KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT A BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH PADA E.coli Top10 (pET-30a(+)) Repository - UNAIR REPOSITORY

(1)

KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT A BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH

PADA E.coli Top10 (pET-30a(+))

SKRIPSI

PREVITA ZEIZAR RAHMAWATI

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA

(2)

KLONING GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT A BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH

PADA E.coli Top10 (pET-30a(+))

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Bidang Kimia Pada Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

Oleh:

PREVITA ZEIZAR RAHMAWATI NIM 080810623

Tanggal Lulus: 7 Agustus 2012

Disetujui Oleh:

Pembimbing I Pembimbing II

Prof. Dr. Ni Nyoman Tri P., M.Si Dr. Sri Sumarsih, M.Si

(3)

LEMBAR PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI

Judul : Kloning Gen Penyandi Endo-1,4-β-Xilanase Asal Isolat A Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Pada E. coli Top10 (pET30a(+))

Penyusun : Previta Zeizar Rahmawati

NIM : 080810623

Tanggal ujian : 7 Agustus 2012

Disetujui oleh :

Pembimbing I,

Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si NIP. 19630615 198701 2 001

Pembimbing II,

Dr. Sri Sumarsih, M.Si NIP. 19600110 198810 2 001

Mengetahui,

Ketua Departemen Studi Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

(4)

PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam lingkungan Universitas Airlangga. Diperkenankan untuk memakai sebagai referensi kepustakaan, tetapi pengutipan seijin penulis dan harus menyebutkan sumbernya sesuai dengan kebiasaan ilmiah.

(5)

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya,

sehingga penyusun dapat menyelesaikan proposal skripsi dengan judul Kloning

Gen Penyandi Endo-1,4-β-Xilanase Asal Isolat A Bakteri Xilanolitik Sistem

Abdominal Rayap Tanah Pada E.coli Top10 [pET-30a(+)] dengan tepat waktu.

Penulisan proposal skripsi ini tidak akan selesai tanpa bantuan dan dukungan dari

berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si selaku dosen

pembimbing I dan Ibu Dr. Sri Sumarsih, M.Si selaku pembimbing II

yang telah memberikan waktu, saran, doa dan bimbingan kepada

penulis sampai terselesaikan skripsi ini.

2. Ibu Dr. Hartati, MS selaku Dosen Wali yang senantiasa membimbing

serta memberikan banyak masukan.

3. Seluruh staf pengajar program studi S1 Departemen Kimia Fakultas

Sains dan Teknologi yang telah memberikan bekal ilmu yang

bermanfaat kepada penulis.

4. Papa, Mama, Kakak dan Adik yang memberikan kasih sayang, doa,

semangat kepercayaan, dan dukungan baik secara moril maupun materi

kepada penulis selama penyusunan proposal skripsi.

5. Ibu A.A. Istri Ratnadewi, terima kasih telah mempercayakan penulis

(6)

6. Tim proteomik TDC, mbak One, mbak Nita, mbak Laura dan mbak

Titin, mas Fanani terima kasih atas segala masukan-masukan dan

semangat yang diberikan kepada penulis.

7. Para staf TDC di lab. Lepra dan lab. Malaria mbak dinar, mbak ratna,

mbak agnes dan mbak wahyu, terima kasih atas bantuan dalam analisis

nanodrop, PCR, dan geldoc.

8. Teman – teman kelompok penelitian biokim blast (Tea, Amal, Amel,

Luluk, Nadya, Dita, Siska, Rohis, Jo, Resti, Mumun, Ryan) yang

saling memberikan semangat selama proses penelitian dan penyusunan

skripsi ini

9. Serta pihak – pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang

banyak memberikan saran, masukan dan pengalamannya.

Penyusun menyadari bahwa dalam penulisan proposal skripsi ini masih

banyak kekurangan, sehingga penyusun mengharapkan kritik dan saran yang

membangun demi perbaikan proposal skripsi ini selanjutnya. Penyusun berharap

proposal skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan

khususnya ilmu bahan alam.

Surabaya, Agustus 2012

Penyusun

(7)

Rahmawati, Previta Zeisar., 2012, Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat A bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah pada E.coli

Top10 (pET-30a(+)). Skripsi ini dibawah bimbingan Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si. dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Departeman Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya.

ABSTRAK

Endo-1,4-ß-xilanase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis hidrolisis ikatan glikosida pada xilan yang berpotensi dalam proses industri pangan, pakan, pulp

dan pengolahan limbah pertanian. Penelitian ini bertujuan untuk mengamplifikasi dan kloning gen penyandi endo-1,4- ß-xilanase asal bakteri sistem abdominal rayap tanah ke dalam E.coli Top10 [pET-30a(+)] serta menentukan urutan basa nukleotida dan tingkat homologinya terhadap gen endo-1,4-β-xilanase lain yang ada di GenBank. Proses amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A dilakukan dengan menggunakan PCR dengan 30 siklus dan pada kondisi denaturasi 940C, annealing 580C, extension 72oC. Amplikon yang diperoleh kemudian dilakukan transformasi ke dalam plasmid pET-30a(+) dan di klon kan kedalam E.coli Top 10 dan mendapatkan rekombinan yang dinamakan pEXyl06. Dari hasil analisis sekuensing, di dapatkan urutan basa dari gen penyandi endo -1,4-ß-xilanase pada plasmid pET-30a(+) rekombinan dengan ukuran gen 642 bp. Fragmen gen endo-1,4-β-xilanase asal isolat A mempunyai tingkat homologi 99% dengan gen endo-1,4-β-xilanase Bacillus subtilis strain MWO dan termasuk ke dalam kelompok glikosida hidrolase famili 11.

(8)

Rahmawati, Previta Zeisar., 2012, Cloning of Genes encoding endo-1,4-β -xilanase from xilanolytic bacterial isolate A of soil termite abdominal system in E.coli Top10 (pET-30a(+)). Script is under the guidance of Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si. dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Department of Chemistry, Faculty of Science and Technology, Airlangga University, Surabaya.

ABSTRACT

Endo-1,4-ß-xylanase is an enzyme that can catalyze the hydrolysis of the glycoside bond on xylan that industrial processes of food, feed, pulp and agricultural waste. This study aims to amplification and cloning of genes encoding endo-1,4-ß-xylanase from abdominal system termite soil bacteria into E. coli

Top10 [pET-30a (+)] and determine the sequence of nucleotide bases and the level of they homology of the else endo-1,4-β-xylanase genes in GenBank. The process of amplification of the gene encoding endo-1,4-β-xylanase from isolate A were performed using PCR with 30 cycle and the conditions of denaturation at 940C, 580C annealing, extension 72oC. Then, amplicon was transformed into the plasmid pET-30a (+) and clone it into E. coli Top 10. The result showed that recombnant namely pEXyl06. From the results of sequencing analysis, in order to get bases of the gene encoding endo-1,4-ß-xylanase in the plasmid pET-30a (+) recombinants with gene size 642 bp. Gene fragments of endo-1 ,4-β-xylanase from isolate A has 99% homology with the gene endo-1 ,4-β-xylanase Bacillus subtilis strain MWO and belongs to the group of glycoside hydrolase family 11.

