Pemeriksaan Penanda Limfosit Metode Immunophenotyping(1).docx

(1)

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping

Tutorial Imunologi/Pemeriksaan CD45 Dengan Metode Immunophenotyping 11 induk pluripoten yang kemudian berdiferensiasi melalui dua jalur, yaitu jalur induk pluripoten yang kemudian berdiferensiasi melalui dua jalur, yaitu jalur limfoid yang akan berperan dalam pembentukan limfosit dan jalur mieloid yang limfoid yang akan berperan dalam pembentukan limfosit dan jalur mieloid yang akan berperan

akan berperan dalam pembentukan dalam pembentukan sel-sel fagosit. sel-sel fagosit. Sel-sel imunologi ySel-sel imunologi yang utamaang utama adalah limfosit T dan limfosit B, keduanya dapat dibedakan dari fungsi yang adalah limfosit T dan limfosit B, keduanya dapat dibedakan dari fungsi yang berbeda

berbeda dan dan kemampuan kemampuan dalam dalam mengekspresikan mengekspresikan antigen antigen permukaan permukaan yang yang khaskhas untuk masing-masing jenis sel sehingga ada keterkaitan antara antigen permukaan untuk masing-masing jenis sel sehingga ada keterkaitan antara antigen permukaan dengan stadium diferensiasi (

dengan stadium diferensiasi (clusters of differentiation antigen/ clusterclusters of differentiation antigen/ cluster designation

designation = CD). = CD).11

Cluster of differentiation

Cluster of differentiation (CD) adalah molekul permukaan sel yang (CD) adalah molekul permukaan sel yang bertindak

bertindak sebagai sebagai reseptor reseptor atau atau ligan ligan dan dan dapat dapat diidentifikasi diidentifikasi dengan dengan antibodiantibodi monoklonal spesifik untuk epitop tunggal antigen (molekul) yang terekspresi pada monoklonal spesifik untuk epitop tunggal antigen (molekul) yang terekspresi pada permukaan

permukaan sel. sel. Penemuan Penemuan antibodi antibodi monoklonal monoklonal pada pada tahun tahun 1980-an 1980-an membuatmembuat masing-masing subset limfosit dapat dibedakan satu dari yang lain karena masing-masing subset limfosit dapat dibedakan satu dari yang lain karena mengekspresikan petanda permukaan (

mengekspresikan petanda permukaan (Cluster of differentiationCluster of differentiation) yang berbeda,) yang berbeda, sehingga jumlah

sehingga jumlah setiap sub populasi setiap sub populasi limfosit dapat diketahui limfosit dapat diketahui dengan menentukdengan menentukanan proporsi

proporsi petanda petanda permukaan permukaan yang yang diekspresikan diekspresikan oleh oleh masing-masing masing-masing subsub populasi.

populasi.1,21,2

Cluster of differentiation

Cluster of differentiation 45 (CD45) adalah protein tyrosine phosphatase 45 (CD45) adalah protein tyrosine phosphatase yang terdapat pada permukaan semua jenis leukosit (sel limfoid maupun mieloid), yang terdapat pada permukaan semua jenis leukosit (sel limfoid maupun mieloid), Sehingga disebut

Sehingga disebut leucocyte common antigenleucocyte common antigen, tetapi ekspresinya pada setiap sel, tetapi ekspresinya pada setiap sel berbeda-beda, dengan ekspresi

berbeda-beda, dengan ekspresi terbesar pada terbesar pada limfosit. limfosit. CD45 diketahui merupakanCD45 diketahui merupakan molekul yang mengendalikan rangkaian sinyal intraselular dan memegang molekul yang mengendalikan rangkaian sinyal intraselular dan memegang peranan

(2)

Trusted by over 1 million members

Try Scribd FREE for 30 days to access over 125 million titles without ads or interruptions! Start Free Trial

Cancel Anytime.

