BAB I
REKOMBINASI DNA
REKOMBINASI DNA
REKOMBINASI DNA
REKOMBINASI DNA
Teknologi DNA rekombinanTeknik DNA rekombinan adalah rekayasa genetika untuk menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom. Teknik DNA rekombinan merupakan kumpulan bertujuan untuk merekombinasi gen dalam tabung reaksi. Teknik DNA rekombinan meliputi isolasi DNA, teknik memotong DNA, teknik menggbung DNA dan teknik untuk memasukan DNA ke dalam sel hidup. Teknologi DNA rekombinan atau sering disebut juga rekayasa genetika ini adalah suatu ilmu yang mempelajari pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya terjadinya integrasi dan mengalami perbanyakan dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Manfaat rekayasa genetika ini diantaranya adalah dimungkinkannya melakukan isolasi dan mempelajari fungsi masing-masing gen dan mekanisme kontrolnya. Selain itu, rekayasa genetika juga memungkinkan diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional. Sejak jaman dahulu, nenek moyang kita telah mengetahui adanya keanekaragaman makhluk hidup. Keanekaragaman makhluk hidup ini memungkinkan manusia untuk memilih jenis makhluk hidup yang dikehendakinya. Salah satu upaya nenek moyang kita dalam memilih jenis makhluk hidup yang unggul adalah dengan breeding atau mengawinkan beberapa spesies unggul untuk didapatkan keturunan yang unggul pula dan memiliki sifat dari kedua induknya. Dengan semakin berkembangnya ilmu genetika dan ditemukannya gen, maka manusia pun memiliki alternatif lain yang lebih efektif yaitu melalui teknik rekayasa genetika (Genetic Engineering) dengan cara melakukan perubahan langsung pada DNA. Salah satu upaya yang dilakukan adalah dengan DNA rekombinan. Teknik DNA rekombinan adalah suatu teknik di dalam rekayasa genetika untuk
menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom. Teknik DNA rekombinan merupakan kumpulan teknik untuk merekombinasi gen dalam tabung reaksi. Teknik itu diantaranya isolasi DNA, teknik memotong DNA, teknik menggbung DNA dan teknik untuk memasukan DNA ke dalam sel hidup. Setelah DNA rekombinan terbentuk maka dilakukan proses transformasi ke host cell kemudian dilkakukan proses inkubasi sel bakteri tersebut. Setelah dilakukan inkubasi maka sel bakteri dapat diuji kehadiran DNA rekombinannya yaitu melalui uji antibiotik, uji medium seleksi dan seleksi putih biru. Setelah didapatkan bakteri dengan DNA rekombinan maka dilakukan purifikasi untuk mengisolasi gen yang direplikasi.
Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk. Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional. Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik atau kromosom yang akan
diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.
Dasar teknologi DNA rekombinan
Bakteri memiliki mekanisme seksual yang telah dibuktikan pada tahun 1946. Konsekwensi dari mekanisme seksual adalah: 1. Menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari
dua sel yang berbeda
2. Terjadi pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel yang lain. Mekanisme seksual ini tidak bersifat reproduktif atau tidak menghasilkan keturunan
Gambar 1. Hasil Penelitian Lederberg dan Tatum
Transfer DNA atau perpindahan DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara, yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinan. Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakteri lainnya (sel resepien) melalui kontak fisik antara kedua sel. Sel donor memasukkan sebagian DNA-nya ke dalam sel resepien. Transfer DNA ini melalui pili seks yang dimiliki oleh sel donor. Sel resepien tidak memiliki pili seks. DNA dari sel resepie berpindah ke sel resipien secara replikatif sehingga setelah proses ini selesai, sel jantan
tidak kehilangan DNA. Ke dua sel tidak mengalami peningkatan jumlah sel dan tidak dihasilkan sel anak. Oleh karena itu, proses konjugasi disebut juga sebagai proses atau mekanisme seksual yang tidak reproduktif.
Gambar 2. Proses konjugasi
Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri yang lain atau organisme yang lain. Masuknya DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami. Pada tahun 1928 ditemukan strain bakteri yang tidak virulen dapat berubah sifatnya menjadi virulen disebabkan adanya strain yang tidak virulen dicampur dengan sel-sel bakteri strain virulen yang telah dimatikan. Tahun 1944 ditemukan bahwa perubahan sifat atau transformasi dari bakteri yang tidak virulen menjadi virulen disebabkan oleh adanya DNA dari sel bakteri strain virulen yang masuk ke dalam bakteri strain yang tidak virulen.
Gambar 4. Proses transformasi
Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantaraan bakteriofage. Beberapa jenis virus berkembang biak di dalam sel bakteri. Virus-virus yang inangnya adalah bakteri sering disebut bakteriofag atau fage. Ketika virus menginfeksi bakteri, fage memasukkan DNA-nya ke dalam sel bakteri. DNA tersebut kemudian akan bereplikasi di dalam sel bakteri atau berintegrasi dengan kromosom baketri. DNA fage yang dikemas ketika membentuk partikel fage baru akan membawa sebagian DNA bakteri yang menjadi inangnya. Selanjutnya jika fage tersebut menginfeksi bakteri yang lain, maka fage akan memasukkan DNA-nya yang sebagian mengandung DNA sel inang sebelumDNA-nya. Jadi, secara alami fage memindahkan DNA dari satu sle bakteri ke bakteri yang lain.
Gambar 6. Proses transduksi pada sel bakteri Perangkat teknologi DNA rekombinan
Adapun perangkat yang digunakan dalam teknik DNA rekombinan diantaranya enzim restriksi untuk memotong DNA, enzim ligase untuk menyambung DNA dan vektor untuk menyambung dan mengklonkan gen di dalam sel hidup, transposon sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan penanda, pustaka genom untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan, enzim transkripsi balik untuk membuat DNA berdasarkan RNA, pelacak DNA atau RNA untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang
benar. Vektor yang sering digunakan diantarnya plasmid, kosmid dan bakteriofag.
Gambar 7. Plasmid bakteri sebagai vektor
Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Enzim restriksi mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya empat sampai enam pasang basa. Enzim tersebut dikenal dengan nama enzim endonuklease restriksi. Berikut ini adalah macam-macam enzim endonuklease restriksi.