(9)

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ... i

LEMBAR PERNYATAAN ... ii

LEMBAR PENGESAHAN ... iii

LEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI ... iv

KATA PENGANTAR ... v

2.3.2 Enzim α-L-arabinofuranosidase... 11

2.4 Enzim-enzim antara untuk memanipulasI DNA ... 12

2.5 Polymerase chain reaction (PCR) ... 15

2.8.2 Proses restriksi DNA insert dan DNA plasmid... 21

2.8.3 Ligasi DNA insert dengan plasmid ... 22

2.8.4 Transformasi DNA rekombinan... 23

(10)

3.5 Prosedur penelitian ... 29

3.5.1 Pembuatan larutan ... 29

3.5.1.1 Pembuatan larutan buffer TE 500mM ... 29

3.5.1.2 Pembuatan larutan lisosim ... 29

3.5.1.3 Pembuatan larutan STEP 500 µL... 29

3.5.1.4 Pembuatan larutan Na-asetat 3M ... 29

3.5.2 Pembuatan media ... 30

3.5.2.1 Pembuatan media cair untuk koloni E.coli ... 30

3.5.2.2 Pembuatan media cair untuk koloni E.coli (pET-30a(+)) ... 30

3.5.2.3 Pembuatan media padat ... 30

3.5.2.4 Pembuatan media padat untuk koloni E.coli (pET-30a(+)) ... 31

3.5.3 Peremajaan isolat bakteri xilanolitik (isolat A) ... 31

3.5.4 Isolasi DNA kromosom isolat A ... 31

3.5.5 Peremajaan E.coli (pET-30a(+)) ... 32

3.5.6 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+) ... 33

3.5.7 Pemurnian DNA plasmid pET-30a(+) ... 34

3.5.8 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase menggunakan teknik PCR ... 35

3.5.9 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa ... 35

3.5.10 Pemurnian amplikon ... 36

3.5.11 Restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) ... 37

3.5.12 Ligasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dan plasmid pET-30a(+) ... 37

3.5.13 Kloning pET-30a(+) rekombinan kedalam E.coli Top10 .... 37

3.5.13.1 Peremajaan isolat E.coli Top10 dari stok gliserol.. 37

3.5.13.2 Pembuatan sel kompeten E.coli Top10 ... 38

3.5.13.3 Transformasi plasmid pET-30a(+) ke E.coli Top10 ... 39

3.5.14 Seleksi transforman koloni E.coli Top10 pembawa plasmid rekombinan pET-30a(+) ... 39

3.6 Sekuensing dengan metode sanger ... 40

3.7 Analisis homologi hasil rekombinan dengan gen lain yang telah dipublikasikan dalam database GenBank menggunakan program BLAST ... 40

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 41

4.1 Isolasi DNA kromosom isolat A... 41

4.2 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+) ... 42

4.3 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dengan teknik PCR . 44 4.4 Kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase ... 49

4.4.1 Restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) ... 49

(11)

Top10 ... 51

4.4.4 Seleksi transforman E.coli Top10 pembawa plasmid pET- 30a(+) rekombinan ... 54

4.5 Analisis urutan basa nukleotida dan homologi DNA plasmid pET-30a(+) rekombinan pembawa gen penyandi endo-1,4-β-xilanase ... 56

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 62

5.1 Kesimpulan ... 62

5.2 Saran... 62

DAFTAR PUSTAKA ... 63

(12)

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Gambar Halaman

2.1 Koloni rayap ... 7

2.2 Struktur xilan dan sisi pemotongannya. ... 9

2.3 Reaksi yang dikatalisis oleh eksonuklease dan endonuklease.... 12

2.4 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA ligase... 13

2.5 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA polimerase... 14

2.6 Reaksi-reaksi yang oleh enzim yang memodifikasi DNA... 14

2.7 Langkah-langkah dasar dalam PCR ... 16

2.8 Peta plasmid pET-30a(+) ... 17

2.9 Langkah-langkah dasar dalam kloning gen ... 19

4.1 Elektroforesis hasil isolasi DNA kromosom ... 42

4.2 Elektroforesis hasil isolasi DNA plasmid pET-30a(+) ... 44

4.3a Elektroforesis hasil amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase isolat A dengan primer xynF dan xynR ... 48

4.3b Hasil elektroforesis amplikon yang telah dimurnikan ... 48

4.4 Analisis restriksi amplikon dan plasmid pET-30a(+) ... 50

4.5 Pengikatan dan pengambilan plasmid oleh sel kompeten dengan larutan CaCl2... 51

(13)

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Gambar Halaman

4.7 Hasil elektroforesis DNA dari transforman plasmid pembawa

pET-30a(+) ... 55

(14)

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Tabel Halaman

4.1 Beberapa gen yang mempunyai homologi yang tinggi dengan gen

penyandi endo-1,4-β-xilanase isolate A bakteri xilanolitik asal rayap

(15)

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Lampiran

1. Pembuatan Larutan TE

2. Pembuatan Larutan Lisosim

3. Pembuatan Larutan STEP

4. Pembuatan Na-Asetat 3 M

5. Pembuatan Larutan dan Bahan Untuk Elektroforesis

(16)

BAB I

PENDAHULUAN

1.1LATAR BELAKANG

Indonesia merupakan salah satu Negara tropis di dunia yang memiliki

berbagai jenis flora dan fauna. Fauna yang mempunyai tipe hidup di daerah tropis

juga sangat bermacam-macam, salah satunya adalah rayap yang tergolong dalam

kelas insekta. Di Indonesia, rayap mempunyai berbagai macam sebutan nama,

sebagian besar menyebutnya dengan semut putih, di Sumatera digunakan istilah

anai-anai, di Jawa disebut rangas, sedangkan beberapa jenis rayap di daerah Jawa

Barat disebut rinyuh, sumpiyuh. Bergantung jenisnya, panjang tubuh rayap antara

4 - 11 mm. Di alam bebas, rayap berperan penting sebagai penjaga keseimbangan

alam dengan cara menghancurkan kayu dan mengembalikannya sebagai "hara" ke

dalam tanah. Namun di pemukiman rayap menjadi hama yang sangat merugikan

dan menimbulkan kerugian ekonomis. Rayap dapat merusak bahan-bahan yang

mengandung selulosa yang merupakan sumber makanan bagi rayap, karena rayap

merupakan satu-satunya kelompok serangga yang mampu memanfaatkan selulosa

sebagai sumber makanannya, seperti: kayu, kertas dan kain (Johnson, 1992).

Komponen penyusun dinding sel kayu yaitu hemiselulosa, selulosa dan

lignin. Kelimpahan selulosa dalam kayu adalah sebesar 40-55%, hemiselulosa

sebesar 24-40% dan lignin sebesar 18-25% (Howard et al., 2003). Hemiselulosa

tersusun atas xilan, sedangkan pada kayu lunak, komponen penyusunnya adalah

(17)

kayu, pada sistem abdominal rayap terdapat mikroba yang bisa menghasilkan dan

mensekresi enzim pendegradasi hemiselulosa seperti enzim xilanolitik. Enzim

xilanolitik merupakan enzim kompleks yang terdiri atas endo-1,4-β-xilanase, β

-xilosidase, α-L-arabinofuranosidase, α-glukuronidase, asetil xilan esterase dan

asam ferulat esterase (Collins et a.l, 2005). Enzim xilanolitik ini dapat digunakan

untuk biobleching pada industri kertas, penjernihan dan meningkatkan aroma jus

dan anggur, industri makanan dan pakan ternak (Jiang et al., 2009). Xilanase

merupakan kelompok enzim yang memiliki kemampuan menghidrolisis

hemiselulosa dalam hal ini ialah xilan atau polimer dari xilosa dan

xilo-oligosakarida. Xilanase dapat diklasifikasikan berdasarkan substrat yang

dihidrolisis, yaitu β-xilosidase, eksoxilanase, dan endoxilanase (Richana, 2002).

