Seisaibo keiko imejingu ni yoru ERK MAPK kasseika dotai no 1saibo teiryo keisoku

Title Sub Title Author Publisher Publication year Jtitle Abstract Notes Genre URL. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org). 生細胞蛍光イメージングによるERK MAPK活性化動態の1細胞定量計測 新土, 優樹(Shindo, Yuki) 慶應義塾大学湘南藤沢学会 2013 生命と情報 No.20 (2013. ) ,p.57- 61 慶應義塾大学湘南藤沢キャンパス先端生命科学研究会 2013年度学生論文集 修士論文ダイジェスト Technical Report http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=KO92001004-00000020 -0057.

修 士 論 文 ダ イ ジ ェ ス ト 2013年 度 （ 平 成 25年 度 ） 生細胞蛍光イメージングによるERK MAPK活性化動態の1細胞定量計測 政 策 •メディア 研 究 科 修 士 課 程 2 年 新 土 優 樹. 57.

1 . 序論 M APK. (m ito g e n -a ctiva te d. protein k i n a s e ; 分 裂 促 進 因 子 活 性 イ 匕 タ ン パ ク 質 キ ナ ー ゼ ； M A P キ ナ ー. ゼ ） は 酵 母 か ら 哺 乳 類 ま で 高 度 に 保 存 さ れ た セ リ ン /ス レ オ ニ ン キ ナ ー ゼ で あ り ， 増 殖 や 分 化 ， ア ポ ト ー シ ス な ど の 細 胞 運 命 決 定 を 制 御 し て い る （ Q i and E lio n , 2 0 05 ) . 哺 乳 類 細 胞 に お い て は ， これ ま で に E R K 1 / 2 , J N K , p 38, E R K 3 / 4 , E R K 5 の 5 種 類 の M A P K フ ァ ミ リ ー が 同 定 さ れ て い る （ R o u x and B le n is, 2 0 0 4 ) . そ の 中 で も 最 も 有 名 な の は E R K (extracellular signal-regulated k in a s e ) 1/2で あ り ， 古 典. 的 M A P K と も 呼 ば れ て い る （ C h a n g and K a r in ，2 0 01 ) . E R K M A P K カ ス ケ ー ド は R a f iT V E K / E R K か ら な り， 増 殖 因 子 や サ イ ト 力 イ ン ， ホ ル ボ ー ル エ ス テ ル 等 に よ っ て 活 性 化 が 誘 導 さ れ る . EGF. (e p id e rm a l. g ro w th. f a c t o r ;上 皮 成 長 因 子 ） 刺 激 に 対 す る E R K の 応 答 は 特 に よ く 調 べ ら れ て お. り， シ ス テ ム 生 物 学 に お け る モ デ ル シ ス テ ム と し て も し ば し ば 用 い ら れ る . E G F の 結 合 に よ っ て E G F R が 活 性 化 さ れ る と ， ア ダ プ タ ー タ ン パ ク 質 で あ る G rb 2 ，. G T P 交 換 促 進 因 子 で あ る Sosとの相互. 作 用 を 介 し ， Rasが 活 性 化 さ れ る . Rasの 活 性 化 に よ り R a fは 細 胞 膜 へ と 局 在 変 化 し て 活 性 化 さ れ ， R a f/M E K /E R K の カ ス ケ ー ド が 順 に 活 性 化 さ れ る .活 性 化 さ れ た E R K は 細 胞 質 か ら 核 へ と 局 在 変 化. し， 転 写 因 子 を は じ め と す る 核 内 の タ ン パ ク 質 を リ ン 酸 化 す る こ と で 細 胞 増 殖 に 導 く. （以 降 ， 上. 記 の 経 路 を E G F -E R K 経 路 と 表 記 す る ） .. X 洲 o /m oocytesに お い て は ， ERK の リ ン 酸 化 は 入 力 シ グ ナ ル の 上 昇 に 対 し て switch-like に 起 こ る こ と が 知 ら れ て い る （図 1 ) . こ の 非 線 形 性 を 生 み 出 す メ カ ニ ズ ム の 1つ は 2 重 リ ン 酸 化 ;モ チ ー フ で あり， 2 回 の リ ン 酸 化 反 応 が 独 立 （ distributive) に 起 こ る こ と に 起 因 す る （ Ferrell Jr. and Bhatt, 1997;. Huang and Ferrell, 1 9 9 6 ) . さ ら に ，. oocytesの 場 合 は ， ERK か ら MAPKKK へ の ポ ジ テ ィ ブ フ. ィ ー ド バ ッ ク が 存 在 す る こ と で ， そ の 応 答 は 非 常 に 急 峻 な も の と な っ て い る . ER K は 増 殖 や 分 化 ， 発 生 と い っ た 一 般 的 に 不 可 逆 な 過 程 を 制 御 し て い る こ と か ら ， そ の 応 答 性 が switch-like で あ る と い う事実は合目的的であると考えられる. 他 方 ， 免 疫 染 色 や F A C S に よ る 定 量 解 析 の 結 果 か ら ， 酵 母 や 哺 乳 類 細 胞 に お い て は ， E R K のリン 酸 化 が 入 力 シ グ ナ ル に 対 し て g ra d e d に 起 こ る こ と が 報 告 さ れ て い る （ C o lm a n -L e m e r e? a/.， 2 0 0 5; M a c K e ig a n. a/., 2 0 0 5 ; W h it e h u r s t 以 a/.，2 0 0 4 ) .. E R K の2重 リ ン 酸 化 モ チ ー フ は 哺 乳 類 細 胞 で も 保 存. さ れ て い る こ と か ら ， E R K の リ ン 酸 化 ;が s w it c h -lik e で は な く g ra d e d に 起 こ る こ と は 必 ず し も 自 明 で は な い .実 際 の と こ ろ ， 足 場 タ ン パ ク 質 （ s c a f f o ld )や 細 胞 内 の 分 子 混 雑 の 影 響 な ど が 示 唆 さ れ て いるが， そのメカニズムは現在でも完全には明らかになっていない（ A o k i が 况 ，2 0 1 1 ,2 0 1 3 ). と こ ろ で ， ERK は 細 胞 増 殖 や 分 化 と い っ た 細 胞 運 命 決 定 の 制 御 を 担 う 分 子 で あ り ， そ の 情 報 は 最 終 的 に は 0 か 1の 情 報 に 変 換 さ れ る 必 要 が あ る と 考 え ら れ る . す な わ ち ， gradedな ERK の リ ン 酸 化 も， そ の 下 流 の い ず れ か で switch-like な シ グ ナ ル に 変 換 さ れ る 必 要 が あ る と 考 え ら れ る . し か し な が ら ， 実 際 に そ の よ う な メ カ ニ ズ ム が 存 在 す る の か は 明 ら か に な っ て い な い .そ こ で 本 研 究 で は ， ERK の リ ン 酸 化 ; 後 に 起 こ る 核 へ の 局 在 変 化 に 着 目 し ， そ の ダ ^ ナ ミ ク ス を 生 細 胞 蛍 光 イ メ ー ジ ン グ に よ り 1細 胞 レ ベ ル で 計 測 し た .. 58.