Tabel 1. Enzim restriksi yang sering digunakan pada proses rekombinasi DNA
Enzyme Source Recognition
Sequence Cut
EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC 3'CTTAAG 5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5'
EcoRII Escherichia coli 5'CCWGG 3'GGWCC 5'--- CCWGG---3' 3'---GGWCC ---5'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC 3'CCTAGG 5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5' HindIII Haemophilus influenzae 5'AAGCTT 3'TTCGAA 5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5' TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA 3'AGCT 5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5'
NotI Nocardia otitidis 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG 5'---GC GGCCGC---3' 3'---CGCCGG CG---5' HinfI Haemophilus influenzae 5'GANTCA 3'CTNAGT 5'---G ANTC---3' 3'---CTNA G---5' Sau3A Staphylococcus aureus 5'GATC 3'CTAG 5'--- GATC---3' 3'---CTAG ---5'
PovII* Proteus vulgaris 5'CAGCTG 3'GTCGAC 5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5'
SmaI* Serratia marcescens 5'CCCGGG 3'GGGCCC 5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5'
HaeIII* Haemophilus aegyptius 5'GGCC 3'CCGG 5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5' HgaI[33] Haemophilus gallinarum 5'GACGC 3'CTGCG 5'---NN NN---3' 3'---NN NN---5' AluI* Arthrobacter luteus 5'AGCT 3'TCGA 5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5'
EcoRV* Escherichia coli 5'GATATC 3'CTATAG 5'---GAT ATC---3' 3'---CTA TAG---5'
EcoP15I Escherichia coli 5'CAGCAGN25NN 3'GTCGTCN25NN
5'-CAGCAGN25NN ---3'
3'---GTCGTCN25 NN---5'
KpnI[34] Klebsiella pneumoniae 5'GGTACC 3'CCATGG
5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5' PstI[34] Providencia stuartii 5'CTGCAG
3'GACGTC 5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5' SacI[34] Streptomyces achromogenes 5'GAGCTC 3'CTCGAG 5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5' SalI[34] Streptomyces albus 5'GTCGAC
3'CAGCTG 5'---G TCGAC---3' 3'---CAGCT G---5' ScaI[34] Streptomyces caespitosus 5'AGTACT 3'TCATGA 5'---AGT ACT---3' 3'---TCA TGA---5'
SpeI Sphaerotilus natans 5'ACTAGT 3'TGATCA 5'---A CTAGT---3' 3'---TGATC A---5' SphI[34] Streptomyces phaeochromogenes 5'GCATGC 3'CGTACG 5'---G CATGC---3' 3'---CGTAC G---5' StuI[35][36] Streptomyces tubercidicus 5'AGGCCT 3'TCCGGA 5'---AGG CCT---3' 3'---TCC GGA---5' XbaI[34] Xanthomonas badrii 5'TCTAGA
3'AGATCT
5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5' Ada beberapa bagian terpenting yang selalu digunakan dalam rekayasa genetika.Yang pertama adalah enzim seluler dan yang kedua adalah vektor. Hal tersebut akan dibahas sebagai berikut:
Enzim seluler
Enzim yang dipakai oleh orang-orang bioteknologi dalam memanipulasi DNA diantaranya adalah enzim Endonuklease, yaitu enzim yang mengenali batas-batas sekuen nukleotida spesifik dan berfungsi dalam proses restriction atau pemotongan bahan-bahan genetik. Penggunaan enzim ini yang paling umum antara lain pada sekuen palindromik. Enzim ini dibentuk dari bakteri yang dibuat sedemikian rupa sehingga dapat menahan penyusupan DNA, seperti genom bacteriophage.Ada juga DNA polimerisasi, yaitu enzim yang biasa dipakai untuk meng-copy DNA. Enzim ini mengsintesis DNA dari sel induknya dan membentuk DNA yang sama persis ke sel induk barunya. Enzim ini juga bisa didapatkan dari berbagai jenis organisme, yang tidak mengherankan, karena semua organisme pasti harus meng-copy DNA mereka. Selain DNA polimerisasi, ada juga enzim RNA polimerisasi yang berfungsi untuk ’membaca’ sekuen DNA dan mengsintesis molekul RNA komplementer. Seperti halnya DNA polimerisasi, RNA polimerisasi juga banyak ditemukan di banyak organisme karena semua organisme harus ’merekam’ gennya.Selanjutnya yang akan dibahas adalah enzim DNA ligase. Enzim DNA ligase merupakan suatu enzim yang berfungsi untuk menyambungkan suatu bahan genetik dengan bahan genetik yang lain. Contohnya saja, enzim DNA ligase ini dapat bergabung dengan DNA (atau RNA) dan membentuk ikatan phosphodiester baru antara
DNA (atau RNA) yang satu dengan lainnya.Kemudian, ada pula enzim reverse transcriptases yang berfungsi membentuk blue-print dari molekul RNA membentuk cDNA (DNA komplementer). Enzim ini dibuat dari virus RNA yang mengubah genom RNA virus menjadi DNA ketika virus menginfeksi inangnya. Enzim ini biasa dipakai ketika bertemu dengan gen eukariotik yang biasanya terpisah-pisah menjadi potongan kecil dan dipisahkan oleh introns dalam kromosom.
Vektor natural
Sebagai salah satu cara untuk memanipulasi DNA di luar sel, para ilmuwan dalam bioteknologi harus bisa membuat suatu tempat yang keadaannya stabil dan cocok dengan tempat DNA yang dimanipulasi. Sekali lagi, alam telah memberikan solusi dari masalah ini. Vektor disini bisa diartikan sebagai alat yang membawa DNA ke dalam sel induk barunya. Agar suatu metode dalam rekayasa genetika dianggap berhasil, di dalam vektor, DNA hasil rekombinan seharusnya benar-benar hanya dibawa setelah sebelumnya DNA rekombinan digabungkan dengan DNA vektor melalui enzim ligase. Namun di dalam vektor, DNA rekombinan tidak termutasi lagi membentuk DNA dengan sifat baru. Contoh dari vektor natural dari alam adalah plasmid dan virus atau bacteriophage.
Manfaat teknologi rekombinan DNA
Aplikasi teknik DNA rekombinan dalam bioteknologi diantaranya adalah produksi vaksin, insulin, antibodi dan sebagainya. Misalkan saja insulin yang digunakan untuk mengatasi diabetes diproduksi dengan menggunakan teknik DNA rekombinan. Gen insulin yang berasal dari sapi kemudian ditentukan urutan DNA-nya setelah itu direkombinasikan di dalam suatu vektor misal plasmid kemudian dimasukan dalam sel bakteri. Selanjutnya bakteri ini mengalami transformasi dan bisa menghasilkan insulin. Ini adalah salah satu contoh aplikasi teknik DNA rekombinan dalam bioteknologi. Beberapa produk DNA rekombinan yang digunakan dalam terapi manusia, diantaranya :
Insulin untuk penderita diabetes
Faktor IX untuk hemofilia b
Hormon pertumbuhan manusia (hgh)
Erythropoietin (epo) untuk mengobati anemia Beberapa jenis interferon
Beberapa interleukin
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (gm-csf) untuk menstimulasi sumsum tulang setelah transplantasi sumsum tulang
Granulocyte koloni-stimulating factor (g-csf) untuk merangsang neutrofil produksi, misalnya, setelah kemoterapi dan untuk memobilisasi sel induk hematopoietik dari sumsum tulang ke dalam darah.
Aktivator plasminogen jaringan (tpa) untuk melarutkan gumpalan darah
Adenosin deaminase (ada) untuk mengobati beberapa bentuk severe combined immunodeficiency (scid)
Hormon paratiroid
Beberapa antibodi monoklonal
Antigen permukaan hepatitis B untuk vaksinasi terhadap virus hepatitis B
C1 inhibitor (c1inh) digunakan untuk mengobati edema angioneurotic turun-temurun.