Gen penyandi xilanase dari berbagai sumber, telah dikloning ke dalam

berbagai sel inang misalnya, Kloning gen penyandi xilanase termostabil dari

Actinomandura sp. S14 diekspresikan ke E.coli dan Pichia pastoris (Sriyapai et

al. 2011), gen xilanase dari Bacillus subtillis strain R5 (Jalal et al., 2009), xilanase

dari Bacillus strain B10 di E.coli (Huang et al., 2006), xilanase dari Paecilomyces

thermophilia di E.coli dan mengkarakterisasi xilanase rekombinan (Zhang et al,

2010).

Ratnadewi dkk (2009) telah melakukan: isolasi bakteri-bakteri pensekresi

komponen enzim xilanolitik dari rayap tanah dan mendapatkan salah satu dari

kelompok enzim xilanolitik yaitu enzim endo-1,4-β-xilanase yang dapat diperoleh

(18)

rayap. Enzim endo-1,4-β-xilanase yang diperoleh dimanfaatkan untuk produksi

prebiotik xilooligosakarida dari xilan.

Enzim endo-1,4-β-xilanase sangat penting di dunia industri dan dunia

penelitian, maka perlu dilakukan adanya suatu kemampuan untuk produksi enzim

endo-1,4-β-xilanase. Sehingga pada penelitian ini dilakukan kloning gen penyandi

enzim endo-1,4-β-xilanase sehingga akan diperoleh gen penyandi endo-1,4-β

-xilanase yang murni dalam jumlah yang relatif besar.

Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β

-xilanase yang berasal dari isolat A yang kemudian di lakukan kloning ke E. coli

Top10 (pET-30a(+)) dan menentukan urutan basa nukleotida dan tingkat

homologi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal sistem abdominal rayap tanah.

Proses amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dilakukan dengan teknik

Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer forward yang digunakan adalah

berdasarkan dari sekuen primer yang telah berhasil untuk mengamplifikasi gen

penyandi xilanase dari Bacillus strain B10 di E.coli (Huang et al., 2006) dan

primer reverse yang digunakan adalah berdasarkan penelitian skripsi oleh

Amaliah labiqah tentang amplifikasi gen penyandi endo xilanase pada rayap

tanah.

Proses amplifikasi gen endo-1,4-β-xilanase dilakukan proses denaturasi

pada suhu 94oC, annealing menggunaka gradien suhu yaitu 40oC; 48oC; 52,oC; 58

o

C dan extension pada suhu 72oC dengan jumlah siklus 30 kali. Amplikon yang

(19)

tersebut kemudian di transformasi ke dalam sel inang Escherichia coli dengan

jenis E.coli yang digunakan disini adalah E.coli Top10.

1.2Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang permasalahan maka dapat diambil suatu

rumusan masalah sebagai berikut :

1. Apakah gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal bakteri sistem abdominal

rayap tanah dapat di amplifikasi dan diklon ke dalam E.coli Top10

(pET-30a(+))?

2. Bagaimanakah urutan basa nukleotida dan tingkat homologi gen penyandi

endo-1,4-β-xilanase rekombinan asal bakteri sistem abdominal rayap

tanah?

1.3Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Melakukan amplifikasi dan kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal

bakteri sistem abdominal rayap tanah ke dalam E.coli Top10

(pET-30a(+)).

2. Menentukan urutan basa nukleotida dan tingkat homologi gen penyandi

(20)

1.4Manfaat Penelitian

Dengan melakukan kloning gen penyandi endo-1,4-β-xilanase pada sistem

abdominal rayap tanah pada E. coli Top10, diharapkan akan mendapatkan suatu

rekombinan penghasil enzim endo-1,4-β-xilanase yang murni, selanjutnya enzim

endo-1,4-β-xilanase dapat dimanfaatkan di dalam dunia industri makanan,

peternakan dan lain-lain. Selain itu di penelitian ini juga memberikan informasi

urutan basa nukleotida gen penyandi enzim endo-1,4-β-xilanase asal bakteri

(21)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Rayap

Rayap adalah jenis serangga pemakan selulosa yang berukuran sedang,

yang termasuk dalam ordo Isoptera, secara relatif kelompok kecil dari serangga

yang terdiri dari kurang lebih 1900 jenis di dunia. Hidup dalam jumlah kecil atau

besar dengan organisasi yang sangat baik, komunitasnya membuat sejumlah

kasta-kasta khusus yang memiliki pekerjaan khusus untuk kelangsungan hidup

koloni. Rayap memiliki bentuk dan ukuran sayap depan yang sama dengan sayap

belakang, sehingga ordonya disebut Isoptera (Iso = sama, ptera = sayap)

(Johnson, 1992). Rayap mempunyai taksonomi sebagai berikut :

Kerajaan : Animalia

Filum : Arthropoda

Kelas : Insekta

Subkelas : Pterygota

Ordo : Isoptera

Famili : Mastotermitidae

Kalotermitidae

Termopsidae

Hodotermitidae

Rhinotermitidae

(22)

Diseluruh dunia telah dikenal sekitar 2000 spesies rayap (diidentifikasi

dan dideskripsikan sekitar 120 spesies merupakan hama), sedangkan di Indonesia

dari sejumlah 200 spesies yang dikenal baru sekitar 20 spesies yang diketahui

berperan sebagai hama perusak kayu serta hama hutan atau pertanian

(Tarumingkeng, 2001). Pada Gambar 2.1 rayap hidup di dalam habitat-habitat di

bawah tanah yang lembab dan hidup di daerah kering yaitu diatas tanah.

Sarang-sarang rayap dapat didalam tanah seluruhnya, atau dapat menonjol diatas

permukaan. Rayap-rayap kayu kering yang hidup di atas tanah tanpa kontak

dengan tanah sama sekali hidup di potongan potongan batang pohon,

pohon-pohon dan bangunan yang terbuat dari kayu.

Gambar 2.1. Koloni Rayap (Anonim)

Sumber utama kelembabannya adalah air metabolik, yaitu air yang berasal

dari oksidasi makanan. Pada awalnya rayap diyakini tidak dapat mencerna lignin

secara baik, akan tetapi dari perbandingan oleh Seifert (1962) dari kontens lignin

pada kayu dan feses menunjukkan bahwa rayap setidaknya bisa mendemilasi

(23)

protista flagella yang berjumlah ribuan yang hidup didalam saluran pencernaan

rayap (Johnson, 1992).

2.2 Xilan

Xilan merupakan suatu heteropolisakarida, yaitu suatu komponen

struktural utama dari hemiselulosa dari dinding sel tumbuhan. Endoxilanase

(1,4-β-D-xilan xilanohidrolase; EC 3.2.1.8) (Sriyapai et al,. 2010). Xilanase adalah

Komponen utama hemiselulosa yang memiliki tulang punggung rantai

D-xilopiranosa dengan ikatan glikosidik β-1,4. Xilan memiliki residu O-asetil,

arabinosil dan 4-O-metil-D-asam glukoronat yang terikat pada tulang

punggungnya. Hidrolisa lengkap xilan menjadi monomernya memerlukan kerja

sinergi beberapa enzim xilanolitik (Zhou, et.,al., 2008). Xilanase banyak diketahui

milik dari famili GH10 dan GH11 (Howard, 2003).

