DETEKSI GEN PHYTOENE SYNTHASE 1 (PSY1) DAN KAROTEN
PLASMA NUTFAH JAGUNG LOKAL SULAWESI SELATAN
UNTUK SELEKSI JAGUNG KHUSUS PROVITAMIN A
Detection of phytoene synthase 1 (PSY1) gene and carotene content
of south sulawesi local corn germplasm for selection of
specific provitamine A of corn
Juhriah
1, Baharuddin
2, Yunus Musa
2, Marcia B. Pabendon
3, dan Masniawati
1E-mail: juhriah@gmail.com
1. Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin. Jl. Perintis Kemerdekaan km. 10 Makassar, 90245. 2. Fakultas Pertanian Universitas Hasanuddin. Jl. Perintis Kemerdekaan km. 10 Makassar 3. Balai Penelitian Serealia Maros. Jl. Dr. Ratulangi 147, Barangdasi Maros
ABSTRAK
Plasma nutfah sebagai sumber gen karakter tertentu dapat digunakan untuk memperbaiki karakter yang diinginkan dalam pemuliaan tanaman. Penanaman benih jagung di KP Balitsereal Maros berlangsung sejak bulan Juni sampai Oktober 2011. Sebanyak 13 entri ditanam satu baris dengan panjang 5 m, menggunakan rancangan acak kelompok (RAK) dengan 3 kelompok. Analisis (Deteksi) Gen dilaksanakan bulan Juli sampai Agustus 2011 di Laboratorium Biologi Molekuler Balitsereal Maros dan laboratorium bilologi molekuler Balai Besar Biogen Bogor bulan November 2011. Hasil deteksi gen karotenoid (PSY1) pada 13 nomor entri yang diteliti menunjukkan bahwa semua sampel mengandung gen pembawa karotenoid yaitu gen PSY 1 pada posisi 300 bp. Kandungan karoten total dan β- Karoten biji jagung Sulawesi Selatan, varitas Srikandi Kuning 1 dan Lamuru tidak berbeda nyata dengan kandungan karoten jagung asal CIMMYT, hal ini berarti bahwa 9 entri Sulawesi Selatan dan 2 varietas yang diuji berpotensi digunakan untuk perakitan jagung lokal provitamin A
Kata Kunci. Karoten, plasma nutfah provitamin A dan jagung.
ABSTRACT
Germplasm as a source of specific gen can be used as for improving plant character in a plant breeding. Farm work, preparation and planting was carried out in the experimental farm of Balitsereal Maros, from June until October 2011. There were 13 germplasm planted in a single row of 5 m length, arranged in Randomized block design with 3 block. Gene analysis was performed at the Bogor Molecular Laboratory of BB Biogen at November 2011. Analysis of total carotene content by spectro-photometer and β- carotene by HPLC be implemented at the Central Laboratory Post Harvest of Bogor. The results of the carotenoid gene (PSY1) detection of the 13 collection number indicated that all of the entry samples contained a gene carrier of carotenoid at the position of 300 base pair. The content of total carotenoids and β-carotene in the endosperm of local south Sulawesi corn, Srikandi Kuning 1 and Lamuru varieties was not significantly different from carotene content of corn originally from CIMMYT. This means that all of the 9 collections obtained from South Sulawesi and 2 tested varieties have carrier carotenoid gene, and have potentially be used for developing Pro-vitamine A of local corn.
Keywords: Carotene, germplasm, provitamine A and corn
PENDAHULUAN
Plasma nutfah tanaman ber-fungsi sebagai sumberdaya hayati, sum-ber gen dan menjadi penyangga
ke-hidupan, dapat dilestarikan (conserve-able) akan tetapi jika telah musnah maka tidak akan ditemukan kembali. Plasma nutfah sebagai sumber gen karakter
ter-tentu dapat digunakan untuk memper-baiki karakter yang diinginkan dalam pemuliaan tanaman Keanekaragaman plasma nutfah jagung merupakan asset penting sebagai sumber gen.