Gambar 8. Pembuatan Tanaman Transgenik dengan teknik rekombinasi DNA
Rekombinasi terjadi akibat adanya perubahan susunan basa nitrogen dan sifat yang dibawa oleh suatu individu, berbeda dari sifat parentalnya. Rekombinan terjadi secara alami, baik melalui induksi, transformasi, konjugasi, maupun akibat dari adanya suatu crossing over saat meiosis. Rekombinasi DNA dapat terjadi baik secara alami maupun buatan oleh manusia. Rekombinasi terjadi sebagai suatu bentuk untuk bertahan dan beradaptasi terhadap perubahan yang terjadi. Pada tahun 1962 berhasil diisolasi genom bakteriofage dari plasmid sel bakteri. Genom bakteriofag ini menyebabkan terjadinya rekombinasi DNA bakteri. Rekombinasi DNA bakteri terjadi melalui 3 mekanisme yang berbeda, yaitu adanya transduksi, transformasi, dan konjugasi. Berikut merupaan meknisme terjadinya rekombinasi pada bakteri.
Gambar 9. Bakteriofag mengakibatkan terjadinya rekombinasi pada bakteri
melalui mekanisme transduksi
Gambar 10. Rekombinasi yang terjadi diakibatkan oleh induksi materi genetik
Transduksi merupakan suatu bentuk rekombinasi yang disebabkan adanya induksi dari bakteriofage. DNA virus menempel pada plasmid bakteri ketika bakteriofag menginfeksi bakteri. Bakteriofag memiliki suatu mekanisme tersebdiri untuk membuka pita DNA bakteri. Bakteriofag memiliki enzim yang mirip dengan DNA polimmerase I dan helikase sehingga pita DNA membuka dan DNA bakteri dapat disisipi dengan DNA bakteriofag. DNA akan mengalami ligasi yang dibantu oleh enzim ligase. Bakteriofag meyisipkan DNAnya secaran langsung ke dalam DNA atau plasmid bakteri dengan tyujuan agar semua kinerja dan protein yang dihasilkan oleh sel bakteri dapat dikontrol secara langsung untuk membentuk dan merakit bakteriofag. DNA atau plasmid dari bakteri akan dipotongmenggunakan enzim restriksi endonuklease sehingga menjadi potongan kecil dan digunakan untuk membentuk materi genetik bakteriofag. Ketika perakitan bakteiofag selesai, bakteriofag akan keluar dari bkteri dan sel bankteri akan mengalami lisis. Materi genetik yang terdapat dalam kapsid bakteriofag terdir dari materi genetik bakteri dan bakteriofag. Ketika bakteriofag menginfeksi bakteri lainnya. Akan terjadi penyisipan materi genetik dari bakteriofag ke dalam materi genetik bakteri. Transduksi ini menyebabkan terjadinya rekombinasi DNA yang terjadi karena vektor dari bakteriofag atau virus dan menyebabkan bakteri memiliki gen yang berasal dari bakteri lainnya.
Gambar 12. Percobaan tentang transformasi
Transformasi DNA telah lama diketahui. Percobaan tentang transformasi pertamakali dilakukan oleh Griffith. Percobaan ini mrnggunakan bakteri strain S dan strain R. bakteri strain S merupakan bakteri virulen yang dapat mengakibatkan kematian pada hewan coba. Bakteri strain R merupakan bakteri nonvirulen yang tidak mengakibatkan kematian pada hewan coba yang diinjeksi dengan bakteri ini. Percobaan ini dilakukan dengan membunuh bakteri strain S dengan merebusnya, dan kemudian diinjeksikan pada mencit. Mencit yang diinjeksi dengan bakteri strain S yang telah dibunuh tersebut tidak mati dan tidak mengalami suatu kelainan. Kemudian, bakteri strain S yang telah direbus tersebut dicampurkan dengan bakteri strai R yng masih hiidup dan diinjeksikan ke mencit. Mencit tersebut mati. Berdasarkan hasil percobaan tersebut, memunculkan suatu pertanyaan besar, mengapa mencit yang diinjeksi dengan mencampurkan bakteri stain S yang telah dibunuh dengan cara dipanaskan dan bakteri strain R mati, padahal bakteri strain R bersifat nonvirulen. Berdasarkan percobaan tersebut diketahui bahwa terjadi rekombinasi DNA. Rekombinasi tersebut diakibatkan adanya trasnformasi. Sel yang terpapar oleh meteri genetik akan dengan mudah mengambil materi genetiok tersebut dari lingkungannya. Materi genetik yang berasal dari lingkungan akan berikatan dengan materi genetik dari sel yang mengakibatkan sel memiliki suatu sifat yang berbeda dari sifat sebelumnya. Penambahan materi genetik ini
mempengaruhi eksprtesi gen dan protein yang dibentu oleh sel. Trnasformasi sangat lazim terjadi. Pene;iti yang bekerja dengan DNA maupun RNA dari makhluk lainnya harus berhati-hati karena materi genetik tersebut dapat dengan mudah masuk ke dalam sel dan menempel pada materi genetik yang terdapat dalam sel.
Gambar 13. Konjugasi
Konjugasi merupakan suatu cara alami untuk mentrasfer materi genetik antar bakteri. Ketika suatu bakteri telah kehabisan energi untuk melakukan pembelahan. Konjugasi sep[erti gambar 5 dilakukan oleh 2 jenis bakteri yang berbeda. Bakteri 1 memiliki plasmid yang mengandung faktor R sehingga resistan terhadap antibiotik. Sedangkan bakteri 2 memiliki plasmid tetapi tidak memiliki faktor R sehingga peka terhadap antibiotik. Konjugasi merupakan peristiwa pengiriman atau membagi materi genetik yang dilakukan dengan menggunakan Sex filli. Plasmid mengalami replikasi dan ditrnasfer menuju vakteri lainnya melalui sex filli. Setelah selesai, bakteri 2 akan memiliki gen yang mengandung faktor R sehingga bersifat resisten terhadap antibiotik. Terdapat beberapa uji yang dilakukan untuk mengetahui terjadinya rekombinan atu tidak. Analisis yang sering dilakukan adalah dengan elektroforesis dan PCR.
Gambar 14. Metode elektroforesis
Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasarkan laju perpindahan melewati gel dengan dipengaruhi oleh medan listrik. Pada asam nukleat, laju perpindahan molekul berbanding terbalik dengan ukuran molekulnya. Semakin besar molekul, maka semakin lambat laju perpindahannya dan jarak yang mampu ditempuh akan semakin pendek. Elektroforesis ini bisa digunakan untuk menentukan basa nitrogen yang menyusun DNA dan dapaty digunakan untuk membuat DNA sequencing.
Gambar 15. Metode PCR
PCR dilakukan untuk menentukan susunan nitrogen yang menyusun DNA. PCR dilakukan dengan mengisolasi DNA dari organisme dan dirunning untuk menentukan basa nitrogen yang menysunnya dengan menggunakan computer. Metode yng digunakan dalam PCR meliputi denaturasi, anneling, dan expanding.