Hidrolisis total xilan membutuhkan beberapa enzim yang berbeda, yaitu

endo-1,4-β-xilanase (1,4-β-D-xilan xilanohidrolase, EC.3.2.1.8) yang

menghidrolisis struktur dasar xilan secara acak menjadi xilooligosakarida; 1,4-β

-D-xilosidase (1,4-β-D-xilanxilohidrolase, EC.3.2.1.37) dan memutus

xilooligosakarida menjadi xilosa. Gugus samping yang menyusun xilan akan

dibebaskan oleh α-L-arabinofuranosidase, β-D-glukuronidase, galaktosidase dan

asetil xilan esterase menjadi arabinosa, glukuronat, galaktosa dan asetat (Lee et

(24)

Gambar 2.2. Struktur xilan dan sisi pemotongannya (Shallom, 2003)

2.3 Enzim enzim xilanolitik

Enzim-enzim pendegradasi xilan disebut enzim xilanolitik atau enzim

xilanase. Macam-macam enzim xilanase yang bermanfaat antara lain: enzim

endo-β-xilanase (EC.3.2.1.8), enzim β-xilosidase (EC.3.2.1.37), enzim α

-L-arabinofuranosidase (EC.3.2.1.55) dan enzim ekstra, yang mampu memotong

rantai sisi kelompok heteroxilan . Produk akhir hidrolisis xilan adalah xilosa dan

oligosakarida, dimana mempunyai aplikasi yang potensi di industri produksi

makanan, farmasi, kertas, produk pertanian dan bahan bakar terbarukan (Sriyapai

et al,. 2010).

2.3.1Enzim endo-β-xilanase

Endo xilanase mampu memutus ikatan β 1-4 pada bagian dalam rantai

xilan secara teratur. Ikatan yang diputus ditentukan berdasarkan panjang rantai

substrat, derajat percabangan, ada atau tidaknya gugus subtitusi, dan pola

(25)

telah banyak dideteksi pada mikroorganisme seperti bakteri dan jamur dan

masing masing telah di karakterisasi dengan baik, mikroba mikroba penghasil

xilanase biasanya memiliki pH optimum asam atau netral (Gupta et al, 2000).

Famili GH10 (disebut juga Famili F) merupakan kelompok endo xilanase dengan

massa molekul relatif tinggi dengan harga pI yang rendah. Sebaliknya Famili

GH11 (disebut juga Famili G) mempunyai massa molekul relatif rendah dengan

harga pI yang tinggi. Kedua famili tersebut berbeda dalam hal sifat katalitiknya.

Famili 10 mampu menyerang ikatan glikosidik di sebelah titik cabang dan

mengarah ke ujung non-pereduksi dengan menggunakan dua residu xilopiranosil

non-substitusi antara cabang-cabang, sedangkan famili 11 menggunakan tiga

residu xilopiranosil non-substitusi. Berdasarkan hal tersebut, famili 10

mempunyai beberapa aktivitas katalitik yang sesuai dengan β-xilosidase (Kartika

Ayu, 2006). Enzim xilanase GH famili 11, didapatkan dari Bacillus subtilis, dan

Bacillus licheniformis. Untuk enzim xilanase GH famili 10 dijumpai pada

Bacillus sp. (http://www.CAZy.org). 2.3.2 Enzim endo-β-xilosidase

Endo-β-xilosidase, yaitu enzim xilanase yang mampu menghidrolisis

xilo-oligosakarida rantai pendek menjadi xilosa. Aktivitas enzim akan menurun

dengan meningkatnya rantai xilo-oligosakarida (Reilly, 1991). Xilosa selain

merupakan hasil hidrolisis juga merupakan inhibitor bagi enzim endo-β

-xilosidase. Sebagian besar enzim endo-β-xilosidase yang berhasil dimurnikan

masih menunjukkan adanya aktivitas transferase yang menyebabkan enzim ini

(26)

2.3.3 Enzim α-L-arabinofuranosidase

Arabinosa residu ditemukan di pektin atau hemiselulosa seperti sebagai

arabinans, arabinogalaktan, atau arabinoxylans di banyak dinding sel tumbuhan.

Dalam gula bit arabinan, L-arabinosa residu terkait dalam membentuk α

-1,5-L-arabinan dari L arabinofuranose unit yang terpasang pada posisi 2 atau 3 dalam

konfigurasi α sebagai rantai samping (Sakamoto et al., 2010).

Arabinofuranosidase (EC3.2.1.55) mengkatalisis hidrolisis α-1,2 dan α-1

,3-arabinofuranosidik obligasi di hemiselulosa seperti arabinoxylan, arabinan, dan

lainnya yang mengandung arabinosa polisakarida (Canakci et al., 2008).

Enzim ini merupakan bagian dari glikosida hidrolase yang berperan dalm

proses degradasi hemiselulosa seperti arabinoxilan, arabinogalaktan, dan

L-arabinan. Adanya substituen L-arabinofuranosida dalam struktur xilan dapat

secara kuat menghambat aktivits endo-xilanase dan β-xilosidase yang berakibat

menghalangi degradasi total dari polimer xilan (Shallom et al, 2003). Hal ini

disebabkan oleh struktur L-arabinofuranosida yang cukup besar, sehingga akan

terjadi halangan ruang bagi aktivitas endo-xilanase dan xilosidase. Oleh karena

itu, keberadaan enzim arabinofuranosidase sangat penting dalam degradasi total

xilan (Shallom et al, 2003).

Arabinofuranosidase telah menerima banyak perhatian dalam beberapa

tahun terakhir karena aplikasi potensi mereka dalam proses industri agro, seperti

pengolahan buah-buahan, sayuran, dan sereal dan konversi hemiselulosa untuk

(27)

meningkatkan aroma anggur dan jus buah serta produksi arabinosa, yang telah

dilaporkan untuk menunjukkan efek antiglsemik (Canakci et al,. 2008).

2.4 Enzim-enzim Untuk Manipulasi DNA

Di dalam kloning gen diperlukan enzim-enzim untuk memanipulasi DNA.

Enzim-enzim ini dikelompokkan berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisis (Brown,

2010), yaitu:

1. Nuklease, yaitu enzim yang memotong atau memendekkan atau

mendegradasi molekul asam nukleat. Berdasarkan cara pemotongannya,

nuklease dibedakan atas dua macam yaitu eksonuklease yang

menghilangkan nukleotid satu persatu dari ujung molekul DNA dan

endonuklease yang memecah ikatan fosfodiester internal pada molekul;

DNA.

(28)

2. Ligase, untuk menyambungkan antar asam nukleat satu dengan yang lain

seperti pada DNA insert dengan plasmid dalam salah satu tahapan kloning

gen.

Gambar 2.4 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA ligase

3. Polimerase, untuk membuat kopi dari molekul DNA. Polimerase

digunakan pada proses PCR, yaitu penggandaan DNA secara invitro yang

dilakukan dalam tabung eppendorf dengan pencampuran yang

membutuhkan satu set reagen tertentu yang salah satunnya enzim

polimerase. Macam-macam reaksi yang dikatalis oleh enzim polymerase

meliputi 4 macam jenis reaksi, yang pertama adalah basic reaction atau

reaksi perpanjangan untai DNA pada umumnya, yaitu dengan mensintesis

untai-untai DNA dari 5’ hingga 3’. Kedua adalah DNA polimerase I yaitu

enzim yang menambah basa nukleotida pada daerah untai DNA yang

kosong dan kemudian mengganti urutan basa nukleotida pada untai DNA

selanjutnya dengan komplemennya Ketiga reaksi fragmen klenow yaitu

reaksi penambahan basa DNA hanya di daerah untai DNA yang kosong

saja. Dan yang keempat yaitu reaksi DNA reverse transcriptase yaitu

(29)

Gambar2.5 Reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh DNA polimerase

4. Enzim modifikasi (modifying enzymes) yaitu suatu enzim untuk

menghilangkan gugus fosfat pada ujung 5’ molekul DNA, menambah

gugus fosfat dari ujung 5’ atau menambah satu atau lebih deoksinukleotida

pada ujung 3’ molekul DNA. Dan yang terakhir adalah topoisomerisme,

yaitu suatu enzim yang mampu membentuk dan mengubah lilitan DNA

dari suatu DNA sirkuler.