Switch-like response. Graded response. Xenopus oocytes, In Vitro. Yeast, Mammalian cells. Inpyt. Input. 図 1 : E R K の2 重 リ ン 酸 化 の 入 力 シ グ ナ ル へ の依存性 及 /?〇/?奶oocytesや w v / 加 に お い て は ， E R K のリン酸化が入力シグナルに対して switch-like に起こる . 一方，酵 母 や 哺 乳 類 細 胞 に お い て は ， E R K のリン酸化は入力シグナルの上昇に graded に依存する .. 2•結果と議論 3 .2 .1. E G F P -E R K 2 の 生 細 胞 蛍 光 イ メ ー ジ ン グ. 生 き た 細 胞 内 に お け る E R K の 動 態 を 観 察 す る た め に ， E R K 2 にE G F P を 融 合 さ せ た タ ン パ ク 質 (E G F P -E R K 2 )を 用 い た .. また，核 マ ー カ ー と し て TagR FP を 融 合 さ せ た ヒ ス ト ン H 2 B を用 い ， こ. れ ら を 安 定 発 現 す る P C 1 2 細 胞 を 使 用 し て 実 験 を 行 な っ た . P C 1 2 は ラ ッ ト の 副 腎 髄 質 （ a d re n a l m e d u lla )由 来 の 褐 色 細 胞 腫 （ P h e o c h ro m o c y to m a )で あ り ， E R K を 介 し た 細 胞 運 命 決 定 研 究 の モ デ. ルとして用いられてきた実績がある（ G re e n e a n d T is c h le r, 1976; V a u d r y 扣 《/.，2 0 0 2 ). ま ず 始 め に ， ウ ヱ ス タ ン プ ロ ッ テ イ ン グ に よ り 内 在 性 E R K とE G F P - E R K 2 の 発 現 量 比 を 見 積 も っ た.. こ れ は ， E R K の 過 剰 発 現 は 細 胞 内 局 在 を 変 化 さ せ る こ と が 知 ら れ て お り （ B u ra ck. and. Shaw ,. 2 0 0 5; F u k u d a 以 虬 ，1 9 9 7 ) ， 導 入 し た E G F P - E R K 2 の 発 現 量 が 内 在 性 E R K に 比 べ て 十 分 に 低 い こ と を. 確 認 す る 必 要 が あ る た め で あ る . 発 現 量 比 を 見 積 も っ た 結 果 ， E G F P -E R K 2 の 発 現 量 は 内 在 性 E R K の 1 0 % 未 満 で あ っ た （図 2 B ) .. 内 在 性 E R K の 発 現 量 は 約 1 u M で あ る こ と か ら （ F u jio k a. 2 0 0 6 ) ， E G F P - E R K 2 の 発 現 量 は 100 n M 未 満 で あ る と 見 積 も ら れ る .. d. a/.,. これは， 導 入 し た E R K の発現量. が 150 n M 程 度 以 下 で あ れ ば ， 本 来 の 細 胞 内 動 態 に ほ と ん ど 影 響 を 与 え な い と い う 報 告 の 範 囲 内 で ある（ C o s t a W f l/ ., 2 0 0 6 ) . 以 上 よ り ， E G F P - E R K 2 の 発 現 が 生 細 胞 に お け る E R K の 動 態 を 乱 す 可 能 性 は低いと結論付けた. 次 に ， E G F 刺 激 に 対 す る E R K の 核 移 行 応 答 を 調 べ る た め に ， 0 .0 00 5 -5 0 n g / m l の E G F で 細 胞 に 刺 激 を 与 え ， E G F P - E R K 2 の 核 移 行 夕 V ナ ミ ク ス を イ メ ー ジ ン グ し た . E G F 濃 度 は ， 50 ， 5 , 1 , 0. 5,. 0.1,. 0.08, 0.06, 0 .05, 0.04, 0 .0 3 , 0.01, 0.005, 0 .0005, 0 n g/m l の 14条 件 で 実 験 を 行 な っ た . 核 マ ー カ ー で あ る T a g R F P -H 2 B の 画 像 か ら 各 細 胞 の 核 領 域 を 決 定 し ， 核 内 に お け る E G F P - E R K 2 の 平 均 笛 光 強 度 を 1細. 胞 レ ベ ル で 定 量 化 し た . 核 内 に お け る E G F P -E R K 2 の 蛍 光 強 度 値 は ， E G F 刺 激 前 の 値 で 規 格 化 し た (C o h e n -S a id o n e W / . ，2 0 0 9 ) . 各 E G F 濃 度 条 件 に お い て 最 低 170 個 以 上 ， 14 条 件 合 計 で 3 ,2 73 個 の 細 胞 に. お け る 核 内 E G F P -E R K 2 の 時 系 列 デ 一 夕 を 取 得 し た .. 59.