(3)

molekul yang paling besar, sedangan timosit mengekspresikan CD45 dengan berat molekul yang paling besar, sedangan timosit mengekspresikan CD45 dengan berat molekul teren

molekul terendah. dah. Ekspresi isoform Ekspresi isoform CD45 CD45 juga tergantung juga tergantung pada aktifitas dpada aktifitas danan stadium diferensiasi. Limfosit T

stadium diferensiasi. Limfosit T naivenaive mengekspresikan Isoform CD45RA,mengekspresikan Isoform CD45RA, sedangkan limfosit sel T memori mengekspresikan CD45RO. CD45 berperan sedangkan limfosit sel T memori mengekspresikan CD45RO. CD45 berperan dalam proses aktivasi limfosit melalui stimulasi aktivitas kinase p56lck.

dalam proses aktivasi limfosit melalui stimulasi aktivitas kinase p56lck.1,31,3 Cluster of differentiation

Cluster of differentiation dapat digunakan untuk mengidentifikasi populasi dapat digunakan untuk mengidentifikasi populasi sel melalui proses yang dikenal sebagai

sel melalui proses yang dikenal sebagai immunophenotyping immunophenotyping , yaitu teknik, yaitu teknik mengidentifikasi antigen sel melalui interaksi antara antibodi monoklonal (telah mengidentifikasi antigen sel melalui interaksi antara antibodi monoklonal (telah dilekatkan fluorokrom) yang spesifik terhadap antigen di membran atau dilekatkan fluorokrom) yang spesifik terhadap antigen di membran atau sitoplasma (intra selular) dari sel tertentu.

sitoplasma (intra selular) dari sel tertentu. Teknik yang digunakan untukTeknik yang digunakan untuk

imunophenotyping

imunophenotyping biasanya berupa biasanya berupa flow flow cytometry.cytometry. Flow Flow cytometrycytometry merupakan merupakan teknologi yang secara bersamaan mengukur dan kemudian menganalisis teknologi yang secara bersamaan mengukur dan kemudian menganalisis karakteristik fisik suatu partikel (biasanya sel) saat mengalir dalam cairan melalui karakteristik fisik suatu partikel (biasanya sel) saat mengalir dalam cairan melalui seberkas cahaya, karakteristik partikel yang dianalisis berdasarkan ukuran sel, seberkas cahaya, karakteristik partikel yang dianalisis berdasarkan ukuran sel, struktur intrasel

struktur intrasel atau granul atau granul dan dan fluoresens.fluoresens.2,4,52,4,5

Perkembangan teknologi mutakhir telah memungkinkan identifikasi sel Perkembangan teknologi mutakhir telah memungkinkan identifikasi sel dengan menggunakan alat otomatis yang disebut

dengan menggunakan alat otomatis yang disebut flowcytometer flowcytometer dan dan cell sorting cell sorting .. Prinsip

Prinsip flow cytometry flow cytometry dan dan cell sortingcell sorting (( flourescence activated flourescence activated cell sortcell sorter er , FASC), FASC) adalah, mengabungkan kemampuan alat untuk mengidentifikasi karakteristik adalah, mengabungkan kemampuan alat untuk mengidentifikasi karakteristik setiap permukaan sel dengan kemampuan memisahkan sel-sel yang berada dalam setiap permukaan sel dengan kemampuan memisahkan sel-sel yang berada dalam suatu suspensi menurut karakteristik masing-masing secara otomatis. Selain itu suatu suspensi menurut karakteristik masing-masing secara otomatis. Selain itu FASC juga dapat mengukur densitas antigen

FASC juga dapat mengukur densitas antigen yang diekspresikan.yang diekspresikan. 1,41,4 Pada pemeriksaan CD45 menggunakan

Pada pemeriksaan CD45 menggunakan flow flow cytometrycytometry dapat melihat dapat melihat ekspresi antigen pada permukaan seluruh sel leukosit dengan tingkat intensitas ekspresi antigen pada permukaan seluruh sel leukosit dengan tingkat intensitas fluoresensi yang berbeda, tetapi CD45 tidak terekspresi pada eritroid atau sel fluoresensi yang berbeda, tetapi CD45 tidak terekspresi pada eritroid atau sel non-hematologi. Limfosit dapat dengan mudah diidentifikasi dengan intensitas hematologi. Limfosit dapat dengan mudah diidentifikasi dengan intensitas pewarnaan

pewarnaan CD45 CD45 yang yang lebih lebih tinggi tinggi dari dari pada pada monosit monosit dan dan granulosit. granulosit. PerbedaanPerbedaan dalam intensitas fluoresensi antara sel dan

dalam intensitas fluoresensi antara sel dan side side scatter scatter propertiesproperties sehingga CD45 sehingga CD45 dapat menjadi

(4)

Cancel Anytime.