.

(30)

2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) sangat berbeda dari kloning gen yaitu

Serangkaian dari pada proses penggandaan DNA secara invitro yang dilakukan

dalam tabung Eppendorf dengan pencampuran yang membutuhkan satu set reagen

seperti DNA template, primer forward dan primer reverse, Taq DNA polymerase,

buffer PCR, dNTP, MgCl, ddH2O dan ditempatkan pada suatu cycler secara

terprogram dengan serangkaian suhu yang bervariasi. Langkah-langkah dasar

dalam proses PCR adalah sebagai berikut (Brown, 2010).

1. Denaturasi DNA dilakukan pada suhu 94° C, di mana pada suhu tersebut

ikatan hidrogen yang pada struktur DNA semula double-standed

terdenaturasi berubah menjadi struktur DNA yang single-stranded.

2. Annealing (penempelan) primer dilakukan pada suhu 50-600 C. Dua untai

tiap molekul single-stranded dapat bergabung kembali pada suhu ini.

yaitu dengan cara proses penempelan primer yang dapat menempel ke

molekul DNA pada posisi yang spesifik.

3. Proses sintesis DNA menggunakan suhu 74° C. Pada suhu 740C, Taq DNA

polimerase bekerja dengan proses Taq DNA polimerase menempel pada

ujung masing-masing primer forward dan reverse, kemudian mensintesis

basa basa nukleotida sampai terbentuk untai molekul DNA yang baru

4. Suhu di naikkan kembali ke 94° C. molekul DNA double-stranded,

masing-masing terdiri dari satu untai molekul DNA asli dan salah satu

untai DNA baru, kembali ke proses denaturasi ke untai tunggal untuk

(31)

Gambar 2.7.Langkah-langkah dasar dalam PCR (Brown, 2010)

2.6 Vektor Kloning

Vektor kloning adalah konsep molekul DNA artifisial yang mampu

bereplikasi dalam organisme inang dimana sepotong DNA dipelajari secara

khusus dan dapat disisipkan pada posisi yang dikenal, molekul DNA rekombinan

(32)

sel inang diperlukan suatu wahana atau vektor. Vektor ini yang akan

mengantarkan DNA target untuk masuk kedalam sel inang. Terdapat tiga jenis

utama dari vektor yang digunakan untuk kloning DNA dalam sel bakteri: plasmid,

bagteriophage, dan Kosmid. Syarat sebuah vektor yang paling penting adalah

bahwa wahana ini mampu mengadakan replikasi dalam sel tuan rumah sehingga

menghasilkan banyak kopi molekul DNA rekombinan dan diturunkan pada sel

anak saat terjadi pembelahan sel (Russell, 1994).

2.6.1 Plasmid pET30a(+)

Gambar 2.8. Peta plasmid pET-30a(+) (Novagen)

Diagram dari vektor plasmid pET30a(+). Vektor ini berukuran 5422bp, vektor ini

memiliki beberapa fitur berikut sehingga berguna untuk kloning DNA

1. Origin of replicalion (ori) pada Plasmid pET30a(+) mengandung pBR322

(33)

2. Selectable marker pada plasmid pET30a(+) berupa kanamisin (kan).

3. Terdapat daerah sisi restriksi yang unik dan berguna untuk memasukkan

DNA sekuen yang disebut polylinker atau Multiple Cloning Sites (MCS)

yang digunakan untuk membuat plasmid rekombinan.

4. Terdapat lacI (lac repressor), dimana lacI adalah suatu gen yang dapat

menghasilkan repressor. Repressor adalah suatu protein yang dapat

menghalangi RNA polimerase menterjemahkan urutan gen dalam proses

transkripsi. Bila RNA polymerase terhalangi oleh suatu repressor, maka

DNA tidak bisa diterjemahkan oleh RNA polimerase dan protein tidak

terekspresikan dalam sel inang. lacI yang bersifat alloserik dapat di non

aktifkan oleh isopropil-β-D-thiogalaktopiranosida (IPTG) dan memicu

ekspresi lac operon (Wall, 2009).

2.7 Kloning Gen

Antara tahun 1971 sampai 1973 penelitian mengenai genetika mengalami

revolusi dalam biologi modern. Suatu metode baru yang dikembangkan sehingga

eksperimen eksperimen yang sebelumnya tidak dilakukan lagi. Metode- metode

ini disebut teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetik yang inti dari

prosesnya adalah kloning gen.

Langkah-langkah dasar dalam kloning gen menurut Brown (2010) adalah

sebagai berikut Fragmen DNA yang mengandung gen target di insersikan pada

vektor kloning sehingga menghasilkan suatu molekul DNA rekombinan. Vektor

(34)

bakteri, ragi, jamur, tanaman tingkat tinggi, dan sel-sel mamalia. Vektor

mengadakan replikasi di dalam sel inang, sehingga menghasilkan banyak kopi

atau turunan yang identik dari vektor dan gen yang dibawanya. Ketika sel inang

membelah, Kopi molekul DNA rekombinan diwariskan pada progeni dan diikuti

replikasi vektor selanjutnya. Sel inang terus melakukan pembelahan sel, hingga

terbentuk koloni pada media padat dan dihasilkan klon sel inang yang identik

dimana tiap sel dalam satu koloni mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA

rekombinan.

Gambar 2.9. Langkah langkah Dasar dalam Kloning Gen (Brown, 2010)

Molekul DNA rekombinan perlu dimasukkan ke dalam suatu sel inang

untuk dapat mengekspresikan produk DNA sisipan. Beberapa komponen yang

perlu diperhatikan dalam memilih sel inang yang baik untuk pengklonan adalah

sebaiknya sel inang memiliki tingkat pertumbuhan yang cepat, dapat tumbuh pada

(35)

medium kultur, tidak bersifat patogen, dapat ditransformasi oleh DNA dan stabil.

Sel inang dalam pengklonan umumnya berupa mikroorganisme, misalnya

Escherichia coli, Bacillus subtilis, dan Saccharomyces cerevisiae (Brock et al.,

1994).

Eksperimen kloning gen pada umumnya dilakukan dalam 5 langkah: (1)

generasi fragmen DNA yang cocok untuk kloning. (2) keterkaitan fragmen yang

akan di kloning ke vektor plasmid atau genom virus oleh pengobatan DNA

fragmen / vektor campuran dengan DNA ligase. (3) pengenalan produk ligasi

DNA ke dalam sistem sel inang yang cocok, seperti E.coli, dengan transformasi,

transfeksi atau infeksi. (4) diubah pembelotan klon DNA yang mengandung

spesies hibrida yang dibutuhkan: dan (5) isolasi dan karakterisasi DNA dari

spesies hibrida pada hasil klon (Timmis, 1984).

Kloning merupakan suatu dorongan bagi para ilmuan karena dapat

melakukan seleksi dan pemurnian suatu gen dalam jumlah besar yang bebas dari

kontaminasi oleh urutan DNA lain. Kunci keberhasilan atau kegagalan suatu

eksperimen kloning adalah kemampuan melakukan seleksi terhadap gen target

yang akan dikloning. Bila suatu gen berhasil diklon, maka tidak akan lagi terdapat

kesulitan untuk memperoleh informasi tentang struktur, fungsi, dan ekspresi pada

gen tersebut (Brown, 2010).