Beragam ancaman terhadap ke-lestarian dan keragaman plasma nutfah di alam akibat aktifitas manusia untuk memenuhi kebutuhan pangan yang se-makin meningkat seiring sese-makin ber-tambahnya jumlah pen-duduk. Inten-sifikasi dan ekstenInten-sifikasi menyebabkan tersingkirnya varietas lokal yang pada akhirnya mengakibatkan hilangnya. Sumber-sumber gen potensial untuk karakter tertentu yang terkan-dung di dalamnya yang mungkin ber-manfaat untuk perbaikan varietas di masa datang. Koleksi plasma nutfah jagung di Balitsereal terus ditambah jumlah aksesi-nya melalui kegiatan eksplorasi baik di-sentra produksi, daerah terisolasi, daerah endemis dan lainnya. Materi plasma nutfah tersebut hanya dikeluar-kan pada saat akan diperbanyak atau direjuvinasi, belum banyak dimanfaat-kan, ataupun dikarakterisasi untuk men-dapatkan karakter- karakter penting.
Salah satu karakter penting ta-naman jagung berkaitan dengan kan-dungan khusus yaitu adanya karo-teniod yang tinggi. Karotenoid sangat penting untuk fotosintesis dan foto-proteksi, berpotensi untuk mening-katkan hasil tanaman dan kualitas gizi. Kandungan karotenoid, pada biji jagung sangat ber-manfaat untuk memperbaiki gizi ma-syarakat karena akan dikonversi menjadi vitamin A. Masalah kekurangan vitamin A khususnya anak-anak dan ibu hamil di di Afrika dan Asia Tenggara (WHO, 2010). Vitamin A terkait dengan kebuta-an dkebuta-an peningkatkebuta-an risiko penyakit dkebuta-an ke-matian akibat infeksi berat bagi
anak-anak balita dan wanita hamil. PBB memperkirakan bahwa 140 juta anak-anak dan 7 juta wanita hamil kekurangan vitamin A (VAD). VAD sebagai penyebab utama kebutaan dapat dicegah (Unnevehr, Pray and Paarlberg, 2008).
Karotenoid merupakan figmen alami yang memberikan warna kuning, jingga atau merah dengan panjang gelombang diperkirakan antara 430 -480 nm. Karotenoid terletak pada plastid yang tidak berwrna hijau, kloroplas, dan kromoplas. Banyak terdapat pada buah matang, beberapa akar/umbi serta biji/ benih. Karotenoid tidak selalu berdam-pingan dengan klorofil, namun se-balik-nya klorofil selalu disertai dengan karo-tenoid.Beberapa macam karotenoid yang penting dan mempunyai hu-bungan dengan gizi adalah sebagai berikut:
Tabel 1. Jenis-Jenis karotenoid yang memiliki aktifitas vitamin A Jenis karotenoid Aktivitas
Vitamin A (%) α- karoten β – karoten y - karoten β – crytoxantin 4,17 8,33 4,17 4,17
Sumber: Dietary Reference Intakes 2001 dalam Apriantini, 2009
Karotenoid merupakan lipida, oleh karena itu larut dalam lipida lain-nya dan larut dalam pelarut lemak seperti aseton, alkohol, dietil eter dan kloroform. Karotenoid larut dalam pe-larut non polar seperti petroleum dan heksan (Gross, 1991 dalam Apriantini, 2009)
Keempat jenis karoten tersebut sebagai prekusor vitamin A, yang
paling efektif adalah β – karoten karena setiap molekulnya bersama air dapat diubah oleh enzim β – karoten -15 de-oxygenase dalam usus menjadi 2 vitamin A sedangkan lainnya hanya menghasilkan satu vitamin A (Hurst 2002)
Sintase phytoene (Psy), sebagai enzim pengendali karotenoid endo-sperm (Gallagher et al., 2004;. Wong et al, 2004;. Pozniak et al., 2007; Li et al, 2008a, 2008b) Karotenoid sangat penting untuk fotosintesis dan photoproteksi, juga berfungsi sebagai prekursor untuk molekul sinyal yang terkait dengan stres biotik dan abiotik, berpotensi untuk meningkatkan hasil tanaman dan kuali-tas gizi, karena itu karotenoid men-jadi salah satu target untuk rekayasa meta-bolik, khususnya di Poaceae yang me-liputi tanaman pangan utama. Ter-gantung pada latar belakang genetik, endosperm jagung (Zea mays) mengan-dung karotenoid dengan tingkat yang bervariasi.
