ANALISIS EKSPRESI KLON GEN CVPD
rDALAM SEL Escherichia coli
A.A. Putu Sri Mahayani
UNTAG Surabaya
aap.srimahayani@gmail.com
ABSTRACT
The effort to control CVPD was done, but it did not fulfil the expectation
properly. One of the new approach to control the CVPD plant diseases were
genetics approach expedient i.e. by isolating and resistant gene cloning or
resistant against CVPD.
Jeruk kingkit was far family of citrus plant which was resistant to CVPD.
One of genetics transformation technique by Agrobacterium vector , have been
isolated and cloned from DNA fragments successfully that were contain genes for
resistance against CVPD disease (CVPD
rgene) from Triphasia trifolia (Jeruk
kingkit). Those DNA fragments were cloned in plasmid of pUC18 vector and were
cared in the Escherichia coli JM109 cell, so that this research aims to detect
CVPD
rgene expression in the Escherichia coli JM109 cell, to compare CVPD
rgene
expression in the Escherichia coli JM109 cell with proteins which were isolated
from T. trifolia and Siamese citrus.
The bacteria were cultivated at liquid LB medium by adding agarose gel
1.5 g that contain ampicillin 100 ppm, and those bacteria were cultured at
agarose gel LB medium that contain ampicillin 100 ppm. Colonies of growth
bacterium were taken to be isolated their plasmids with the DNA agarose gel
electrophoresis 1%. Obtainable DNA were cut by restriction enzymes endonuclease
EcoRI and BamHI. Bacteria proteins were compared with the citrus plan proteins.
Protein molecules which were yield from CVPD
rgene cloning in the Escherichia
coli JM109more or less 17 kDa its large. The similar large molecules exist at the
sample proteins which were isolated from T. trifolia (Jeruk kingkit) .
Kata kunci: Bakteri Escherichia coli JM109, CVPD, Jeruk kingkit., T. trifolia.
PENDAHULUAN
Di Indonesia penyakit yang menimbulkan kerusakan dan kerugian tanaman jeruk yang paling penting
adalah CVPD (Setiawan dan
Trisnawati, 1999).
CVPD (Citrus Vein Phloem
Degeneration) merupakan penyakit
terpenting dan penyebab utama
kehilangan hasil perkebunan jeruk di hampir semua negara terutama Asia dan Afrika. CVPD disebabkan oleh bakteri gram negatif Liberobacter
asiaticum yang ditularkan serangga
vektor Diaphorina citri (Subandiyah, 2001) .
Gejala khas CVPD adalah daun terlihat menguning dengan tulang-tulang daun menjadi lebih hijau. Daun tidak dapat berkembang dengan baik sehingga daun menjadi lebih kecil, buah menjadi kecil-kecil, keras, dan kulitnya menjadi menguning. Daun
tanaman yang terserang CVPD
mengalami klorosis dengan gejala menyerupai defisiensi unsur nitrogen, seng, mangan dan zat besi (Setiawan dan Trisnawati, 1999).
Penyebab penyakit CVPD
awalnya diperkirakan adalah virus.
penguasaan ilmu dan teknologi serta
penelitian lebih lanjut tentang
penyebab penyakit CVPD, diketahui
bahwa penyebab penyakit CVPD
adalah bakteri (Sandrine et al., 1996). Berdasarkan analogi terhadap MLO, penyebab CVPD disebut BLO (bacterium like organism) atau GO (greening organism) (Nakashima et
al., 1996).
Kondisi lingkungan pertanaman jeruk di Indonesia yang beragam, diduga dapat menyebabkan mutasi dan variasi genetik pada bakteri CVPD, karena mutasi dan variasi genetik pada makhluk hidup dapat
dipengaruhi lingkungan (Gardner,
1991), sehingga pengendalian CVPD
dilakukan terhadap vektor dan
patogen. Pengendalian vektor
dilakukan dengan menggunakan
insektisida dan pengendalian hayati. Pengendalian patogen pada pohon terinfeksi dilakukan dengan injeksi tanaman dengan antibiotik seperti tetrasiklin hidroklorida, pemotongan
bagian tanaman bergejala,
pembongkaran tanaman sakit dan menggantinya dengan tanaman sehat (Da Graca, 1991).