2.8 Tahapan Kloning Gen

2.8.1 Amplifikasi DNA sisipan

Sintesis dan amplifikasi DNA sisipan yang akan diklon kan menggunakan

(36)

amplifikasi enzimatik secara invitro dari DNA sisipan dengan cara mensintesis

DNA tersebut sehingga menghasilkan jumlah salinan dari fragmen DNA dengan

jumlah banyak dan spesifik (Ausubel et al, 1995). Proses PCR dibutuhkan sampel

DNA yang digunakan sebagai DNA cetakan (template) dan reagen-reagen seperti

Taq DNA polymerase, buffer PCR, dNTP, MgCl, ddH2O juga primer forward dan

reverse (Huang et al., 2006).

Reaksi amplifikasi suatu fragmen DNA diawali dengan denaturasi DNA

cetakan sehingga yang awalnya DNA dalam bentuk untai ganda (double stranded)

akan mengalami denaturasi menjadi untai tunggal (single stranded). Berikutnya

adalah proses annealing pada suhu sekitar 55 °C. Primer akan menempel pada

cetakan yang telah terpisah menjadi untai tunggal. Proses dilakukan selama 1-2

menit, kemudian pada proses sintesis DNA, suhu inkubasi dinaikkan menjadi 72

°C selama 90 detik agar terjadi proses polimerisasi untai DNA yang baru

berdasarkan informasi dari DNA cetakan. DNA untai ganda yang terbentuk

selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi 95

°C untuk tahap siklus berikutnya (Brown, 2010).

2.8.2 Proses Restriksi DNA Insert dan DNA plasmid

Dalam kloning gen tahap yang paling penting adalah proses restriksi

molekul DNA dan vektor dengan ukuran yang tepat. Tiap vektor harus dipotong

pada posisi tunggal untuk membuka lingkaran sehingga molekul DNA baru dapat

diinsersikan. Fitur yang paling penting dari sebuah enzim restriksi adalah bahwa

enzim restriksi mampu membelah molekul untai ganda DNA pada suatu pasangan

(37)

Enzim restriksi dibagi menjadi 3 tipe yaitu berdasarkan komposisi subunit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang diperlukan (Sasnauskas, 2006). Ada dua jenis utama dari enzim restriksi: enzim restriksi tipe

I, yang mengenali sekuen tertentu namun memotong di tempat lain, dan enzim

restriksi tipe II, dapat memotong hanya dalam situs pengenalan. enzim tipe II

adalah kelas yang paling penting. enzim restriksi di semua kelas ini membuat dua

potongan untai tunggal, satu potong di masing-masing untai. ada dua pengaturan

pemotongan: (1) potongan di pusat simetri (menghasilkan ujung tumpul) atau (2)

potongan yang simetris, ditempatkan di sekitar garis simetri (menghasilkan

ujung-ujung kohesif atau ujung-ujung lengket) (Freifelder, 1987). Pada proses kloning gen,

enzim restriksi endonuklease yang digunakan umumnya adalah tipe II karena

dapat memotong DNA pada sisi spesifik, sehingga dihasilkan pola potongan

spesifik. Sisi pengenalan enzim restriksi endonuklease tipe II berupa inverted

repeats, yaitu sekuen dapat dibaca sama dari arah manapun, atau disebut

palindrome (Brown, 2010).

2.8.3 Ligasi antara DNA Insert dengan Plasmid

DNA vektor dan DNA target yang telah dipotong dengan menggunakan

enzim restriksi, kemudian digabungkan untuk membentuk DNA rekombinan

(Snustad and Simmons, 2006). Proses tersebut dinamakan proses ligasi, sebab

dilakukan dengan menggunakan enzim DNA ligase. DNA ligase mengkatalisis

pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5' fosfat dan 3'-hidroksil terminal

dalam DNA dupleks (Ausubel et al, 1995). Nama enzim biasanya yang di

(38)

T4 ligase ini adalah nama enzim DNA ligase yang lain yang efisien

bergabung ujung tumpul Terminal di bawah kondisi reaksi normal. Ligasi ujung

lengket yang pada umumnya dilakukan pada suhu 12oC sampai 15oC, sedangkan

ligasi ujung tumpul biasanya dilakukan pada suhu kamar (<30oC) dengan 10

sampai 100 kali lebih enzim dari ligasi ujung lengket. T4 DNA ligase dihambat

kuat oleh konsentrasi NaCl > 150 mM. (Ausubel et al, 1995).

2.8.4 Transformasi DNA Rekombinan

Transformasi DNA rekombinan adalah proses transfer DNA plasmid

rekombinan ke dalam sel inang (Mulis, 1990). Syarat utama dalam transformasi

DNA rekombinan adalah sel inang harus dibuat kompeten terlebih dahulu. Sel

kompeten tersebut yang kemudian dicampur dengan plasmid rekombinan untuk

proses transformasi ke dalam sel inang, proses ini yang disebut elektroporasi yaitu

mendorong DNA ke dalam sel dengan dialiri arus listrik (Mulis, 1990).

Elektroporasi merupakan metode transformasi paling cepat, mudah dan efisien.

Efisiensi transformasi diperoleh dapat mencapai 1010 transforman/µg DNA

(Sambrook, 1989).

Metode transformasi dilakukan dengan kejutan panas (heat shock) yang

diawali dengan pemberian CaCl2 untuk menghasilkan sel bakteri yang kompeten,

molekul DNA, misalnya plasmid, dimasukkan ke dalam sel kemudian akan

bereplikasi di dalam sel. Sel kemudian diinkubasi dalam medium pertumbuhan

non-selektif untuk memulihkan kondisi sel (membran sel kembali utuh). Sel

bakteri yang umum digunakan dalam proses transformasi DNA rekombinan

(39)

2.8.5 Sekuensing DNA

sekuensing DNA adalaah suatu metode yang digunakan untuk membaca

urutan basa nukleotida yang terdapat dalam suatu molekul gen. dalam dunia

kedokteran manfaat dari sekuensing DNA adalah dapat digunakan untuk

mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan penyakit

genetik. Dalam sekuensing DNA terdapat dua metode yang sering digunakan,

yaitu metode secara enzimatik oleh Fredrick Sanger dan metode Metode kimiawi

oleh Maxam - Gilbert (Brown, 2010; Devor, 2005).

1. M et ode kim iawi oleh Maxam - Gilbert

Metode yang dikembangkan adalah untuk sekuensing DNA untai tunggal dengan mengambil keuntungan dari proses dua langkah katalitik yang

melibatkanPiperidinadan dua bahan kimia yangselektif menyerangpurin

danpirimidin(Devon, 2005). Selain itusulfat, dimetildanpiperidina secara selektif akan membelah nukleotida guanin namun dimetil sulfat dan

Piperidinadi asam formiat akanmembelah baik nukleotidaguaninmaupun adenin. Fragmen DNA untai ganda yang akan ditentukan urutannya mula- mula dilabel menggunakan gugus fosfor radioaktif pada ujung 5’ tiap

untai. reaksi-reaksi akan di muat pada gel poliakrilamida dengan

persentase tinggi dan fragmen diselesaikan oleh elektroforesis.

2. Metode enzimatik oleh Frederick Sanger

Rantai pemutusan sekuensing DNA yang didasarkan pada prinsip bahwa

molekul DNA untai tunggal yang berbeda panjang dengan hanya satu

(40)

poliakrilamida. Bahan awal untuk percobaan sekuensing terminasi rantai

merupakan persiapan molekul DNA untai tunggal yang identik. Langkah

pertama adalah untuk penempelan oligonukleotida pendek ke posisi yang

sama pada setiap molekul. Langkah kedua adalah sintesis untai reaksi,

yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase dan membutuhkan empat

trifosfat deoksiribonukleotida (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP) sebagai

substrat. (Brown, 2010). Untuk mengetahui urutan DNA hasil analisis,

adalah mengidentifikasi dideoksinukleotida diakhir setiap rantai

(41)

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Proteomik, Institute

Tropical Desease, Universitas Airlangga, Surabaya . Penelitian ini dimulai pada

bulan Januari 2012 sampai bulan Juli 2012.