Seleksi untuk mendapatkan kul-tivar jagung dengan kandungan ka-rotenoid yang tinggi pada endosperm biji melalui cara konvensional membu-tuhkan waktu yang cukup lama. Hasil penelitian Yasin dkk sejak tahun 2008 menunjukkan bahwa beberapa populasi dan galur jagung calon provit A yang benih asal CIMMYT memang dapat ber-adaptasi dengan baik di beberapa wilayah di Indonesia namun sampai saat ini belum ada yang dapat dirilis sebagai varietas provit A. Pemanfaatan marka molekuler untuk mencari gen pembawa karotenoid pada plasma nutfah jagung lokal memung-kinkan ditemukannya potensi yang sampai saat ini belum terungkap.
Dasar pertimbangan dilakukan-nya penelitian ini adalah kegiatan pemu-liaan untuk mendapatkan varietas dengan karakter tertentu membutuhkan waktu yang cukup lama untuk itu hasil penelitian ini diharapkan dapat mem-bantu dan menjadi salah satu metode untuk mempercepat seleksi sehingga penciptaan varitas dengan karakter ter-tentu (kandungan karoten biji jagung) dapat lebih cepat dan dapat dilakukan lebih dini.
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini menggunakan 13 sumber koleksi benih jagung yang ada di Balitseral Maros, terdiri dari 9 lokal Sulawesi Selatan, 2 benih dari CIMMYT yang telah diuji multilokasi dan 2 varitas jagung yang telah dirilis yaitu Srikandi Kuning 1 dan Lamuru. Penanaman di KP Balitsereal berlangsung dari bulan Juni hingga Oktober 2011. Analisis gen dilakukan di laboratorium BB-Biogen Bogor, sedangkan analisis kadar total karoten dengan spektrootometer dan β- karoten dengan metode HPLC dilak-sanakan di Balai Besar Pasca Panen Bogor.
Penanaman di lapangan meng-gunakan rancangan acak kelompok dengan 3 ulangan. Masing-masing entril ditanam satu baris pada panjang plot 5 m. jarak tanam 75 x 20 cm satu tanaman per lubang, jarak antar ulangan 1 m. Pe-nelitian dipupuk dengan urea, SP36 dan KCl (300-200-100) kg ha-1. Setelah
tanam-an berumur tujuh hari diberi pupuk Urea sepertiga bagian serta seluruh ta-karan SP36 dan KCl, selanjutnya saat umur 42-45 hst diberi pupuk kedua yaitu Urea sebanyak dua per tiga bagian. Pupuk diberikan secara tugal di samping tanaman kemudian ditutup
diikuti pembumbunan dan penyiangan. Menjelang keluarnya serbuk sari bunga jantan disungkup demikian juga bunga betina disungkup ketika menjelang kepala putik muncul agar tidak terjadi penyerbukan antar individu. Penyerbuk-an dilakukPenyerbuk-an setelah Penyerbuk-anthesis berlPenyerbuk-ang- berlang-sung sekitar 2 hari. Deteksi gen karo-tenoid yang dilaksanakan di labora-torium Biologi Molekuler Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Biotek-nologi dan Sum-berdaya Genetik Per-tanian (BB-Biogen) Bogor, menggunakan daun muda dari benih berumur 12 hari setelah semai. Se-tiap nomor koleksi diambil untuk selan-jutnya dianalisis dengan urutan kerja meliputi ekstrkasi RNA total (Rneasy Plant Mini Kit pro-duksi Qiagen), peng-ukuran kon-sentrasi RNA total (dengan Nanodrop spektro-fotometer), RT-PCR Sintesis cDNA utas awal (first-strand cDNA) dilakukan dengan menggunakan Supercript II
Reverse Transcriptase (invitrogen).,
elek-troforesis (gel agarose) dan dokumentasi (geldog)
Primer dan metode yang diguna-kan untuk analisis RNA mengacu pada, Gallagher et al., 2004). Primer Gene-spe-sifik karotenoid (PSY1) jagung (Gen Bank ZMU32636), yaitu:
PSY1, forward (no. 509) 5'-GCATTGCTC
AACGCCAG-3'; reverse (no. 519) 5'-CAGAGAGA CGGCATCAAG-3', pita gen pada 300 bp.