(5)

Gambar 1: Plot CD45 berdasarkan

Gambar 1: Plot CD45 berdasarkan lineagelineage dan maturasi sel leukosit dan maturasi sel leukosit (Sumber : Leach M, Drummond M, Doig A.

(Sumber : Leach M, Drummond M, Doig A. Practical Flow Cytometry in Haematology Practical Flow Cytometry in Haematology Diagnosis.2013

Diagnosis.2013))55

Pada tutorial ini akan diuraikan tentang pemeriksaan sel CD45 Pada tutorial ini akan diuraikan tentang pemeriksaan sel CD45 menggunakan metode FACS dengan alat Becton Dickinson FACScanto II. menggunakan metode FACS dengan alat Becton Dickinson FACScanto II. Reagen BD FASC BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 digunakan untuk invitro Reagen BD FASC BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 digunakan untuk invitro diagnostik dalam mengidentifikasi sel yang mengekspresikan antigen diagnostik dalam mengidentifikasi sel yang mengekspresikan antigen CD3/CD8/CD45/CD4.

CD3/CD8/CD45/CD4.

II.

II. TUJUANTUJUAN

Tujuan dari tes ini yaitu untuk mengidentifikasi sel yang mengekspresikan Tujuan dari tes ini yaitu untuk mengidentifikasi sel yang mengekspresikan antigen CD3/CD8/CD45/CD4 dengan metode

antigen CD3/CD8/CD45/CD4 dengan metode imunofenotyping imunofenotyping menggunakan alat menggunakan alat Becton Dickinson FACScanto II.

Becton Dickinson FACScanto II.

III. METODE III. METODE

A. PRA ANALITIK A. PRA ANALITIK 66

1).

1). Persiapan Persiapan pasien pasien : : Pasien Pasien tidak tidak sedang mesedang menggunakan obatnggunakan obat imunosupresan.

imunosupresan. 2).

2). Persiapan Persiapan sampel sampel :: 1.

1. Sampel yang Sampel yang digunakan digunakan adalah darah adalah darah perifer dengan perifer dengan antikoagulanantikoagulan ethylenediamine-tetraacetic acid

(6)

Cancel Anytime.

(7)

2.

2. Darah yang mengandung antikoDarah yang mengandung antikoagulan disimpan pada suhu kamaragulan disimpan pada suhu kamar (20°C

(20°C – – 25°C) dilakukan 25°C) dilakukan staining staining dalam 48 jam setelah pengambilan dalam 48 jam setelah pengambilan dan kemudian dianalisis dalam 24 jam setelah pewarnaan.

dan kemudian dianalisis dalam 24 jam setelah pewarnaan. 3)

3) Alat Alat dan dan bahan bahan :: 1.

1. Alat Alat : : a. a. BD BD Facscanto Facscanto IIII b. Tabung B

b. Tabung BD TrucountD Trucount c.

c. Tabung Tabung vakutainer vakutainer EDTAEDTA d.

d. Mikropipet Mikropipet & & tiptip e. Vortex

e. Vortex

Gambar 2. Alat yang dibutuhkan Gambar 2. Alat yang dibutuhkan

(Sumber : Dokumen Pribadi) (Sumber : Dokumen Pribadi)

2. Bahan : 2. Bahan :

a. Reagen yang trersedia dalam kit a. Reagen yang trersedia dalam kit66

Komposisi reagen dalam kit : Komposisi reagen dalam kit :

BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 disediakan dalam 1 mL BD Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 disediakan dalam 1 mL buffer

buffer salin salin dengan dengan 0.1% 0.1% sodium sodium azide. azide. BD BD Multitest Multitest mengandungmengandung Antibodi CD3 berlabel FITC, clone SK7; antibodi CD8 berlabel PE, Antibodi CD3 berlabel FITC, clone SK7; antibodi CD8 berlabel PE, clone SK1; abtibodi CD45 berlabel PerCP, clone 2D1 (HLe-1); and clone SK1; abtibodi CD45 berlabel PerCP, clone 2D1 (HLe-1); and antibodi CD4 berlabel APC, clone SK3. Antibodi CD3, CD8, CD45, antibodi CD4 berlabel APC, clone SK3. Antibodi CD3, CD8, CD45, and CD4 terdiri dari

and CD4 terdiri dari mousemouse IgG1 IgG1 heavy chainsheavy chains and and kappa lightkappa light

a

(8)

Cancel Anytime.