3.2Sampel Penelitian

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat A dari bakteri

asal sistem abdominal rayap tanah yang diperoleh dari A. A. Istri Ratnadewi S,Si.

M,Si (Universitas Jember, Indonesia) dan plasmid pET-30a(+) (Novagen).

3.3 Bahan dan Alat Penelitian

3.3.1 Bahan Penelitian

Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: buffer TE,

bacto-agar, lisozim, tris Cl, SDS, HCl, EDTA, proteinase K, kloroform, fenol,

isoamilalkohol, natrium asetat, etanol absolut, etanol 70%, NaOH, dNTP, Taq

DNA polimerase, primer forward xynF, primer reverse xynR, buffer PCR,

MgCl2, ddH2O, agarosa, tripton, yeast extract, NaCl, buffer TAE, etidium

bromida, DNA purification kit, kanamisin (100µg/mL), enzim restriksi SacI dan

(42)

3.3.2 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan adalah autoklaf (OSK 6508 Steam pressure

apparatus Ogawa Seiki Co., LTD), laminair air flow cabinet (Kottermann 8580),

sentrifuga Beckman (tipe TJ-6), timbangan analitik (Mettler Toledo), pH meter

(Metro-ohm 744), oven (Memmert, Jerman), rotary shaker, lemari pendingin -20

0

C (Royal Chest Freezer BD195), pipet mikro (Eppendorf), waterbath (sansat type

syk-382-M), shaker incubator (Heidolph Polymax 1040), Spektrofotometer

UV-VIS (Shimadzu UV-1700), Polymerase Chain Reaction (BioRad), UV

transluminator, Sequencer (Applied Biosystems) dan alat-alat gelas yang lazim

(43)

Isolasi DNA kromosom

E.coli Dengan molekul DNA rekombinan (Transforman)

Transformasi ke E.coli Top10

E.coli Top10 rekombinan

Seleksi transforman

Urutan basa nukleotida gen endo-1,4-β-xilanase rekombinan

(44)

3.5 Prosedur Penelitian

Teknik molekuler ini dilakukan berdasarkan metode dari Smbrook et, al (1989).

3.5.1 Pembuatan Larutan

3.5.1.1 Pembuatan larutan buffer TE 500mM

Larutan stok Tris Cl 500 mM sebanyak 50 mL dibuat dengan cara

menimbang secara kuantitatif 3,0285 gram tris Cl, diadd kan dalam 50 mL H2O.

Dibuat dalam dua pH. Yaitu pH 7,5 dan pH 8. Larutan stok EDTA 500 mM

sebanyak 25 mL, ditimbang secara kuantitatif 4,653 gram EDTA, dilarutkan

dalam 25 mL H2O, dibuat dalam pH 8 dengan cara menambahkan sedikit demi

sedikit larutan NaOH.

3.5.1.2 Pembuatan larutan lisosim

Stok lisosim 10 mg/mL ditimbang secara kuantitatif 0.01 gram

dimasukkan kedalam tabung Eppendorf 1,5 mL lalu ditambahkan akuades hingga

1 mL

3.5.1.3 Pembuatan larutan STEP 500 µL

Ke dalam tabung Eppendorf, ditimbang secara kuantitatif SDS 0,5 %

sebanyak 0,0025 gram, ditambahkan Tris Cl 50 mM pH 7,5 sebanyak 50 µL, 400

µL EDTA 0,4 M dan proteinase K dari stok 20 mg/mL diambil 25 µL, semua

dicampur dalam tabung Eppendorf dan dihomogenkan.

3.5.1.4 Pembuatan larutan Na-Asetat 3M

Di timbang secara kuantitatif 2,4609 gram natrium asetat dan dimasukkan

(45)

3.5.2 Pembuatan Media

3.5.2.1 Pembuatan Media Cair untuk pemeliharaan E.coli

Media cair yang digunakan adalah media Luria Bertani. Media ini dibuat

dengan melarukan 1% tripton, 1% NaCl, dan 0,5% yeast extract dalam akuades.,

media cair yang dituangkan kedalam erlenmeyer sebaiknya mengisi 1/5 dari

bagian Erlenmeyer. Hal ini dilakukan untuk mencukupi kebutuhan udara pada

pertumbuhan bakteri.

3.5.2.2 Pembuatan Media Cair untuk pemeliharaan E.coli (pET-30a(+)) Media cair yang digunakan adalah media Luria Bertani kanamisin. Media

ini dibuat dengan melarukan 1% tripton, 1% NaCl, dan 0,5% yeast extract dalam

akuades serta 0,5 µL kanamisin, yaitu antibiotik yang digunakan untuk

menumbuhkan plasmid pET-30a(+), media cair yang dituangkan kedalam

Erlenmeyer sebaiknya mengisi 1/5 dari bagian Erlenmeyer. Hal ini dilakukan

untuk mencukupi kebutuhan udara pada pertumbuhan bakteri.

3.5.2.3 Pembuatan Media Padat

Media padat yang digunakan merupakan media LB (Luria Bertani) yang

digunakan untuk meremajakan koloni Bacillus subtilis. Ditimbang 1 gram

bacto-agar, 0,5 gram tripton, 0,5 gram NaCl, dan 1 gram yeast extract, kemudian semua

bahan di atas dilarutkan dalam 50 mL akuades. Selanjutnya media tersebut

dipindahkan ke dalam erlenmeyer dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu

121oC selama 15 menit. Media steril yang masih hangat-hangat kuku

dihomogenkan kemudian dituang ke dalam cawan petri sebanyak 20 mL. Media

(46)

3.5.2.4 Pembuatan Media Padat untuk koloni E.coli (pET-30a(+))

Media yang digunakan merupakan media Luria Bertani (LB). Media padat

digunakan untuk meremajakan koloni E. coli Top10 yang mengandung

pET30a(+). Dibuat media padat 20 mL, ditimbang 0,4 g agar, 0,2 g pepton, 0,2 g

NaCl , dan 0,1 g yeast extract, dilarutkan dalam 20 mL aquades, disterilkan

dengan autoklaf suhu 1210C selama 15 menit. Media steril yang telah

hangat-hangat kuku ditambah dengan 10 µL kanamisin (100 mg/mL), dihomogenkan

kemudian dituang ke dalam cawan petri.

3.5.3 Peremajaan isolat bakteri xilanolitik (isolat A)

Proses peremajaan bakteri dimulai dari mengambil biakan isolat A dari

kultur sebelumnya. Isolat diambil dengan menggunakan kawat ose. Lalu kawat

yang mengandung biakan ini digoreskan pada media padat yang baru. Selanjutnya

biakan diinkubasi pada oven dengan suhu 370C selama 18 jam.

3.5.4 Isolasi DNA kromosom isolat A

Koloni tunggal isolat A diinokulasikan ke dalam 5 ml media cair dan

diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 370C dengan kecepatan 150 rpm

selama 18 jam. Kemudian sebanyak 5 ml suspensi sel disentrifuge selama 2 menit

dengan kecepatan 10.000rpm pada suhu 4oC. Setelah terpisah, supernatan dibuang

kemudian pellet sel diresuspensi dengan 250 µl buffer TE (50 mM tris HCl pH 8

dan 50 mM EDTA). Larutan tersebut dibekukan pada suhu -20oC selama 30

menit. kemudian ditambahan 250 µL lisozim 10mg/ml ke dalam sel beku dan

dibiarkan mencair pada suhu kamar. Larutan sel yang sudah mencair dimasukkan

(47)

1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K) sebanyak 50µL ke dalam suspensi dan

dicampur rata. Campuran ini selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada suhu

50oC selama 1 jam sambil sesekali digoyang perlahan. Kemudian ditambahkan

300µL larutan fenol jenuh ke dalam campuran lalu dikocok sampai terbentuk

emulsi. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 12.000rpm selama 5 menit

sampai terpisah dua lapisan. DNA yang diinginkan berada pada lapisan atas.