Hasil RT-PCR berupa cDNA kemudian diencerkan 10 x, sebanyak 2 µl diguna-kan dan dicampur dengan PCR MIX dengan komposisi selengkapnya:
A. PCR 10x PCR = 2,0 µl MgCl2 = 1,2 µl dNTPs = 0,4 µl Primer (F) = 1,0 µl Primer (R) = 1,0 µl
Taq DNA polymerase = 0,16 µl
Template = 2,0 µl
NF-water = 12,24 µl
Kondisi PCR
Initial Denaturation 95 oC 3 menit
Denaturasi 94 oC 30 detik
Anneling 54 oC 30 detik 2-34 x
Extensi 72 oC 45 detik
Final ekstensi 72 oC 10 menit
15 oC ~
Hasil amplifikasi diuji bersama RNA standar 1 kb ladder (Sigma, USA) dengan metode elektroforesis RNA pada gel 1,0% agarose, 80 Volt selama 45 menit. Kemudian gel direndam dalam 0,5 µg mL-1 Ethidium Bromide dan
di-visualisasikan menggunakan geldog dan didokumentasikan.
Analisis kandungan karoten total dengan spektrofotometer sedangkan analisis β- karoten dengan High
Performance Liquid Chromatography
(HPLC), dilakukan di Balai Besar Pasca Panen Bogor
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penanaman benih jagung di KP Balitsereal Maros telah berlangsung dari 28 Juni sampai 22 Oktober 2011. Semua bunga jantan (malai) maupun bunga betina (tongkol) yang telah disungkup, dilakukan selfing untuk mendapatkan biji dan digunakan untuk deteksi gen pada daun hasil semai dan analisis kan-dungan karoten biji.Deteksi Gen karotenoid (PSy1)
Hasil ekstraksi dan pengukuran konsentrasi RNA pada daun jagung muda dengan menggunakan Nanodrop (Spektrofotometer) selanjutnya diguna-kan dalam sintesiss c-DNA, PCR dan
Tabel 2. Rerata Konsentrasi RNA total pada Daun Plasma Nutfah jagung Nomor
entri Nama Entri
Konsentrasi RNA (ng µ L-1)
BNT
5% 1%
1 Bata pulu kuning 569.8 tn (tn)
2 Biralle bakka didi 1066.13 **(**)
308.65 418.27
3 Pulut kuning 382.73 tn(tn)
4 Lokal setempat (soppeng) 1089.27 **(**) 5 Lokal Narang Toraja 455.3 tn(tn)
6 Lokal kandora 431.43 tn(tn)
7 Lokal bebo 707.67 * (**)
8 Batara didi 450.43 tn (tn)
9 Batara didi pamatata 474.9 tn (tn)
12 Srikandi kuning 1 537.2 tn(tn)
13 Lamuru 537.8 tn(tn)
Pembanding
10 Kui carotenoid syn (1) 382.83
11 Karotenoid syn 3 (2) 283.97
Keterangan: Angka yang diikuti lambang * berbeda nyata ( taraf 5 %) angka yang diikuti lambing ** berbeda sangat nyata. Angka yang diikuti lambang tn =tidak berbeda nyata.Tanda di luar kurung untuk pembanding 1, tanda di dalam kurung untuk pembanding 2
elektroforesis. Hasil pengukuran RNA menunjukkan adanya variasi kon-sentrasi RNA pada daun. Konkon-sentrasi terendah yaitu 103.0 ng µ L-1
ditemu-kan pada nomor entri 11 kelompok 3 dan tertinggi yaitu 1839.7 ng µ L-1
pada nomor entri 4 kelompok 1. Tabel 2 menunjukkan bahwa ter-dapat perbeda-an konsentrasi RNA total daun pada plasma nutfah jagung lokal. Untuk mengetahui entri yang berbeda nyata maka dilakukan uji lanjut beda nyata Terkecil (BNT) yang hasil seleng-kapnya disajikan pada tabel 3.
Tabel 3 menunjukkan bahwa ada 3 entri yang berbeda sangat nyata dengan kedua pembanding dari Cimmyt yaitu Biralle bakka didi (nomor entri 2), Lokal setempat Soppeng (nomor entri 4) dan Lokal Bebo (nomor entri 7). Ketiga
entri tersebut memiliki konsentrasi RNA total yang jauh lebih tinggi dari kedua pembanding.
Hasil deteksi gen karotenoid (PSY1) pada 13 nomor entri (nomor koleksi) yang diteliti menunjukkan bahwa semua sampel mengandung gen pembawa karotenoid tersebut. Gen karotenoid yang diperoleh adalah gen PSY 1 pada posisi 300 bp. Hasil elektro-foresis selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 2.