Gambar 16. Transformasi gen diperantarai plasmid Cara pembuatan insulin secara Rekombinan
a. Ekstraksi mRNA dari sample pankreas manusia. Gunakan pelarut untuk melepaskan protein tanpa mempengaruhi DNA /RNA Sebagian mRNA manusia mempunyai ekor yang terdiri dari basa adenin yang berpasangan dengan timin dan sitosin dengan guanin.
b. Hal ini mendesak mRNA untuk bergeser ke arah bead (affinity
chromatography). Sebagian besar DNA dan non-mRNA tidak
dapat melekat pada bead dan keduanya terpisah dari mRNA c. Plasmid disisipkan ke bakteri secara transformasi sehingga
banyak salinan plasmid yang akan dibuat.biasanya setiap bakteri memilki satu plasmid. Khususnya Escherichia coli, bakteri usus sebagai ’pekerja’. Bakteri rekombinan yang baru memiliki gen yang baru. DNA mengkode sebuah protein yang menginstruksi bakteri untuk membuat mRNA baru yang membuat protein baru. Tujuannya untuk menciptakan bakteri yang menghasilkan insulin bagi manusia.
d. Karena sejumlah mRNA telah diekstraksi, maka terdapat gen aktif pankreas. Untuk menemukan bakteri rekombinan spesifik dengan insulin sebagai target spesifik, kita
membutuhkan ‘peta’ . Pada proses ini, perlu dibedakan baik sekuen insulin DNA ataupun protein insulin. Sel yang dapat mengekspresikan insulin dengan benar diidentifikasi. Kemudian dapat berkembang dalam jumlah banyak dalam media yang dibuat dalam asam amino, vitamin dan gula.sehingga insulin dalam jumlah banyak dapat diproduksi dengan cepat (bakteri menggandakan diri setiap 40 menit). Pecahkan sel, kemudian murnikan insulin dari protein bakteri dengan kromatografi.
e. Kemas insulin murni, lalu simpan di vial atau injeksi. Rekombinasi membutuhkan enzim spesifik
Proses identifikasi dan memahami enzim-enzim tersebut ditunjukan oleh E. coli. Enzim rekombinasi penting dikode oleh gen recA, B, C, dan D dan oleh gen ruvC. Gen rec B, C, dan D mengkode enzim RecBCD yang dapat menginisiasi rekombinan dengan melepaskan DNA. Protein RecA mempromosikan semua tahapan sentral pada proses: pemasangan dua DNA, formasi Holliday intermediate, dan cabang imigrasi seperti yang dijelaskan berikut. Nukleus tersebut sering disebut resolvases; resolvase E. coli merupakan protein RuvC. Enzim RecBCD berikatan dengan DNA linear pada salah satu ujung dan menggunakan energi ATP untuk berpindah sepanjang helix, melepaskan DNA didepan dan melepaskannya kembali dibelakang. Pelepasan kembali lebih lambat dari pelepasan sehingga gelembung strand tunggal segera terbentuk dan membesar. Strand tunggal dalam gelembung segera dipotong saat enzim bertemu susunan tertentu yang disebut chi ((5’)GCTGGTGG(3’). Ada sekitar 1000 dari sususan tersebut pada genom E. coli, dan berpengaruh meningkatkan frekuensi rekombinasi pada daerah dimana rekombinasi itu terjadi. Susunan yang meningkatkan frekuensi rekombinasi diidentifikasi pada beberapa organisme.
Protein RecA tidak biasa telibat dalam metabolism DNA karena bentuk aktif enzim ini merupakan perintah, filament helix yang memasang secara kooperatif pada DNA dan mampu melibatkan monomer RecA. Formasi filament ini secara normal terjadi pada DNA strand tunggal seperti yang diproduksi oleh enzim RecBCD. Filamen juga akan terbentuk pada DNA duplex dengan gap strand
tunggal, dimana monomer RecA berikataan pertama kali dengan DNA strand tunggal dalam gap dan kemudian kumpulan filament menyelimuti dupleks tetangganya. Paradigma in vitro yang berguna untuk aktivitas rekombinasi filament RecA adalah reaksi yang disebut pertukaran DNA strand. DNA dalam filament dibentangkan dengan DNA duplex kedua, dan strand ditukar antar dua DNA untuk membentuk heteroduplex DNA. Pertukaran yang terjadi antara tingkatan 3 samapi 6 pasangan basa dan berkembang menjadi arah yang unik, 5’_3’ yang berkaitan dengan DNA strand tunggal didalam filament. Reaksi ini dapat melibatkan tiga sampai empat strand, dan pada kasus berikutnya struktur Holliday merupakan intermediate dalam proses. Ketika intermediate Holliday terbentuk, enzim yang terlibat dalam melengkapi rekombinasi termasuk topoisomerase, resolvase, dan nuclease yang lain, DNA polymerase I atau III, dan DNA ligase. Protein RuvC (Mr20.000) pada E. coli menyayat intermediate Holliday banyak detail dari reaksi ini yang dilaksanakan oleh enzim rekombinasi dan koordinasi dari enzim ini belum banyak diketahui. Contoh enzim restriksi endonuklease yang biasa digunakan dalam DNA rekombinan ditunjukkan oleh tabel 1.Teknologi DNA rekombinan meliputi beberapa teknik, yaitu:
1. Teknik untuk mengisolasi DNA 2. Teknik untuk memotong DNA
3. Teknik untuk nggabungkan atau menyambungkan DNA
4. Teknik untuk memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel hidup sehingga DNA rekombinan tersebut dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan dalam sel bakteri lainnya atau sel resipien melalui kontak fisik antara dua sel.
Isolasi DNA
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel
mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk
covalently
closed circular
(CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom. Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.Enzim Restriksi
Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid. Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda (l). Virus l digunakan untuk menginfeksi dua strain E. coli, yakni strain K dan C. Jika l yang telah
menginfeksi strain C diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi strain C, maka akan diperoleh l progeni (keturunan) yang lebih kurang sama banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini, dikatakan bahwa
efficiency of plating (EOP) dari strain C ke strain C adalah 1. Namun,
jika l yang diisolasi dari strain C digunakan untuk menginfeksi strain K, maka nilai EOP-nya hanya 10-4. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak 1/10.000 kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang diisolasi dari strain K mempunyai nilai EOP sebesar 1, baik ketika direinfeksikan pada strain K maupun pada strain C. Hal ini terjadi karena adanya sistem restriksi atau modifikasi (r/m) pada strain K. Pada waktu bakteriofag l yang diisolasi dari strain C diinfeksikan ke strain K, molekul DNAnya dirusak oleh enzim endonuklease restriksi yang terdapat di dalam strain K. Di sisi lain, untuk mencegah agar enzim ini tidak merusak DNAnya sendiri, strain K juga mempunyai sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi beberapa basa pada sejumlah urutan tertentu yang merupakan tempat-tempat pengenalan (recognition sites) bagi enzim restriksi tersebut. DNA bakteriofag l yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi pada siklus infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh kekebalan terhadap enzim restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak diwariskan dan harus dibuat pada setiap akhir putaran replikasi DNA. Dengan demikian, bakteriofag l yang diinfeksikan dari strain K ke strain C dan dikembalikan lagi ke strain K akan menjadi rentan terhadap enzim restriksi. Metilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA.Berlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi hingga molekul DNA baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh enzim restriksi. Enzim restriksi dari strain K telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya, enzim ini dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi tipe I. Banyak enzim serupa yang ditemukan kemudian pada berbagai spesies bakteri lainnya. Pada tahun 1970 ditemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. Ia mengisolasi enzim tersebut dari bakteri Haemophilus influenzae strain Rd, dan sejak saat itu ditemukan lebih dari 475 enzim restriksi tipe II dari berbagai spesies
dan strain bakteri. Semuanya sekarang telah menjadi salah satu komponen utama dalam tata kerja rekayasa genetika. Enzim restriksi tipe II antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut:
1. Mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA
2. Memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat pengenalannya
3. Menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.
Sebagian besar enzim restriksi tipe II akan mengenali dan memotong urutan pengenal yang mempunyai sumbu simetri rotasi. Pemberian nama kepada enzim restriksi mengikuti aturan sebagai berikut. Huruf pertama adalah huruf pertama nama genus bakteri sumber isolasi enzim, sedangkan huruf kedua dan ketiga masing-masing adalah huruf pertama dan kedua nama petunjuk spesies bakteri sumber tersebut. Huruf-huruf tambahan, jika ada, berasal dari nama strain bakteri, dan angka romawi digunakan untuk membedakan enzim yang berbeda tetapi diisolasi dari spesies yang sama.
Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa pasang basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung runcing sering pula disebut sebagai ujung lengket
(sticky end) atau ujung kohesif. Hal itu berbeda dengan enzim restriksi
seperti Hae III, yang mempunyai tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Fragmen-fragmen DNA dengan ujung tumpul (blunt end) akan sulit untuk disambungkan. Biasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.
Ligasi molekul DNA
Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier. Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara yang pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase. Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam). Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’ seperti telah disebutkan di atas.
Transformasi Sel Inang
Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan teknik elektroforesis (lihat Bab X). Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan. Teknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh M. Mandel dan A. Higa, yang melakukan transformasi bakteri E. coli. Sebelumnya, transformasi pada beberapa spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem transformasi alami seperti Bacillus subtilis telah dapat dilakukan. Kemampuan transformasi B. subtilis pada waktu itu telah dimanfaatkan untuk mengubah strain-strain auksotrof (tidak dapat tumbuh pada medium minimal) menjadi prototrof (dapat tumbuh pada medium minimal) dengan menggunakan preparasi DNA genomik utuh. Baru beberapa waktu kemudian transformasi dilakukan menggunakan perantara vektor, yang selanjutnya juga dikembangkan pada transformasi E.coli. Hal terpenting yang ditemukan oleh Mandel dan Higa adalah perlakuan kalsium klorid (CaCl2) yang memungkinkan sel-sel E. coli untuk mengambil DNA dari bakteriofag l. Pada tahun 1972 S.N. Cohen dan kawan-kawannya menemukan bahwa sel-sel yang diperlakukan dengan CaCl2 dapat juga mengambil DNA plasmid. Frekuensi transformasi tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan DNA dicampur di dalam larutan CaCl2 pada suhu 0 hingga 5ºC. Perlakuan kejut panas antara 37 dan 45ºC selama lebih kurang satu menit yang diberikan setelah pencampuran DNA dengan larutan CaCl2 tersebut dapat meningkatkan frekuensi transformasi tetapi tidak terlalu esensial. Molekul DNA berukuran besar lebih rendah efisiensi transformasinya daripada molekul DNA kecil. Mekanisme transformasi belum sepenuhnya dapat dijelaskan.
Namun, setidak-tidaknya transformasi melibatkan tahap-tahap berikut ini. Molekul CaCl2 akan menyebabkan sel-sel bakteri membengkak dan membentuk sferoplas yang kehilangan protein periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi bocor. DNA yang ditambahkan ke dalam campuran ini akan membentuk kompleks resisten DNase dengan ion-ion Ca2+ yang terikat pada permukaan sel. Kompleks ini kemudian diambil oleh sel selama perlakuan kejut panas diberikan. Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan
Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain
reaction (PCR). Penjelasan lebih rinci tentang teknik PCR dapat dilihat
pada Bab XII. Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni (lihat Bab X). Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya, dilakukan
fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan.
Gambar 17. Teknik rekombinan DNA
Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan merupakan suatu upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel lain atau lebih dikenal dengan kloning gen, sehingga dalam hal ini terjadi pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan menyisipkan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Dalam hal ini perlu dilakukan beberapa teknik yaitu teknik isolasi DNA, teknik pemutusan DNA dengan menggunakan enzim retriksi endonuklease, teknik penyambungan DNA dan teknik pemasukan DNA ke dalam sel lain. Dalam penggunaan DNA rekombinan ini memungkinkan didapatkannya produk dengan gen tertentu dalam waktu yang lebih cepat dan dalam jumlah yang besar daripada perlakuan secara konvensional.
Dalam perlakuan dengan menggunakan DNA rekombinan ini dilakukan beberapa tahapan yang tercakup semua teknik di atas: 1. Isolasi DNA yang diawali dengan melakukan perusakan serta
penghilangan dinding sel. Dalam proses ini dapat dilakukan secara mekanis ataupun dengan cara enzimatis. Setelah perusakan sel telah dilakukan, langkah selanjutnya adalah pelisisan sel hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan buffer nonosmotik, serta deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Remukan sel yang diakibatkan oleh lisisnya sel dibuang dengan melakukan sentrifugasi sehingga bisa dibedakan antara bagian yang rusak serta organel target. Yang pada akhirnya didapatlkan DNA yang nantinya dilakukan pemurnian dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. Teknik isolasi DNA ini dapat diaplikasikan untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular sedangkan DNA kromosom ikatan antara kedua untaiannya lebih longgar. Hal ini akan menyebabkan DNA plasmid lebih rentan terhadap terjadinya denaturasi protein apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid. Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda. Virus l digunakan untuk menginfeksi dua strain E. coli, yakni strain K dan C. Jika l yang telah menginfeksi strain C diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi strain C, maka akan diperoleh l progeni (keturunan) yang lebih kurang sama banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini, dikatakan bahwa efficiency of plating (EOP) dari strain C ke strain C adalah 1. Namun, jika l yang diisolasi dari strain C digunakan untuk menginfeksi strain K, maka nilai EOP-nya hanya 10-4. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak 1/10.000 kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang diisolasi dari strain K mempunyai nilai EOP sebesar 1, baik ketika direinfeksikan pada strain K maupun pada strain C. Hal ini terjadi karena adanya sistem restriksi/modifikasi (r/m) pada strain K.
2. Selanjutnya adalah pemotongan DNA dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease. Pemutusan ini dilakukan di dalam strain tertentu yang bertujuan untuk mencegah agar tidak merusak DNA. Selain itu strain tersebut juga mempunyai suatu sistem modifikasi yang menyebabkan pemutusan basa pada urutan tertentu yang merupakan recognition sites bagi enzim restriksi tersebut. Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor dengan menggunakan enzim restriksi ini harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel dalam arti setiap fragmen DNAnya harus dapat disambungkan dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.
3. Tahap penyambungan DNA terdapat beberapa cara, yaitu penyambungan dengan menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri, penyambungan dengan menggunakan DNA ligase dari sel
E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau sering disebut dengan enzim T4 ligase. Serta dengan pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase. Aktiviotas enzim ini berada pada suhu 37 ºC. namun, proses penyambungan biasa dilakukan pada suhu 4 dan 15ºC.
4. Tahap berikutnya adalah analisa terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA dengan menggunakan teknik elektroforesis. Hasil dari penyambungan ini dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dalam hal ini pada campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi. Sehingga diharapkan sel inang mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.
5. Tahap selanjutnya adalah seleksi transforman dan seleksi rekombinan. Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal,sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti
ligasi gagal, dan sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan atau tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction .
Gambar 18. Teknik Rekombinasi DNA
Rekombinasi memiliki tiga mekanisme dasar dalam menjalani prosesnya. Yaitu transformasi, konjugasi dan transduksi. Transformasi merupakan transfer DNA telanjang yang umumnya berasal dari satu sel bakteri ke dalam sel yang berbeda. Prosesnya adalah ketika sebuah sel bakteri pecah atau lisis maka DNA sirkular akan terlepas ke lingkungan. Efisiensi transformasi bergantung pada kompetensi sel. Konjugasi merupakan pemindahan materi genetik berupa plasmid secara langsung melalui kontak sel dengan
membentuk struktur seperti jembatan diantara dua sel bakteri yang berdekatan. Umumnya terjadi pada bakteri gram negatif. Sedangkan transduksi merupakan transfer materi genetik dari satu bakteri ke bakteri lainnya dengan menggunakan virus bakteri sebagai vektor. Transfer ini menggunakan prinsip dasar dari galur donor yang menyediakan DNA bagi galur resipien. Perbedaan utamanya dengan transfer DNA lainnya adalah DNA ditransfer melalui perantaraan bakteriofag. Terdapat beberapa jenis teknologi rekombinasi yang sedang berkembang saat ini, diantaranya adalah:
1. Homologous recombination Meningkatkan keragaman
Menjaga integritas genome (DNA repair) 2. Site-specific recombination
Termasuk non homolog bagian DNA rekombinasi di bagian spesifik.
Fragmen DNA bergabung kembali untuk membuat kombinasi baru
Fragmen yang menyediakan lokasi tertentu dimana akan terjadinya rekombinasi dan integrasi genom virus Immunoglobulin gen DNA splicing
3. Transposition
Bagian terkecil DNA (transposons) yang dapat bergerak sendiri untuk beberapa lokasi dalam kromosom inang DNA. Integrasi segmen kecil dari DNA ke dalam kromosom
Terjadi di lokasi yang berbeda dalam genom segmen DNA. Gen Imunoglobulin dirakit dengan rekombinasi
Contoh yang penting dari peristiwa rekombinasi terprogram yang terjadi selama perkembangan adalah generasi gen Imunoglobulin dari segmen gen yang dipisahkan pada genome. Imunoglobulin (atau antibody), diproduksi oleh B lymphocytes, merupakan prajurit darin sistem imun vertebrata-molekul yang berikatan dengan agen menular dan semua substansi asing bagi organisme. Mamalia seperti manusia
mampu meproduksi jutaan antibody dengan perbedaan ikatan khusus. Namun, genom manusia mengandung hanya 100.000 gen. rekombinasi membiarkan organisme untuk memproduksi perbedaan yang luar biasa dari sejumlah kecil kapsitas DNA-coking. Vertebrata umumnya memproduksi kelas ganda immunoglobulin. Untuk mengilustrasikan bagaimana keanekaragaman antibody digenerisasi, kami akan fokus pada kelas immunoglobulin (IgG) pada manusia. Imunoglobulin terdiri atas dua cincin polipeptida berat dan dua cincin polipeptida ringan, masing-masing cincin memiliki daerah tidak tetap dengan susunan yang sangat berbeda dari satu immunoglobulin dengan immunoglobulin yang lainnya. Ada dua family berbeda dari cincin polipeptida ringan, yaitu kappa dan lambda, yang bebeda pada susunan daerah konstannya. Masing-masing dari tiga tipe cincin polipeptida tersebut (cincin berat, cincin ringan kappa, dan lambda), perbedaan dari daerah variablenya digenerasi dengan mekanisme yang sama. Gen untuk polipeptida ini dibagi menjadi segmen dan tandan yang mengandung versi ganda dari masing-masing segmen yang ada pada genom. Satu versi dari masing-masing segmen digabungkan untuk membentuk gen lengkap.
Organisasi DNA yang mengkode cincin ringan kappa IgG manusia dan proses yang mana cincin ringan kappa dewasa digenerasi ditunjukan oleh GB 24-38b. sel yang tidak terdiferensiasi, informasi yang dikode untuk cincin polipeptida ini dipisahkan menjadi tiga segmen. Segmen V (variable)mengkode residu 95 pasangan basa wilayah variable, segmen J (joining) mengkode residu 12 asam amino wilayah variable berikutnya, dan segmen C mengkode wilayah konstan. Ada sekitar 300 segmen V berbeda , 4 segmen J berbeda, dan 1 segmen C. seperti pada sel batang (stem)tulang sumsum membedakan untuk membentuk B limposit dewasa, satu V dan satu J dibawa secara bersama-sama oleh rekombinasi tempat khusus. Ini merupakan delesi DNA yang deprogram secara efektif, dan DNA yang terlibat dibuang. Ada 300x 4=1200 kemungkinan kombinasi. Proses rekombinasi tidaklah senyata rekombinasi tempat khusus seperti yang dijelaskan sebelumnya, dan beberapa variasi kombinasi terjadi pada susunan persimpangan V-J yang menambahkan faktor sekurangnya 2.5 pada total variasi yang mungkin, sehingga sekitar 2.5 x 1200 = 3000 kombinasi V-J yang berbeda dapat digenerasi. Penggabungan akhir kombinasi V-Jke wilayah C diselesaikan dengan reaksi penyambungan RNa setelah transkripsi. Penyambungan RNA
akan dijelaskan pada bab berikutnya. Gen untuk cincin berat dan lambda cinicn ringan dibentuk secara sama. Pada cincin berat, ada lebuh banyak segmen gen dan lebih dari 5000 kemungkinan kombinasi. Karena semua cincin berat dapat berkombinasi dengan semua cincin ringan untuk mengenerasi immunoglobulin, ada sekurangnya 3000 x 5000 atau 1.5 x 107 kemungkinan IgG. Keberagaman lainnya digenerasi karena susunan V diperlakukan pada mutasi tinggi (mekanisme yang tidak diketahui) selama diferensiasi B-limposit. Masing-masing B-limposit dewasa memproduksi hanya satu antibody, tetapi cakupan antibody yang diproduksi oleh sel yang berbeda sangat banyak. Enzim yang mengkatalisasi penyusunan kembali gen ini belum diisolasi , tetapi susunan yng mengkoreksi proses penggabungan V-J yang sepertinya disadari oleh enzim yang telah teridentifikasi ini. Proses rekombinasi ini membantu untuk mengilustrasikan prinsip bahwa rekombinasi tidak menghancurkan material genetic yang dipelihara oleh proses replikasi dan perbaikan. di sini kita bisa lihat proses penyusunan yang nyata yang terjadi hanya pada sel-sel khususnya (germ-line DNA tidak tipengaruhi) dan memungkinkan organisme lebih efisien menggunakan sumber informasi genetik.
KUIS
1. Menurut saudara mungkinkah menitipkan gen manusia pada tumbuhan? Jelaskan!
2. Menurut saudara mungkinkah menitipkan gen tumbuhan pada manusia? Jelaskan!
3. Mengapa perkawinan antar spesies jarang menghasilkan keturunan dan jika berhasil menghasilkan keturunan umumnya steril?