Lapisan atas dipipet secara hati-hati dan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf

yang steril. Selanjutnya ditambahkan larutan natrium asetat 0,3 M sebanyak 0,1

kali dari volume total hasil pemipetan DNA, lalu dicampur perlahan. Kemudian

ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan kemudian

tabung dibolak-balik untuk pencampuran. Setelah itu, campuran diinkubasi pada

suhu -20oC selama 2 jam sampai semalam. Campuran disentifugasi pada 12000

rpm selama 5 menit, kemudian supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 0,6

ml etanol 70%. Sentrifuge kembali campuran pada 12000 rpm selama 5 menit.

Pelet diambil kemudian ditambahkan 30 µL ddH20

3.5.5 Peremajaan E.coli (pET-30a(+))

Proses peremajaan bakteri dimulai dari mengambil koloni E. coli yang

mengandung plasmid pET-30a(+) dari kultur sebelumnya. Koloni diambil dengan

menggunakan kawat ose. Lalu kawat yang mengandung biakan ini digoreskan

pada media padat yang baru. Selanjutnya biakan diinkubasi pada oven dengan

(48)

3.5.6 Isolasi DNA plasmid pET-30a(+)

Koloni tunggal transforman E.coli diinokulasikan ke dalam 5 mL media

LB cair yang mengandung 2.5 µL kanamisin dan diinkubasi pada shaker

incubator pada suhu 370C dengan kecepatan 150 rpm selama 16 jam. Kemudian

sebanyak 5 ml suspensi sel di sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan

10.000 rpm pada suhu 40C, pellet disuspensi dengan larutan I (Glukosa 50 mM,

Tris-Cl 2.5 mM pH 8, Na2EDTA 10 mM pH 8) 100 µL dan dihomogenkan lalu

didiamkan 5 menit. Ditambahkan 200 µL larutan II (NaOH 0.2 N 20 µL, SDS 1%

100 µL, aquades steril 880 µL) dan dihomogenkan dengan cara membolak balik

tabung Eppendorf, larutan di inkubasi di es selama 15 menit, setelah 15 menit

ditambahkan 150 µL larutan III (Kalium asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O

dingin), di inkubasi dalam es selama 10 menit. campuran tersebut disentrifugasi

selam 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm suhu 40C, supernatan yang diperoleh

dipindah secara perlahan dengan menggunakan pipet kedalam tabung Eppendorf

baru yang steril dan ditambahkan campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol

(25:24:1) 1 kali volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian

disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit. dihasilkan 3 lapis, fasa paling bawah

adalah fasa organik, fasa tengah adalah suatu emulsi putih dan fasa paling atas

adalah fasa cair, fasa cair di pindah dengan cara mempipet secara hati-hati

kedalam tabung eppendorf baru yang steril, fasa cair tersebut dipekatkan dengan

penambahan etanol absolut dingin 2 kali volume total, dan diinkubasi dalam es

selama 1 jam. Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, pellet dicuci

(49)

dari etanol dengan cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit. Kemudian

pellet dilarutkan dalam 30 µL ddH2O.

3.5.7 Pemurnian DNA plasmid pET-30a(+)

Purifikasi DNA plasmid menggunakan Kit QS Aquick Gel Extraction kit

50, Pertama-tama gel agarosa yang mengandung pita DNA plasmid dipotong

dengan menggunakan cutter bersih dan dimasukkan dalam tabung Eppendorf,

berat total gel dan Eppendorf maksimal 1,3 gram. Pada tabung tersebut

ditambahkan buffer QG 3X volume, dan diinkubasi dalam waterbath suhu 500C

selama 10 menit yang setiap 5 menit tabung eppendorf dibolak balik untuk

penghomogenan larutan. Setelah gel larut dengan sempurna, tabung eppendorf

tersebut si spin sebentar dan di pindah kedalam sebanyak 800µL ke kolom

QIAquick yang dilengkapi dengan tabung pengumpul lalu disentrifugasi 12.000

rpm selama 1 menit. Air pada tabung pengumpul dibuang dan pada kolom dicuci

dengan buffer PE sebanyak 750 µL dan didiamkan selam 30 menit. Lalu

disentrifugasi 12.000 rpm 1 menit, air pada tabung pengumpul dibuang dan

dilakukan lagi sentrifugasi 12.000 rpm 1 menit. Kemudian ditambah ddH20 30 µL

pada kolom, sedangkan tabung pengumpul di ganti dengan tabung eppendorf baru

yang steril dan didiamkan 30 menit baru dilakukan sentrifugasi 12.000 rpm

selama 1 menit. kemudian mengulangi langkah ini sekali lagi. Larutan yang

(50)

3.5.8 Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase menggunakan teknik PCR

Proses amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase menggunakan teknik

PCR. Komponen reaksi PCR yang digunakan komposisinya adalah 6,5 L ddH2O

steril, 1µL MgCl2, 1 L primer xynF (50 pmol), 1L primer xynR (50 pmol) dan

3 L DNA kromosom (hasil isolasi DNA) yang digunakan sebagai template,

mastermix 12,5 µl. Total volume PCR sebanyak 25 L. Proses amplifikasi gen

endo-1,4-β-xilanase dilakukan pada kondisi denaturasi pada suhu 94oC selama 1

menit, annealing pada variasi suhu 40oC; 48oC; 52,oC; 58 oC selama 1 menit dan

extension pada suhu 72oC selama 1 menit dengan jumlah siklus 30 kali. Proses

amplifikasi diawali dengan predenaturasi pada suhu 94oC selama 5 menit dan

diakhiri dengan post extension yang dilakukan pada suhu 72oC selama 10 menit

3.5.9 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa

Analisis DNA plasmid menggunakan elektroforesis gel agarosa (1%).

Sebelumnya dilakukan persiapan pada perangkat elektroforesis yaitu dengan

menambahkan buffer TAE 0,5x sampai gel agarose tercelup. Campuran DNA dan

loading dye yang telah homogen kemudian dimasukkan dalam sumur pada gel

agarosa. Kemudian perangkat alat elektroforesis tersebut dialiri arus listrik sebesar

80 V dan dibiarkan sampai loading dye berjalan kurang lebih 2/3 gel agarosa. Gel

kemudian dipindah dan dilakukan proses staining dengan direndam dalam larutan

TAE yang telah diberi 20 µL Etidium Bromida (EtBr) selama 30-45 menit.

(51)

memasukkan gel kedalam akuades steril. Untuk memvisualisasi DNA yang telah

dielektroforesis digunakan sinar UV dan kemudian didokumentasikan dengan

kamera polaroid atau menggunakan geldoc.

3.5.10 Pemurnian amplikon

Pemurnian DNA kromosom hasil dari PCR menggunakan Kit QS A Quick

Gel Extraction kit 50, Pertama-tama gel agarosa yang mengandung pita DNA

kromosom dipotong dengan menggunakan cutter bersih dan dimasukkan dalam

tabung eppendorf, berat total gel dan eppendorf maksimal 1.3 gram. Pada tabung

tersebut ditambahkan buffer QG 3X volume, dan diinkubasi dalam waterbath suhu

500C selama 10 menit yang setiap 5 menit tabung eppendorf dibolak balik untuk