Semua tanaman jeruk budidaya rentan terhadap serangan penyakit CVPD. Berbagai usaha pengendalian telah dilakukan tetapi belum memberi harapan yang memadai, salah satu
pendekatan baru dalam usaha
pengendalian penyakit CVPD adalah upaya pendekatan secara genetik
yaitu dengan mengisolasi dan
mengklon gen ketahanan terhadap CVPD (Wirawan & Subandiyah, 2000). Fragmen DNA tersebut diklon dalam plasmid vektor pUC18 dan dipelihara dalam sel E. coli JM109. Klon plasmid rekombinan itu disebut pWR27 (Wirawan et al., 1998).
Jeruk kinkit (Triphasia trifolia) berasal dari Cina. Di Indonesia di tanam di pekarangan mempunyai daun majemuk ganda tiga, anak daun
berbentuk bulat telur, tepinya
beringgit, pada ketiak daun terdapat duri lurus, agak panjang, bunga
berwarna putih berbau harum. Buah buni, berongga tiga masing-masing berisi satu biji pipih (Anonim, 1988).
Hasil penelitian Wirawan &
Subandiyah (2000) menunjukkan
bahwa tanaman jeruk kinkit
menunjukkan tanda potensial sebagai
tanaman yang tahan terhadap
serangan penyakit CVPD, sedangkan jeruk siam tidak tahan CVPD.
Beberapa jenis tanaman daun jeruk terserang CVPD dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Beberapa Jenis Daun Jeruk
a. Daun jeruk s iam ters era ng C VPD (s akit)
b . Daun jer uk s ia m tid a k
ters erang C VPD (s ehat) c. Daun jeruk kink it
Bakteri Escherichia coli
digunakan dalam kloning sebagai
organisme inang untuk rekombinan molekul DNA. Salah satu langkah
dalam kloning adalah pemulihan
vektor. Vektor adalah wahana dimana DNA asing dipindahkan ke organisme inang baru dan dapat diekspresikan dari DNA asing di dalam inang baru (Brown, 1991).
Molekul DNA sel E. coli hampir 1000 kali lebih panjang dari selnya sendiri dan karenanya harus betul-betul berlipat untuk dapat masuk ke dalam badan inti yang biasanya berukuran 1 mm. Dinding luar sel E.
coli dilapisi oleh selongsong atau
kapsul yang terbentuk dari senyawa berlendir (Sambrook et al., 2001).
Bakteri E. coli biasanya hidup pada usus pencernaan manusia dan
hewan berdarah panas.
Pertumbuhannya membutuhkan zat makanan berupa unsur bahan organik seperti karbon, hidrogen, nitrogen,
fosfor, belerang, oksigen, ion anorganik seperti kalium, natrium, besi, magnesium, kalsium klorida, dan vitamin. Kebutuhan gizi dan
sumber-sumber energi metabolik pada
berbagai bakteri sangat beragam. Bakteri yang sedang tumbuh salah satu unsur tersebut harus ada. Ciri khas bakteri E. coli antara lain kemampuan perlekatan pada sel inang dan invasi sel pada jaringan inang (Jawetz et al., 1996).
Faktor pertumbuhan adalah
suatu senyawa organik yang harus ada dalam sel supaya sel tersebut dapat
tumbuh, tetapi sel tidak dapat
mensintesisnya. Faktor-faktor yang
harus diperhatikan selama
pertumbuhan bakteri E. coli adalah zat makanan, pH, suhu, udara, serta adanya ion-ion anorganik (Sambrook
et al., 2001).
Gambar 2. Kerangka Konsep Penelitian
MATERI DAN METODA
Penelitian ini nenggunakan
metode survei dan test yang
dilakukan terhadap obyek dan
penelitian. Adapun rancangan
prosedurnya dibuat sebagai berikut ini :
1. Pengambilan sample terhadap daun jeruk kinkit dan daun jeruk siam.
2. Dilakukan uji di labolatrium bioteknologi pertanian jurusan hama dan penyakit tumbuhan fakultas pertanian universitas Udayana Denpasar .