Hasil sequensing pita ter-sebut menunjukkan bahwa terdapat kesamaan 99%-100% dengan data yang ada di NCBI. seperti yang di-tunjukkan antara lain sebagai berikut:
Gambar 2. Hasil elektroforesis Deteksi Gen Karotenoid pada Plasma Nutfah Jagung Lokal Sulawesi Selatan (M= Marker, 1-9= Sampel Plasma Nutfah Jagung Lokal SulSel, 10-11 = sampel jagung Cimmyt, 12= Varitas Srikandi Kuning 1, 13= varitas Lamuru, A= air (Kontrol -)
gb|AY773475.1|, Zea mays phytoene synthase 1 (PSY1) mRNA, complete cds Length=1599. GENE ID: 100136882 y1, yellow endosperm1 Zea mays, Identities = 289/289 (100%), Gaps = 0/289 (0%)
Hal ini menunjukkan bahwa plasma nutfah jagung kuning lokal Sulawesi Selatan demikian juga varietas Srikandi Kuning 1 dan Lamuru mengandung gen karo-tenoid seperti halnya yang terdapat pada 2 nomor entri pembanding yang merupakan jagung yang benih-nya berasal dari CIMMYT dan telah diuji multilokasi oleh peneliti di Balitsereal Maros dan dipersiapkan sebagai calon varitas provit A.
Hasil tersebut berarti bahwa 9 nomor koleksi yang berasal dari ber-bagai lokasi di Sulawesi Selatan yang telah dikoleksi oleh Balitsereal Maros memiliki potensi untuk dimanfaatkan sebagai bahan untuk perakitan jagung khusus provit A. Dua varitas yaitu Srikandi kuning 1 dan Lamuru juga berpotensi untuk dikembangkan tidak hanya untuk memenuhi kebutuhan pangan karena produktivitasnya yang tinggi tetapi juga sebagai pilihan bahan pangan fungsional untuk mengatasi masalah kekurangan vitamin A.
Deteksi adanya gen karotenoid pada jagung dapat diketahui meskipun tanaman masih sangat muda (dalam penelitian ini digunakan sampel daun
dari semai berumur 12 HST), hal ini bermanfaat untuk mempercepat seleksi untuk menemukan calon-calon individu yang dapat digunakan sebagai bahan untuk persilangan guna mendapatkan calon varitas yang mengandung gen pembawa sifat karoten pada endosperm biji jagung.
Peran PSY 1 dalam peningkatan kandungan karoten biji telah
dimanfaat-kan seperti pada pembentudimanfaat-kan golden
rice. Meskipun masih ada gen lain yang
juga berperan dalam pembentukan karo-ten teritama beta karokaro-ten akan tetapi PSY 1 sebagai pendahulu. Tanpa adanya gen PSY 1 maka tidak akan trbentuk karoten. Secara ringkas, rekayasa jalur biosintesa beta-karoten dtunjukkan pada skema berikut:
Gambar 3. Jalur metabolisme karoten.
Sumber biotek tanaman (2010) (www.beritaiptek.com) diakses April 2011.
Kandungan Karoten Biji
Hasil pengukuran total karoten dengan spektrofotometer menunjukkan tidak ada perbedaan nyata kandungan total karoten pada 13 entri yang diteliti, seperti ditunjukkan pada tabel anova berikut ini. Tabel analisis variansi kan-dungan total karoten biji jagung menun-jukkan hasil berbeda tidak nyata. Hal ini berarti tidak ada perbedaan kandungan total karoten pada biji jagung sembilan entri Jagung lokal Sulawesi Selatan, 2 varitas yang telah dirilis (Srikandi Kuning 1 dan Lamuru) dengan jagung
asal asal CIMMYT yang merupakan jagung calon varitas provit A. Tabel 5 me-nunjukkan bahwa total karoten tertinggi (3038.37 ppm) pada nomor entri 6 dan terendah (1056.05) nomor entri 8, keduanya merupakan plasma nutfah lokal asal Sulawesi Selatan. Meskipun tidak ada perbedaan kan-dungan total karoten namun kandungan β- Karoten tertinggi ditemukan pada salah satu jagung asal Cimmyt (634.31 ppm) pada entri 11 dan terendah (214.00 ppm) entri nomor 2 asal Sulawesi Selatan.
