(Smalheiser. M. Thompson. et al.,2011),本. and Parker,2009)やsnoRNA由. 特 にncRNAの small RNAは. RNAに. し て25-30塩. fragmentの. 基 長 のsma11 RNAと. 能 性small. RNA候. 来 の断 片 の存 在 も確 れ らの知. 類 似 して い る カ ブ トエ ビ. 候 補 と し て,他 種 のtRNA,. し て 代 表 的 なpiRINAにi類. 焦 点 を絞 っ て 発 現 パ タ ー ン の 解 析 を 行 うこ と と し た.ま. た 通 り,プ ロ セ ッ シ ン グ過 程 で 生 成 さ れ た1niRNAのisofb㎜ め,機. 外 にも. か ら 由 来 し た 可 能 性 が 高 い こ と が 予 想 され る.そ こ で 本. 研 究 で は 発 生 時 期 特 異 的 に 働 く機 能 性ncRNA-like 類 似 し たsmall RNA,そ. fragment以. fragmentに 着 目す る 意 義 は 大 き い と 考 え られ,. 中 で も 種 間 で 配 列 が 高 く保 存 され て い るtRNAやrRNAと ア ライ メ ン ト され たRNA種. 類似 した配. 研 究 に お い て も そ の 候 補 配 列 が 見 つ か っ た.こ. 見 か ら,カ ブ トエ ビ に お い て 発 見 され たncRNA-like. 基 より. 補 か ら は 除 外 した.. 25. た, pre-miRNA類. rRNAに. 似 したsmall 似 配列 は前 述 し. を 含 む 可 能 性 が 高 い と 考 え られ る た.

Matched. A. to other species. Matched. B. ncRNA(3.2%). /-. to other species. ncRNA(20.2%). D. C. length. distribution. 0.700. く》rRNA. OtRNA OpiRNA. Opre-miRNA Ono match. OsnRNA. a°o.szs yam w O.350 0C 響0I175. ＼ 翫. snoRNA(0.4%). 図5=他 既 知 のncRNAと. に はfRNAdbに. 韻欝 ・. w. LL. 0. b. 1 .6一. 4. 252627282930313233343536373839404142434445 Length(nt). 種 で 同 定 さ れ たncRNAと. 種 のncRNAと. § .. pre miRNA(2.6%). 類 似 性 の 高 いsmall. 配 列 の 類 似 性 が あ っ た カ ブ トエ ビsmall RNAの. 円 グ ラ フ で 表 した.C:他. m. 数(A)と. RNAの. プロファイル. そ の リー ド数(B)が. 類 似 性 が あ っ た カ ブ トエ ビsmall RNAのRNAの. 登 録 され て い るIong ncRNA等. さ と存 在 量 の 分 布 を表 し た.存 在 量 は 各RNA種. が 含 ま れ て い る すD:RNAの. 26. 種 類 に よ る 分 類."others". タ イ プ別 に カ ブ トエ ビsmall RNAの. ご と に発 見 され たsma11 RNAの. ッ ト した.. 全体 に示す 割合 を. 長. 総 数 に よっ て 正 規 化 し た値 を プ ロ.