3. Dari hasil labolatrium kita
dapat mengetahui bahwa daun jeruk kinkit tahan terhadap serangan CVPD
PEMBAHASAN Pembiakan Bakteri
Hasil pembiakan bakteri E.
coli JM109 yang membawa gen CVPDr
yang diklon pada pUC18 (pWR27) dan
pUC18 yang dipelihara pada sel E. coli
JM109 dapat terlihat dengan
tumbuhnya koloni pada media LB agar yang mengandung 100 ppm ampicillin.
Koloni-koloni yang tumbuh
merupakan gen CVPDr yang diklon
pada pUC18 dalam sel E. coli JM109 (pWR27). Bakteri tersebut membawa plasmid yang menyandi gen tahan
terhadap ampicillin. Koloni-koloni
yang tumbuh merupakan pUC18 yang
dipelihara pada sel E. coli JM109.
pUC18 merupakan vektor kloning
membawa paling sedikit satu gen yang
memberikan resistensi terhadap
ampicillin pada sel tuan rumah dan seleksi untuk transformasi dengan menanam sel pada medium agar yang mengandung ampicillin (Brown, 1991). Bakteri dapat ditumbuhkan
tanpa banyak kesulitan karena
campuran nutrien penting yang
seimbang pada konsentrasi yang tepat dan penggunaan antibiotik yang sesuai
tumbuh. Bakteri E. coli adalah bakteri
berbentuk batang dengan ukuran
panjang 1 – 3 mm serta lebar 0,4 – 0,7 mm, bersifat gram negatif, tidak
berkapsul, dapat bergerak aktif
karena mempunyai flagela peritrik,
bersifat aerob. Suhu untuk
pertumbuhan berkisar 40C-460C
dengan suhu optimum 370C.
Sedangkan pH optimum untuk
pertumbuhan adalah 7,0 – 7,5
(minimum 4,0 dan maksimum 8,5). Bakteri E. coli relatif peka terhadap suhu dan pemanasan (Jawetz et al., 1996).
Isolasi DNA Plasmid Bakteri
Hasil isolasi DNA plasmid
bakteri E. coli JM109 yang
mengandung gen CVPDr yang diklon
pada pUC18 (pWR27) dan pUC18 yang
dipelihara pada sel E. coli JM109 dapat terlihat dengan terbentuknya pita DNA pada elektroforesis 1 % agarose.
Hal ini menunjukkan bahwa memisahnya kedua jenis DNA yaitu DNA plasmid dan DNA kromosom
bakteri yang besar jumlahnya
terdapat dalam sel. Plasmid yang paling besar ukurannya hanya 8%
ukuran kromosom E. coli dan
kebanyakan plasmid lebih kecil dari ukuran tersebut, oleh karena itu
pemecahan sel harus dilakukan
dengan pelan-pelan untuk mencegah
pemecahan DNA bakteri secara
menyeluruh (Brown, 1991).
Kebanyakan plasmid terdapat dalam bentuk molekul DNA berunting
rangkap. Kedua unting DNA
merupakan lingkaran utuh,
molekulnya digambarkan sebagai CCC (Covalenthy Closed Circular) DNA
yang berarti lingkaran tertutup
kovalen. Covalenthy Closed Circular DNA bila satu unting yang utuh molekulnya digambarkan sebagai OC DNA atau lingkaran terbuka (open
circles), sedangkan DNA kromosom
lebih longgar dan mempunyai ukuran yang
sangat panjang, sehingga mudah
dipisahkan sewaktu isolasi.
Covalenthy Closed Circular (CCC) DNA
yang mempunyai struktur terteir yang tahan terhadap denaturasi maka utas tunggal akan melekat bersama lebih erat, sehingga berasosiasi kembali
lebih cepat sehingga mudah
terdenaturasi, oleh karena itu bila
denaturasi diterapkan maka DNA
kromosom akan terdenaturasi dan berpresipitasi sehingga DNA plasmid akan tetap utuh (Sambrook et al., 2001).
Pemotongan DNA Plasmid dengan Enzim Endonuklease Restriksi
Hasil pemotongan DNA
plasmid bakteri E. coli JM109 yang
mengandung gen CVPDr yang diklon
pada pUC18 (pWR27) dan pUC18 yang dipelihara pada sel E. coli JM109 dengan enzim endonuklease restriksi
Pemberian enzim endonuklease
restriksi untuk memotong DNA
menjadi fragmen-fragmen dengan
panjang yang berbeda-beda. Enzim
endonuklease restriksi akan
menempati suatu molekul DNA dan bergeser sepanjang heliks DNA hingga
mengenali urutan pasangan basa
spesifik untuk berhenti bergeser,
kemudian enzim endonuklease
restriksi akan memotong DNA pada
urutan pasangan basa spesifik.