(9)

Nilai konsentrasi antibodi dalam tabel di bawah ini: Nilai konsentrasi antibodi dalam tabel di bawah ini:

Reagen Konsentrasi Reagen Konsentrasi CD3 CD3 FITC FITC 2.32.3 CD8 CD8 PE PE 1.751.75 CD45 CD45 PerCP PerCP 7.507.50 CD4 CD4 APC APC 0.920.92

b. Reagen yang tidak tersedia dalam kit : b. Reagen yang tidak tersedia dalam kit :

1. Reagen

1. Reagen lysing solutionlysing solution (100 mL buffer yang mengandung(100 mL buffer yang mengandung formaldehida <15%

formaldehida <15% dan dietilen dan dietilen glikol <50glikol <50%)%)

B. ANALITIK B. ANALITIK

a.

a. Prinsip Prinsip testes

Tabung reagen mengandung antibodi berlabel flourokrom terhadap Tabung reagen mengandung antibodi berlabel flourokrom terhadap molekul yang akan dideteksi. Ketika darah ditambahkan ke dalam reagen, molekul yang akan dideteksi. Ketika darah ditambahkan ke dalam reagen, antibodi berlabel flourokrom dalam reagen mengikat antigen khusus yang ada antibodi berlabel flourokrom dalam reagen mengikat antigen khusus yang ada dipermukaan sel leukosit (Gambar 3).

dipermukaan sel leukosit (Gambar 3).66

Gambar 3. Prisinp Kerja Reagen Gambar 3. Prisinp Kerja Reagen

CD 45+, CD CD 45+, CD 3-CD 3 CD 3 CD 45-, CD 3 + CD 45-, CD 3 + CD 45 CD 45

(10)

Cancel Anytime.

(11)

Saat melewati sinar laser flurokrom menyerap sinar dan akan Saat melewati sinar laser flurokrom menyerap sinar dan akan memancarkan

memancarkan cahaya, cahaya, cahaya cahaya diteruskan diteruskan melewati melewati suatu suatu filter filter dan dan ditangkapditangkap oleh detektor (Gambar 4). Sinyal yang ditangkap (memberikan informasi tentang oleh detektor (Gambar 4). Sinyal yang ditangkap (memberikan informasi tentang ukuran sel, kompleksitas internal, dan intensitas fluoresensi) akan dianalisis oleh ukuran sel, kompleksitas internal, dan intensitas fluoresensi) akan dianalisis oleh komputer dengan menggunakan

komputer dengan menggunakan software software sehingga data dapat divisualisasikan sehingga data dapat divisualisasikan dalam bentuk histogram maupun dot plot. Setiap sel yang melewati berkas sinar dalam bentuk histogram maupun dot plot. Setiap sel yang melewati berkas sinar laser menimbulkan sinyal elektronik yang dicatat oleh instrumen sebagai laser menimbulkan sinyal elektronik yang dicatat oleh instrumen sebagai karakteristik sel yang bersangkutan (Gambar 5).

karakteristik sel yang bersangkutan (Gambar 5).6,86,8

Gambar 4.

Gambar 4. Mekanisme Deteksi UkuranMekanisme Deteksi Ukuran, Kompleksitas Sel dan Fluoresens , Kompleksitas Sel dan Fluoresens Pada FACSPada FACS (Sumber :

(Sumber : BD FACS BD FACS Calibur)Calibur)99

Pemisahan populasi sel yang heterogen menjadi beberapa sub populasi

atas dasar seleksi molekul penanda khusus yang telah terkonjugasi dengan

fluorokrom. Pemisahan didasarkan pada jenis muatan sel.

fluorokrom. Pemisahan didasarkan pada jenis muatan sel. Sel yang memilikiSel yang memiliki kesaman dari kriteria

kesaman dari kriteria yang diinginkan akan diberikan muatan positif dan demikianyang diinginkan akan diberikan muatan positif dan demikian sebaliknya.

sebaliknya. Pemberian muatan listrik padaPemberian muatan listrik pada dropletdroplet sel dilakukan sebelum selsel dilakukan sebelum sel

tunggal melewati elektroda tersebut. Sel bermuatan positif akan mengalir ke

chamber

(12)

Cancel Anytime.