Tabel 4. Analisis Variansi Kandungan Total Karoten pada biji jagung SK Db JK KT Fhit Ftab, 5% 1% Kelompok 2 1061193.41985 530596.70993 2.674tn 3.40 5.61 Entri 12 1838686.46224 153223.87185 0.772 tn 2.18 3.03 Galat 24 4761987.57615 198416.14901 Total 38 7661867.45824
Tabel 5. Kadar karoten dan β- Karoten Biji jagung Sulawesi Selatan
KESIMPULAN
Plasma nutfah jagung lokal Sulawesi Selatan dan varietas Srikandi Kuning 1 dan Lamuru memiliki gen pembawa karotenoid (PSY 1) yang sama dengan gen yang dimiliki jagung asal CIMMYT yaitu pita gen pada 300 bp
Kandungan karoten total biji jagung Sulawesi Selatan, varietas Srikandi Ku-ning 1 dan Lamuru tidak berbeda nyata dengan kandungan karoten jagung asal CIMMYT .
Plasma nutfah jagung kuning Lokal Sulawesi Selatan berpotensi untuk di-kembangkan dan dijadikan bahan se-leksi untuk perakitan jagung provit A.
.
DAFTAR PUSTAKA
Apriantini, A. 2009. Kandungan Karoten, Sifat Fisik dan Kimia Serta Mutu Organoliptik Pada Wortel (Daucus carota L.) Organik dan Non-Organik Selama Penyim-panan suhu Dingin. IPB. Bogor. Gallagher, C.E., P.D. Matthews, Li F, ET
Wurtzel. 2004. Gene duplication in the carotenoid biosynthetic pathway preceded evolution of the grasses (Poaceae). Plant Physio.l 135: 1776–1783
Hurst, W.J. 2002. Methods of analysis for Fungtional Foods and Nutraceuticals. Florida CRC No Entri Total Karoten
(ppm)
Beta Karoten
(ppm) No urut Beta karoten
1 1362.50 216.84 2 2 2250.00 214.00 1 3 1401.61 263.35 4 4 2758.28 243.38 3 5 1358.29 312.03 6 6 3038.37 450.20 11 7 2493.33 497.47 12 8 1056.05 405.03 9 9 1799.46 405.70 10 10 2307.66 379.98 8 11 2008.70 634.31 13 12 1994.85 292.70 5 13 2132.29 321.40 7
Press. Dalam Apriantini, A., 2009. Kandungan Karoten, Sifat Fisik dan Kimia Serta Mutu Organo-liptik Pada Wortel (Daucus carota l.) Organik dan Non-Organik Selama Penyimpanan suhu Dingin. IPB. Bogor
Li, F, R. Vallabhaneni, E.T. Wurtzel. 2008a. PSY3, a new member of the
phytoene synthase gene family conserved in the Poaceae and regulator of abiotic-stress-induced root carotenogenesis. Plant Physiol 1.46: 1333–1345
Li, F, R.Vallabhaneni, J. Yu, T. Rocheford, E.T. Wurtzel. 2008b The maize
phytoene synthase gene family: overlapping roles for carotene-genesis in endosperm, photo-morphogenesis, and thermal stress-tolerance. Plant Physiol 147: 1334–1346
Pozniak, C.J., R.E. Knox, F.R. Clarke, J.M. Clarke.2007. Identification of QTL and association of a phytoene synthase gene with endosperm colour in durum wheat. Theor Appl Genet 114: 525–53
Unnevehr, L., C. Pray, and R. Paarlberg, 2007. Addressing micronutrient deficiencies: Alternative inter-ventions and technologies. Ag
BioForum, 10(3), 124-134.
Avai-lable on the World Wide Web: http://www. agbioforum. org. diakses 24 Oktober 2010.
WHO, 2010. Micronutrient deficiencies. (Vitamin A Deficiency).http:// www.who.int/nutrition/topics/ vad/en/index.html diakses 28 Okt ober 2010.
Wong, J.C., R.J. Lambert, E.T. Wurtzel, T.R. Rocheford. 2004. QTL and candidate genes phytoene syn-thase and zetacarotene desa-turase associated with the accu-mulation of carotenoids in maize. Theor Appl. Genet. 108: 349–359