Tempat urutan pasangan basa spesifik
ini disebut juga situs restriksi.
Pemotongan DNA dengan enzim
endonuklease restriksi mengenal
urutan spesifik pada molekul DNA yang dipotong. Enzim Eco RI yang disintesis oleh E. coli mempunyai urutan pengenal GAATTC. Enzim Bam
HI yang disintesis oleh Bacillus
amynololique faciens mempunyai urutan pengenal GGATCC. Ujung-ujung hasil pemotongan dengan enzim endonuklease restriksi Eco RI dan Bam HI . Ujung-ujung Pemotongan Enzim Eco RI dan Bam HI
Pemotongan molekul DNA
dengan tepat perlu pada
pembentukan DNA rekombinan
(kloning gen). Vektor dipotong posisi tunggal untuk membuka lingkaran
sehingga molekul DNA baru dapat diinsersikan. Vektor harus dipotong
pada posisi yang sama sebab
pemotongan secara random tidak memuaskan DNA pUC18 (Sambrook et
al., 2001).
Tempat pemotongan enzim
restriksi pada molekul DNA,
meninggalkan bekasnya berupa
tonjolan ujung 5’. Ujung-ujung ini dapat mengadakan ikatan hidrogen dengan ujung DNA lainnya yang dipotong oleh enzim yang sama.
Potongan enzim restriksi atau
fragmen restriksi yang ujungnya tidak rata atau menonjol dinamakan ujung
lengket, tetapi ada pula enzim
endonuklease restriksi yang
memotong membentuk ujung tumpul (Brown, 1991). DNA pUC18 (Sambrook
et al., 2001)
Analisis Total Protein Bakteri
Analisis total protein bakteri
dilakukan dengan teknik
elektroforesis menggunakan gel
poliakrilamid sebagai pemisah. Gel
poliakrilamid dapat memisahkan
protein berdasarkan massanya.
Protein dalam gel dapat dilihat
setelah diwarnai dengan biru
coomassie yang ditandai oleh adanya pita. Hasil analisis protein bakteri E.
coli JM109 yang mengandung gen
CVPDr yang diklon pada pUC18
(pWR27) dan pUC18 yang dipelihara
pada sel E. coli JM109
Berdasarkan analisis protein
tersebut, dapat terlihat bahwa
protein khas terlihat lebih kurang 17
kDa yaitu pada CVPDr yang diklon
pada pUC18 dalam sel E. coli JM109 (pWR27 ,sedangkan pada pUC18 tidak terlihat adanya gen tahan CVPD
Hal ini disebabkan karena
bakteri patogen mempunyai
kemampuan perlekatan pada sel
kloning, dimana untuk pertumbuhan bakteri membutuhkan zat molekul berupa unsur bahan organik yaitu karbon, hidrogen, nitrogen, fosfor,
belerang, oksigen, ion anorganik
seperti kalium, natrium, besi,
magnesium, kalsium dan vitamin
(Jawetz et al., 1996).
Analisis Total Protein Bakteri dengan Total Protein Daun Jeruk Kinkit dan Jeruk Siam
Analisis total protein bakteri dengan total protein daun jeruk kinkit dan daun jeruk siam dilakukan dengan teknik elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sebagai pemisah. Gel
poliakrilamid dapat memisahkan
protein berdasarkan massanya.
Protein dalam gel dapat dilihat
setelah diwarnai dengan biru
coomassie yang ditandai oleh adanya pita. Hasil analisis protein bakteri dengan protein tanaman jeruk kinkit dan daun jeruk siam dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Analisis Total Protein Bakteri dengan Jeruk Kinkit dan Jeruk
Siam
Ket: M (Marker Protein) Lajur 1,2 pWR27 Lajur 3,4 Jeruk Kinkit, Lajur 5 jeruk siam sehat, Lajur 6,7 jeruk siam sakit. Tanda panah menunjukkan pita protein tahan CVPD.