4. Mengapa rekombinasi antara sel tumor dan sel sel B diperlukan untuk memperoleh antibodi?
5. Jelaskan mengapa crossing over sangan penting pada terjadinya proses rekombinasi?
BAB II
GENETIKA POPULASI
GENETIKA POPULASI
GENETIKA POPULASI
GENETIKA POPULASI
Genetika PopulasiGenetika populasi adalah bidang biologi yang mempelajari komposisi genetik populasi biologi, dan perubahan dalam komposisi genetik yang dihasilkan dari pengaruh berbagai faktor, termasuk seleksi alam. Genetika populasi mengejar tujuan mereka dengan mengembangkan model matematis abstrak dinamika frekuensi gen, mencoba untuk mengambil kesimpulan dari model-model tentang pola-pola kemungkinan variasi genetik dalam populasi yang sebenarnya, dan menguji kesimpulan terhadap data empiris. Genetika populasi terikat erat dengan studi tentang evolusi dan seleksi alam, dan sering dianggap sebagai landasan teori Darwinisme modern. Ini karena seleksi alam merupakan salah satu faktor yang paling penting yang dapat mempengaruhi komposisi genetik populasi. Seleksi alam terjadi ketika beberapa varian dalam populasi-out mereproduksi varian lainnya, sebagai akibat karena lebih disesuaikan dengan lingkungan, atau 'yang lebih cocok'. Menganggap perbedaan kebugaran setidaknya sebagian karena perbedaan genetik, ini akan menyebabkan makeup genetik populasi yang akan diubah dari waktu ke waktu. Dengan mempelajari model formal perubahan frekuensi gen, genetika populasi oleh karena itu berharap untuk menjelaskan proses evolusi, dan untuk memungkinkan konsekuensi dari hipotesis evolusi yang berbeda yang dapat dieksplorasi dalam cara yang tepat secara kuantitatif. Seiring dengan pesatnya kemajuan teknologi di bidang biologi molekuler, aspek-aspek ilmu genetika juga mengalami perkembangan yang sangat pesat. Aspek yang dimaksud masuk ke dalam ranah ilmu genetika yaitu clasical genetics, molecular genetics dan population genetics. Quantitative genetics yang membahas secara mendalam berbagai macam sifat kuantitatif seperti tinggi badan, berat badan, IQ, kepekaan terhadap penyakit, dan sebaginya masuk ke dalam ilmu population genetics. Ilmu population genetics pula yang
mendukung teori evolusi yang dikemukaan oleh Charles Darwin 150 tahun lalu. Ilmu ini menggunakan berbagai macam pendekatan statistik untuk membuktikan, menjelaskan atau mendeteksi adanya perubahan organisme dalam lingkungan oleh sebab adanya dorongan evolusi (evolutionary force). Dari sinilah lahir istilah Neo-Darwinism Dalam Neo-Darwinism, evolusi dideskripsikan sebagai perubahan frekuensi alel yang ada dalam populasi di tempat dan waktu tertentu oleh sebab adanya evolutionary force. Evolutionary force yang dimaksud di sini terdiri dari (1) Mutation, sebagai the building block of evolution, ia cenderung meningkatkan variasi genetis atau frekuensi alel yang menjadi subyek seleksi alam; (2) Natural Selection, terdiri dari directional selection, stabilizing selection dan disruptive selection; (3) random genetic drift, yang cenderung menekan variasi genetis; (4) Non-random mating yang meningkatkan homozigositas fenotip tanpa mempengaruhi frekuensi alel; (5) migration, yang mendorong kesamaan frekuensi alel antar populasi yang berbeda. Untuk mempelajari pola pewarisan sifat pada tingkat populasi terlebih dahulu perlu difahami pengertian populasi dalam arti genetika atau lazim disebut juga populasi Mendelian. Populasi mendelian ialah sekelompok individu suatu spesies yang bereproduksi secara seksual, hidup di tempat tertentu pada saat yang sama, dan di antara mereka terjadi perkawinan (interbreeding) sehingga masing-masing akan memberikan kontribusi genetik ke dalam lungkang gen (gene pool), yaitu sekumpulan informasi genetik yang dibawa oleh semua individu di dalam populasi. Deskripsi susunan genetik suatu populasi mendelian dapat diperoleh apabila kita mengetahui macam genotipe yang ada dan juga banyaknya masing-masing genotipe tersebut. Sebagai contoh, di dalam populasi tertentu terdapat tiga macam genotipe, yaitu AA, Aa, dan aa. Maka, proporsi atau persentase genotipe AA, Aa, dan aa akan menggambarkan susunan genetik populasi tempat mereka berada. Adapun nilai proporsi atau persentase genotipe tersebut dikenal dengan istilah frekuensi genotipe. Jadi, frekuensi genotipe dapat dikatakan sebagai proporsi atau persentase genotipe tertentu di dalam suatu populasi. Dengan perkataan lain, dapat juga didefinisikan bahwa frekuensi genotipe adalah proporsi atau persentase individu di dalam suatu populasi yang tergolong ke dalam genotipe tertentu. Pada contoh di atas jika banyaknya genotipe AA, Aa, dan aa masing-masing 30, 50, dan 20
individu, maka frekuensi genotipe AA = 0,30 (30%), Aa = 0,50 (50%), dan aa = 0,20 (20%).
Frekuensi Alel
Di samping dengan melihat macam dan jumlah genotipenya, susunan genetik suatu populasi dapat juga dideskripsi atas dasar keberadaan gennya. Hal ini karena populasi dalam arti genetika, seperti telah dikatakan di atas, bukan sekedar kumpulan individu, melainkan kumpulan individu yang dapat melangsungkan perkawinan sehingga terjadi transmisi gen dari generasi ke generasi. Dalam proses transmisi ini, genotipe tetua (parental) akan dibongkar dan dirakit kembali menjadi genotipe keturunannya melalui segregasi dan rekombinasi gen-gen yang dibawa oleh tiap gamet yang terbentuk, sementara gen-gen itu sendiri akan mengalami kesinambungan (kontinyuitas). Dengan demikian, deskripsi susunan genetik populasi dilihat dari gen-gen yang terdapat di dalamnya sebenarnya justru lebih bermakna bila dibandingkan dengan tinjauan dari genotipenya.Susunan genetik suatu populasi ditinjau dari gen-gen yang ada dinyatakan sebagai frekuensi gen, atau disebut juga frekuensi alel, yaitu proporsi atau persentase alel tertentu pada suatu lokus. Pola pewarisan suatu sifat tidak selalu dapat dipelajari melalui percobaan persilangan buatan. Pada tanaman keras atau hewan-hewan dengan daur hidup panjang seperti gajah, misalnya, suatu persilangan baru akan memberikan hasil yang dapat dianalisis setelah kurun waktu yang sangat lama. Demikian pula, untuk mempelajari pola pewarisan sifat tertentu pada manusia jelas tidak mungkin dilakukan percobaan persilangan. Pola pewarisan sifat pada organisme-organisme semacam itu harus dianalisis menggunakan data hasil pengamatan langsung pada populasi yang ada. Seluk-beluk pewarisan sifat pada tingkat populasi dipelajari pada cabang genetika yang disebut genetika populasi.