(13)

Gambar 5.

Gambar 5. Prinsip Kerja Prinsip Kerja FACSFACS (Sumber : Fibriantoi Y, BD FASCanto II) (Sumber : Fibriantoi Y, BD FASCanto II)1010

b.

b. Cara kerjaCara kerja a).

a). Persiapan Persiapan SampelSampel6,116,11 1.

1. Reagen Reagen BD BD Multitest CD3/CD8/CD4Multitest CD3/CD8/CD45/CD4 5/CD4 dimasukandimasukan 20 μL20 μL keke dalam tabung BD Trucount.

dalam tabung BD Trucount.

2. Darah yang mengandung antikoagulan EDTA ditambahkan 50 µL 2. Darah yang mengandung antikoagulan EDTA ditambahkan 50 µL ke dalam tabung BD Trucount yang mengandung reagen BD ke dalam tabung BD Trucount yang mengandung reagen BD Multitest.

Multitest. 3.

(14)

(15)

7. Sampel dianalisa menggunakan alat Facscanto II menggunakan 7. Sampel dianalisa menggunakan alat Facscanto II menggunakan

sofwer BD FACSC anto II. sofwer BD FACSC anto II.

Gambar 6. Persiapan Sampel Gambar 6. Persiapan Sampel (Sumber Ruiz P dkk.

(Sumber Ruiz P dkk. Productivity and Efficiency of 6-Color BD Multitest and BD Productivity and Efficiency of 6-Color BD Multitest and BD Trucount Technologies for Enumeration of Lymphocyte Subsets

Trucount Technologies for Enumeration of Lymphocyte Subsets ))1111

b).

b). AnalisisAnalisis Flow Cytometry Flow Cytometry 1.

1. Jika sampel Jika sampel tidak segera tidak segera dianalisis setelah persiapan, dianalisis setelah persiapan, simpan dalamsimpan dalam ruang gelap pada suhu kamar (20°C

ruang gelap pada suhu kamar (20°C – – 25°C). 25°C).

2. Vortex sampel secara menyeluruh (kecepatan rendah) untuk 2. Vortex sampel secara menyeluruh (kecepatan rendah) untuk

mengurangi agregasi sebelum sampel diperiksa pada

mengurangi agregasi sebelum sampel diperiksa pada flow flow cytometer.

(16)

(17)

Gambar 7. Data Representatif Sampel Hematologi Nor

Gambar 7. Data Representatif Sampel Hematologi Nor mal Mengunakanmal Mengunakan BD Multitest CD3 / CD8 / CD45 / CD4

BD Multitest CD3 / CD8 / CD45 / CD4 (Sumber :

(Sumber : Insert kit BD Multitest™ )Insert kit BD Multitest™ )77

C. PASCA ANALITIK C. PASCA ANALITIK

(18)

(19)

Persentase atau jumlah dari limfosit CD4 T helper berguna dalam Persentase atau jumlah dari limfosit CD4 T helper berguna dalam memantau individu yang terinfeksi

memantau individu yang terinfeksi human immunodeficiency virushuman immunodeficiency virus (HIV). (HIV). Individu dengan HIV biasanya menunjukkan penurunan stabil jumlah limfosit T Individu dengan HIV biasanya menunjukkan penurunan stabil jumlah limfosit T helper yang menandakan progresifitas infeksi sedang berlangsung. Persentase dari helper yang menandakan progresifitas infeksi sedang berlangsung. Persentase dari CD8+ meningkat pada banyak pasien dengan defisiensi imun bawaan atau didapat CD8+ meningkat pada banyak pasien dengan defisiensi imun bawaan atau didapat seperti

seperti severe severe combined combined immunodeficiencyimmunodeficiency (SCID) atau (SCID) atau acquired immuneacquired immune deficiency syndrome

(20)

(21)

DAFTAR PUSTAKA DAFTAR PUSTAKA

1.