A. 図 2 : E G F P -E R K 2 の 観 察 に 使 用 し た P C12 細胞 E G F P -E R K 2 とT a g R F P -H 2 B を 安 定 発現する P C 12細 胞 . （ B ) ウヱ スタンプロッテイングによるE G F P -E R K 2. (A ). と内在性 E R K の 発 現 量 比 の 見 積 も り .. 0 min. 8 min. 2 0 min. 図 3 : E G F P -E R K 2 の生細胞 笛 光 イ メ ー ジ ン グ E G F P -E R K 2 を 安 定 発 現 す る P C12 細 胞 を 50 ng/mlのE G F で刺 激 し ， E G F P -E R K 2 の細胞内局在を共焦点レーガ. 一 顕 微 鏡 に よ り 可 視 化 計 測 し た . E G F 刺 激 によ っ て E G F P -E R K 2 が 細 胞 質 か ら 核 へ と 局 在 変 化 す る 様 子 が 1相 胞 レベルで捉 え ら れ て い る . 3.2.2. ER K の 核 移 行 応 答. 論文投稿準備中のため省略.. 3• 蠢 論 論文投稿準備中のため省略.. 4.. 対象と手法. 省 略 .詳 細 は 修 士 論 文 を 参 照 さ れ た い .. 60.

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