Genetika populasi mempunyai cakupan yang sangat luas karena melibatkan populasi suatu biotik dan abiotik. Dalam pembahasan masalah genetika populasi ekosistem menjadi tinjaun penting yang akan menghubungkan terjadinya perubahan suatu populasi akibat adanya adaptasi bahkan suatu mutasi dalam kerangka konsep evolusi. Sebagai gambran bahwa semua variasi di dalam tapak hutan terbentuk sebagai hasil kekuatan alami. Hal itu tersedia untuk
digunakan rimbawan jika dapat dikenali dan dikemas ke dalam individu pohon dalam wujud peningkatan genotip. Sumber terakhir dari semua variabilitas adalah mutasi. Sebagai tambahan variabilitas yang ditemukan pada tapak alami, manusia dapat menghilangkan dan menciptakan baik variabilitas baru maupun membentuk bersama-sama genotypes untuk menciptakan kombinasi genetik baru dan bermanfaat. Walaupun variasi di dalam hutan saat ini merupakan hasil kekuatan alami di mana rimbawan hanya mempunyai sedikit kendali, adalah penting untuk memahami kekuatan ini. Rimbawan menentukan jumlah dan macam variasi genetik ditemukan antar dan di dalam populasi. Bentuk kekuatan ini dasar untuk area spesiasi yang khusus dan mencakup kejadian evolusi. Di dalam terminologi yang paling sederhana, variabilitas di dalam tapak alami disebabkan oleh empat faktor utama. Dua faktor akan menyebabkan terjadinya peningkatan variasi dan dua yang menurunkan. Kekuatan secara alami aktif untuk meningkatkan variasi adalah mutasi dan gene flow sedangkan yang menurunkan adalah seleksi alami dan genetik drift. Kekuatan yang bekerja digambarkan secara sistimatik.
Mutasi
Mutasi merupakan sumber variasi yang terakhir. Suatu mutasi adalah suatu perubahan turun temurun di dalam konstitusi Genetik dari suatu organisma, pada umumnya di tingkat gen. Sejak total genetik diperbaiki pada suatu pohon (genotypenya) ditentukan oleh
tindakan dan interaksi beribu-ribu kombinasi allelic dan genic, mutasi dapat terjadi di suatu tempat dalam suatu organisma dengan frekwensi patut dipertimbangkan, tetapi ini tidak akan sering terjadi untuk gen spesifik dan gen lain yang kompleks atau untuk memberikan karakteristik pohon. Walaupun membicarakan tentang frekwensi mutasi nyata jumlah tak lain hanya suatu praktek akademis, sebab mereka sangat bertukar-tukar oleh jenis dan loci di dalam jenis, suatu figur umum sering dikutip adalah 1 dalam 10,000 sampai 1 dalam 100,000 gen. Ketika seseorang mempertimbangkan bahwa pohon mempunyai sepuluh ribu gen, biasa untuk pohon tunggal mempunyai beberapa mutasi. Kebanyakan tersimpan dan hanya mempunyai sedikit efek pada phenotype pohon itu. Mutasi terjadi kurang lebih secara acak. Kebanyakan mutasi adalah mengganggu, dan banyak yang hilang dari populasi itu. Melewati waktu, kekuatan evolusi sudah membuat banyak populasi yang baik menyesuaikan diri dengan lingkungan, dengan gen dan gen kompleks populasi yang lebih sesuai untuk pertumbuhan dan reproduksi. Kesempatan mutasi acak akan meningkatkan sistem koordinasi yang baik adalah sangat kecil. Ada sejumlah kekuatan yang mengubah pola variasi dalam populasi. Meningkat dengan mutasi dan gene flow dan yang dikurangi oleh seleksi alami dan genetik drift. Beberapa Mutasi tertahan dalam populasi, sungguhpun merupakan gangguan, sebab mereka dari type yang resesif dan tidaklah dapat ditemukan atau dikenali kecuali jika terbentuk homozygous. Nilai mutasi macam ini tidak mungkin yang diketahui. Mungkin hanya menjadi penting kemudian ketika kekuatan berbeda mempengaruhi lingkungan dan mutasi yang tadinya sia-sia, membuat pohon lebih cocok untuk tumbuh dan atau bereproduksi. Mutasi netral atau resesif ini tidak secara normal mengganggu suatu sistem genetik terintegrasi seperti akan suatu yang dominan. Oleh karena itu, mereka dapat terbawa sepanjang populasi untuk banyak generasi. Walaupun mutasi mungkin kecil dan jarang, akan menghasilkan variasi yang mungkin membuat suatu pohon dapat menyesuaikan diri seperti pada perubahan lingkungan. Gene flow ( Migrasi Gen). Tindakan lain dalam suatu populasi yang meningkatkan variasi disebut gen flow, migrasi alleles dari satu populasi atau spesies lain dimana mereka mungkin hadir atau pada suatu frekwensi berbeda. Gen flow dapat diakibatkan oleh beberapa penyebab, tetapi yang paling umum adalah bergeraknya pollen atau benih. Adakalanya, arus gen atau perpindahan gen berlangsung pada tingkatan spesies
melalui suatu proses yang disebut introgression bahwa kadang-kadang terjadi antara dua jenis setelah hybridisasi. Hybridisasi membawa bersama-sama dua kompleks genetik parental berlainan, dengan begitu menciptakan suatu genotip baru. Organisma baru ini mungkin tidak dengan baik menyesuaikan diri dengan bersaing dengan jenis parental, tetapi kadang-kadang itu akan ditemukan suatu "relung" lingkungan itu khususnya cocok dan itu memungkinkan genotype baru untuk tumbuh dan bereproduksi. Sebab genotype yang baru adalah jarang, atau salah satu dari suatu bentuk, pada umumnya pertukaran gen dengan salah satu parent untuk menghasilkan suatu backcross untuk salah satu jenis parental itu. Setelah proses ini terjadi beberapa kali, menghasilkan populasi pohon serupa dengan parental asli, walaupun mereka akan berisi beberapa gen atau gen kompleks yang ditransfer dari satu jenis parental kepada yang lain. Konsep gen flow dapat digunakan pada program breeding . Sebagai contoh, Pinus Jeffreyi adalah suatu bentuk yang baik jenis peka kepada kumbang penggerek reproduksi cemara. Pinus Coulteri, pada sisi lain, mempunyai bentuk lebih miskin sebab kulit batangnya lebih tebal, hambatan kepada kumbang penggerek itu. Jika kita menciptakan suatu persilangan P. Coulteri x P. Jeffreyi dan kemudian backcross untuk P. Jeffreyi beberapa kali dan memilih individu yang paling diinginkan, suatu pohon yang adalah serupa ke Pinus Jeffrey dapat diproduksi bahwa masih membawa resistensi kumbang penggerek patut dipertimbangkan. Gen yang kompleks untuk kulit batang lebih tebal ditransfer dari Pinus Coulteri ke Pinus Jeffrey. Gen flow dapat menjadi penting dalam populasi alami, dan akan merubah perbedaan dalam bentuk variasi. Gen flow bersama dengan rekombinasi adalah sumber yang segera meningkatkan bentuk variasi dalam banyak populasi, sungguhpun sumber variasi yang terakhir adalah mutasi. Seleksi
Seleksi alami adalah suatu kekuatan kuat yang pada umumnya mengurangi variabilitas. Sebab menentukan pohon yang akan tumbuh dan bereproduksi, mempunyai suatu directional (nonrandom) mempengaruhi perbaikan genetik pohon dalam suatu populasi. Seleksi alami menyokong fittest, kombinasi gen membuat lebih cocok untuk tumbuh dan bereproduksi pada lingkungan yang ditentukan. Seleksi alami memelihara dan mengakibatkan suatu peningkatan