Protein khas terdapat lebih kurang pada 17 kDa yang merupakan protein tahan terhadap CVPD yang
terdapat pada jeruk kinkit dan
pWR27. Hal ini disebabkan jeruk kinkit mempunyai ketahanan terhadap
CVPD. Perbedaan pembentukan
molekul protein tersebut
kemungkinan merupakan reaksi
molekuler tanaman, pada jeruk siam sehat maupun sakit tidak terlihat adanya pita lebih kurang pada 17 kDa sebab jeruk siam tidak memiliki
penyakit CVPD. Akibatnya protein
transpot ion sel tanaman akan
terganggu yang mengakibatkan sel tanaman kekurangan mineral atau unsur hara tertentu (Setiawan dan Trisnawati, 1999).
Jeruk siam yang terserang
CVPD agar protein dapat berfungsi
dengan baik maka protein yang
berperan sebagai protein transpot
akan mengikat senyawa spesifik.
Menurut Toha (2001) suatu senyawa yang akan ditranspot harus berikatan
terlebih dahulu dengan protein
transpot spesifik sehingga nantinya senyawa tersebut akan mampu dibawa melewati membran.
KESIMPULAN
1. Klon gen CVPDr dapat
diekspresikan dalam sel E. coli JM109.
2. Molekul protein yang dihasilkan
dari klon gen CVPDr dalam sel E.
coli JM109 mempunyai besar molekul lebih kurang 17 kDa.
3. Molekul protein dengan besar
molekul yang sama juga ditemukan pada sampel protein yang diisolasi dari jeruk kinkit.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 1988. Ensiklopedi Indonesia. PT. Ichtiar Baru – Van Hoeve Jakarta.
Brown, T.A.1991. Pengantar Kloning
Gen. Alih Bahasa : Soemiati,
A.M. Yayasan Essentia Medika. Yogyakarta.
Da Graca, J.V. 1991 Citrus greening
disease. Phytopathol 29 :
109-36. Departemen of Microbiology and Plant Pathology. University of Natal. Platermaritzburg south Africa.
Gardner, E.J 1991. Principles of Genetic. New York : John Wiley & Sons. Jawetz, E. J. L. Melnik, E. A. Adelberg,
G.F. Brooks, J. S. Butel , and L.
N. Omston. 1996 Medika
Microbiology. Edisi 20. Buku
Kedokteran EGC. Jakarta.
Setiawan, A. I. & Y. Trisnawati. 1999.
Peluang Usaha dan Pembudidayaan Jeruk Siem.
Penebar Swadaya. Jakarta. Sambrook, J., E. F. Miniatis, T. 2001.
Molecular Cloning. A
Laboratorium Manual. 3nd. ED.
Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York.
Subandiyah, S. 2001. Bioteknologi untuk
identifikasi dan deteksi patogen tumbuhan. Makalah Seminar Regional VPFI Komda Jateng dan
DIY di Universitas Wangsa
Menggala, Yogyakarta. 3 Pebruari 2001.
Tjitrosoepomo, G. 1981. Taksonomi
Tumbuhan. Bhratara Karya Aksara. Jakarta.
Toha. A. A. H. 2001 Deoxyribo Nucleac
Acid. Keanekaragaman, Ekspresi, Rekayasa dan Efek Pemanfaatannya. Seri Biokimia.
Penerbit Alfabeta. Bandung. Wirawan, I. G. P. 1996. Molekular
Mechanism of Grown Gall Tumor Induction by
Agrobacterium Tumefaciens.
Graduate Course of Biochemical regulation, Graduate Scholl of
Agriculture Sciences Nagoya
University, Nagoya Japan.
Wirawan, I. G. P., N. Arya., S. Subandiyah. 1998. Isolasi Loci
Resisten terhadap CVPD dengan Metode Transformasi Menggunakan Agrobacterium
Tumefaciens. Laporan Riset
Unggulan Terpadu V. Kantor Menteri Negara Riset Teknologi. Dewan Riset Nasional. Jakarta. Wirawan, I. G. P., & S. Subandiyah. 2000.
Penelitian Aspek Biologi Molekul Penyakit CVPD Tanaman Jeruk. Seminar Sehari
Perhimpunan Fotopatologi