1. Kresno, SB. Imuno Diagnostik. Dalam: Imunologi: Diagnosis dan ProsedurKresno, SB. Imuno Diagnostik. Dalam: Imunologi: Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Edisi kelima. Jakarta:Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Laboratorium. Edisi kelima. Jakarta:Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 2010: p50-7, 472-82, 513-4.

Universitas Indonesia. 2010: p50-7, 472-82, 513-4. 2.

2. Lakschevitz F. Identification of CD Marker Expression and NeutrophilLakschevitz F. Identification of CD Marker Expression and Neutrophil Surface Marker Changes in Health and Diseaseusing High through put Surface Marker Changes in Health and Diseaseusing High through put

screening flow cytometry. 2006. Available from :

https://tspace.library.utoronto.ca/bitstream/1807/75103/3/Lakschevitz_Flavia https://tspace.library.utoronto.ca/bitstream/1807/75103/3/Lakschevitz_Flavia _201611_MSc_

_201611_MSc_thesis.pdf.thesis.pdf. 3.

3. Tipu HN. Cluster of Differentiation 45: An Adjunct to FlowcytometricTipu HN. Cluster of Differentiation 45: An Adjunct to Flowcytometric Diagnosis of Leukemias. Iranian Journal Of Blood and Cance. Available Diagnosis of Leukemias. Iranian Journal Of Blood and Cance. Available from: from: https://www.researchgate.net/publication/273080854_Cluster_of_Differentiat https://www.researchgate.net/publication/273080854_Cluster_of_Differentiat ion_45_An_Adjunct_to_Flowcytometric_Diagnosis_of_Leukemias. ion_45_An_Adjunct_to_Flowcytometric_Diagnosis_of_Leukemias. 4.

4. Wohlfahrt A, Hannel L, Oliveira L, Soares P, Silva.Wohlfahrt A, Hannel L, Oliveira L, Soares P, Silva. The importance ofThe importance of immunophenotyping by flow cytometry in distinction between hematogones immunophenotyping by flow cytometry in distinction between hematogones

and B lymphoblasts

and B lymphoblasts. . 2015. 2015. Available Available from from :: http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v51n1/1676-2444-jbpml-51-01-0007.pdf. http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v51n1/1676-2444-jbpml-51-01-0007.pdf. 5.

5. Becton Dickinson company.Becton Dickinson company. Introduction Introduction to to Flow Flow Cytometry: Cytometry: A A LearningLearning Guide.

Guide. 2002. 2002. Available Available from: from: https://www.bu.edu/flow- https://www.bu.edu/flow-cytometry/files/2010/10/BD-Flow-Cytom-Learning-Guide.pdf.

cytometry/files/2010/10/BD-Flow-Cytom-Learning-Guide.pdf. 6.

(22)

(23)

Cancel Anytime.

10.

10. Fibrianto Yoni, 2016. Becton Dickinson and Company.Fibrianto Yoni, 2016. Becton Dickinson and Company. 11.

11. Ruiz P, Borowitz MJ, Tilahun H, dkk.Ruiz P, Borowitz MJ, Tilahun H, dkk. Productivity and Efficiency Productivity and Efficiency of 6-Colorof 6-Color BD Multitest

BD Multitest and BD Trucount Technologies and BD Trucount Technologies for Enumeration of for Enumeration of LymphocyteLymphocyte Subsets

Subsets. . 2007. 2007. Available Available from from :: https://www.bdbiosciences.com/documents/FACSCanto_II_app_note.pdf https://www.bdbiosciences.com/documents/FACSCanto_II_app_note.pdf 12.

12. Lam L, Hubbard.Lam L, Hubbard. Laboratory Procedure Manual. Laboratory Procedure Manual. 2004. Available from : 2004. Available from : https://www.cdc.gov/Nchs/data/nhanes/nhanes_03_04/l03_c_met_CD4%2B_ https://www.cdc.gov/Nchs/data/nhanes/nhanes_03_04/l03_c_met_CD4%2B_ CD8%2B.pdf.