3: ifRil4). ea. tcf-slsgl ref-8iso ref-886g ref-gs2i tef-882s tcf-slsg2 ref-gs68 ref-igss ref-g2io ref-4li2 ref-slsgs ref-gs6o ref-8ii6 tcf-igs2 rcf-8824 ref-sio66 ref-6682s. ref-8o26 tcf-42828 tef--g2go tcf-sg2s6 ref-sisi ref-8o2i ref-g42g ref-8is2 tcf-6682 ref-igoo ref-8864 ref-sg22 ref-6io6 rcf-gs6i tef--gi6g ref 1726 ref-gs66 ref-886s. Ut:NO(10E. TEttll. -. all RN. I. tef-sls6s ref-8ioi ref-8io6 rcf-86sg tcf-866o tcf-sioio tcf-g26g ref-86gl ref-422i tcf-866l tcf-8i8g tcf-g6i8 tef-slsgo tef-8isl ref-s82i4. ncRNA. rat_Eft. so. en. CI. RN. Kl. lm. TCCGGTATGGTCTAGTGGTTAGGATA 26 tRNA Eucarya (Arthopoda) GCATCGATTCAGTGGTAGAATGCfCGCCTGC 34 tRNA Eucarya (Nematoda, Arthopoda) GCATCGATGGTTCAGTGGTAGAATGCTCGCCT 32 tRNA Eucarya (Nematoda, Arthopoda) GCACGTGTAGTTCAATGGTAGAAITCT 27 tRN Eucary(Chordeta) GCACGTGTAGTTCAATGGTAGAATTCTCG 29 tRNA Eucarya (Chordeta) TCCCATATTGTCIAGTGGTIAGGATATC 28 tRNA Eucarya (Arthopoda) GGCICGTTGGTCTAGGGGTATGATT 25 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordata) GCAGTCGTGGCCGAGTGGTTAAGGC 25 tRNA Eucarya,(Arthopoda , Chordata) CACGCGGGAGACCGGGGTTCGATTCCCCGTCGGGGAGCCA 40 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordata) GCACGTGTAGTTCAATGGTAGAATTCTCGCITCCC 35 tRNA Eucarya (Chordata) GCCTGGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATGAGACTC 34 tRNA Eucarya (Chordata) GTCACGCGGGAGACCGGGGTTCGATTCCCCGTCGGGGAGCCA 42 tRNA Eucarya (Artllopoda , Chordata) TCCTCGATAGTATAGTGGTGAGTATCCC 28 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordata) GCCCGGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATGAGACTC 34 tRNA Eucarya (Arthopoda, Chordata) TTCGTCGAGACATTCTTCTATCAACTT 27 groupI intr on Eucarya (Magnoliophyta) TCCTCGATAGTATAGTGGTGAGTATCCCC 29 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordata) GCCCGGCTAGCTCAGTCGGTAGAGCATGAG 30 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordata) GCGGGAGACCGGGGTTCGATTCCCCGTCGGGGAGCCA 37 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordate) GGTTCTATGGTGTAATGGTTAGCACTCTG 29 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordata) GCGATGGTGGTATAGTGGTTAGCATGGATG 30 tRNA Eucarya (Chordata) TCCTCGATAGTATAGTGGTGAGTATCCCCGCC 32 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordata) GGGGGTGTAGCTCAAATGGTAGAGC 25 tRNA Eucarya (Arthopoda , Magnoliophyta) GACGAGGTGGCCGAGTGGTTAAGGCTTTGGATTGC35 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordata) GGCTCGTTGGTCTAGGGGTATGATTCTC 28 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordata) CACCCAGGAGGCTCGGGTTCGATTCCCGGTATGGGAACCA 40 tRNA Eucarya (Arthopoda) TCCTCGATAGTATAGTGGTGAGTATCCCCGCCT 33 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordata) GGGGCTGTAGCTCAGCIGGTTAGAGCACC 29 tRNA Bacteria, Eukarya (Euglenozoa) GCCGTGATCGTCTAGTGGTTAGGACCCT 28 tRNA Eucarya (Arthopoda) GACGAGGTGGCCGAGTGGTTAAGGCTITGGATT 33 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordata) GCGATGGTGGTATAGTGGTTAGCATGGA 28 tRNA Eucarya (Chordata) TCCCTGATAGCTCAGTCGGTAGAGCGACGGACT 33 tRNA Bacteria TTTGGCACTAGCACATTTTTGTGTT 25 Eucarya (Chordata) pre-miRNA GACTGCGGATCAGAAGATTCCAGGTTCGGCTCCTGGCAGG 40 tRNA Eucarya (Arthopoda , Chordata) TGATATCITCGAACGCAAGGGTTCTG 26 tRNA Eucarya (Aacomycota) GGCTTGTTAGCICAGTTGGTAGAGCITCGTGC 32 Eucarya (Chlorophyta) pre-miRNA TGAACACAGCrGGTGGTATCTCAGT 25 miRNA Eucarya (Arthopoda) ATTGAGGGCGTGGGTTCATATCCCACTTCr 30 tRNA Eucarya (Chordata, Magnoliophyta, Marchantiophyta) GACTGCGGATCAGAAGATTCCAGGZTCGGCTCCTGGCAGGC 41 tRNA Eucarya (Chordata) GGTCCCATGGTGTAATGGTTAGCACTTTG 29 tRNA Eucarya (Chordata) GCCCGGTTAGCTCAGTCGGTAGAGC 25 tRNA Eucarya (Nematoda, Chordata) CGTGATCGTCTAGTGGTTAGGACCCr 26 tRNA Eucarya (Arthopoda) GACCGTGTGGCCTAATGGATAAGGCTTCG 29 tRNA Eucarya (Arthopoda) GCGGCTGTAGCTCAGCTGGATAGAGTACITGGC 33 tRNA Bacteria CGATAGAGGGCGTGGGTTCATATCCCACTTCT 32 tRNA Eucarya (Magnoliophyta) CGCGGGCGGCCCGGGTTCGTTTCCCGGTCGAT 32 tRNA Eucarya (Nematoda) GGGGGTATAGCTCAGTGGTAGAGCATTCGACTGC 34 IRNA Eucarye (Nematoda, Arthopoda , Chordata) GTGATCGTCTAGTGGTTAGGACCCT 25 maturetranscript Eucarya (Arthopoda) AATGGCACIGGAAGAATTCACGGGT 25 Eucarya (Arthopoda) pre-miRNA GGGGGTATAGCTCAGTGGTAGAGCATTCGACTG 33 tRNA Eucarya (Nematoda, Arthopoda , Chordata) GCGGCTGTAGCTCAGCTGGATAGAGTACTTGGCT 34 tRNA Bacteria. 27. ty. 16. aura». 96.15. 168290. 06. 88.89 89.66 100.00 100.00 100.00 90.00 88.57 100.00 99.48 96.43 100.00. 90299 100255 130909 157860 152657 46271 35830 30338 40725 24723 15969 40150 32295. 0.033794 0.014814 0.014240 0,013872 0.012940 0.012423 0.010793 0.007272 0.007057 0.004675 0.004238 0.004085 0.003465 0.003381. 85.19 96.55 100.00. 13225 31433 14446. 0.002825 0.002772 0.002691. 89.19 100.00. 31740 11544. 0.002636 0.002409. 90.00 96.88. 15227 17584 8292. 0.002238 0.002014 0.001745. 7279 8243. 0.001732 0.001646. 90.00 96.97. 6769 15292. 0.001613 0.001446. 96.55 100.00. 19313 10489. 0.001284 0.001177. 93.94 92.59. 5630 9358. 100.00 92.00 95.00. 13312 4460 3545. 0.001140 0.001058 0.001026. 88.00 87.50 100.00. 3986 4916 5321. 86.67 95.12. 4089 2755. 0.000876 0.0008509 0.000803. 96.55 100.00 100.00. 4016 4125 8304. 0.000763 0.000746 0.000717. 96.55 96.97 93.75. 3744 9217 2476. 0.000681 0.000605 0.000581. 96.88 97.06. 2285 2352. 0.000561 0.000499. 100.00 100.00 96.97. 2849 2271 2422. 0.000492 0.000443 0.000436. 97.06. 5765. 0.000462. 96.00 94.29 100.00. 0.001010 0.000916 0.000892 0.000890.

3. A. 山00P. D-l. tRNA. B 5,. D.loop. -. gene. At-Ioop. T-IooP. 3, #of sequences. Anticodon. 180. 906991. 94 12. 248039 110937 12044. 29 12 7. A:tRNAの. fragmentが. 971. 9 9. 91 247 1201. 8 a. 514 6793. 3 3. 123 75. 4 15. 658 38885. 23. 4355 2137. 16 75 63. 図6:￠RNA-□ike. #of reads. 14570 46666. ア ラ イ メ ン トされ た 部位 とそ の 数. 二 次 構 造 と各 ス テ ム ル ー プ の 名 称 を ま と め た. B:上. 部 にmature. tRNAが. 部 位 とア ン チ コ ドン 部 位 を 一 次 配 列 の模 式 と し て表 し た.下 部 にsmall RNAが. 二 次構 造 を と っ た 際 の ル ー プ. ア ライ メ ン トされ た パ タ ー ン を 線. に て 表 し,右 に ア ライ メ ン ト され た 配 列 数 とそ の リー ド数 の合 計 値 を 記 した 。 全 て の パ ター ン の 中 か ら,最 も リ ー ド数 が 多 い も の を 赤 ,2番. 目 を 青,3番. 目 を黄 緑 で 表 現 した.な お,図. た 部 位 の み を 表 記 して い る.. 28. に は2本 以 上 の配 列 が ア ラ イ メ ン トさ れ.