BAB III
METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara deskriptif meliputi pengambilan dan pengolahan sampel,pembuatan simplisia, isolasi senyawa fukoidan, identifikasi senyawa fukoidan hasil isolasi dengan menggunakan spektrofotometer UV dan FTIR serta pengujian sitotoksik terhadap larva Artemia salina Leach.dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dan dianalisis dengan model analisis probit.
3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, desikator, lemari pengering, lemari pendingin (Toshiba), oven listrik (Stork), penangas air, kain flannel,termometer, blender (Panasonic MX-101SG1), spatula, kaca arloji, botol timbang dangkal bertutup, neraca kasar (Salter\And EW3000B), neraca analitis (Vibra AJ), sentrifugasi (Hitachi CF16RXII), spektrofotometer UV dan FTIR (Shimadzu), pipet tetes, aluminium foil, vial, bejana penetasan telur Artemia salina Leach, lampu 14 watt (Hannochs). 3.1.2 Bahan
3.2 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan 3.2.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain. Umur tumbuhan yang diambil tidak diperhitungkan.Tumbuhan yang digunakan adalah talus rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard yang diperoleh dari pantai Poncan,
Kotamadya Sibolga, Provinsi Sumatera Utara. 3.2.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Pusat Penelitian Oseanografi, Jakarta, Indonesia oleh Windy (2016).Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman41.
3.2.3 Pengolahan bahan tumbuhan
3.3 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan April hingga November di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.4 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan pemeriksaan bentuk, ukuran, warna, bau dan rasapada rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard.
3.5 Pembuatan Pereaksi
Proses pembuatan pereaksi meliputi pereaksi asam klorida 1 N dan perekasi asam klorida 0,1 N.
3.5.1 Pereaksi asam klorida 1 N
Sebanyak 85 ml asam klorida pekat cukupkan dengan air hingga 1000 ml (Ditjen POM RI., 1995).
3.5.2 Pereaksi asam klorida 0,1 N
Diencerkan 8,5 ml asam klorida pro analis dicampurkan dengan akuades dan dicukupkan hingga 1000 ml (Ditjen POM RI., 1995).
3.6 Isolasi Senyawa Fukoidan
suhu 100 oC selama 4 jam sambil dilakukan pengadukan setiap 10 menit. Disaring dengan menggunakan kain flanel lalu diperas, diperoleh filtrat.Filtrat yang diperoleh disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Endapan dipisahkan dari filtrat dengan cara enap tuang. Selanjutnya filtrat ditambah etanol 96% dengan perbandingan (1:1) hingga terbentuk endapan, dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Endapan dikumpulkan di atas kaca arloji dan dikeringkan di dalam oven pada suhu 50oC (Junaidi, et al., 2009).Bagan kerja prosedur isolasi senyawa fukoidan dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 43.
3.7 Penetapan Susut Pengeringan
Sebanyak 1 g serbuk isolatfukoidan ditimbang dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang telah dipanaskan pada suhu 105oC selama 30 menit dan telah ditara.Serbuk diratakan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol hingga merupakan lapisan setebal 5-10 mm. Kemudian dimasukkan ke dalam oven, tutupnya dibuka dan dikeringkan pada suhu 105oC hingga bobot tetap.Sebelum setiap pengeringan, dibiarkan botol dalam keadaantertutup dingin dalam desikator hingga suhu kamar. Susut pengeringan dihitungterhadap bahan awal (Ditjen POM RI, 1995).
3.8 Identifikasi Senyawa Fukoidan
3.8.1 Analisis secara spektrofotometri UV
Senyawa fukoidan hasil isolasi diidentifikasi secara spektrofotometri UV. Prosedur kerja dilakukan dengan menimbang 20 mg senyawa isolat fukoidan, dilarutkan dengan asam klorida 0,1 N dimasukkan kedalam labu tentukur 25 ml, lalu dicukupkan hingga garis tanda. Diukur serapannya pada bilangan gelombang 200-400 nm. Kemudian dibandingkan dengan senyawa baku fukoidan.
3.8.2 Analisis secara spektrofotometri FTIR
Isolat fukoidan diidentifikasi secara spektrofotometri FTIR. Prosedur kerja dilakukan dengan cara mencampurkan 1 mg serbuk isolat fukoidan dengan 10 mg KBr digerus di dalam mortar, ditekan hingga diperoleh pelet kemudian dimasukkan ke dalam alat spektrofotometer FTIR,diukur serapannya pada bilangan gelombang 4000-400 cm-1.Kemudian dibandingkan dengan senyawa baku fukoidan.
3.9 Pengujian Sitotoksik
Pengujian dilakukan terhadap fukoidan hasil isolasi dari talus rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard menggunakan larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test.
3.9.1 Pembuatan air laut buatan
3.9.2 Penetasan telur Artemia salina Leach
Disiapkan bejana penetasan yang mempunyai dua bagian bersekat.Sekat dalam wadah tersebut di lubangi agar larva dapat berpindah dari tempat yang gelap ke tempat yang terang.Masukkan air laut buatan kedalam bejana.Telur Artemia salinaLeach ditaburkan secara berhati-hati (Indiastuti, et al., 2008). Bagian wadah yang berisi telur tersebut ditutup dengan aluminium foilsedangkan bagian wadah yang tidak ditempati telur diterangi dengan sinar lampu 14 watt untuk menghangatkan suhu dalam penetasan. Setelah 48 jam, diambil larva udang yang akan diuji dengan pipet tetes (Juniarti dan Yuhemita, 2009).
3.9.3 Pengujian brine shrimp lethality test
y = a + bx
juga telah dilakukan. Dimasukkan 10 ekor larva Artemia salina Leach ke dalam vial dan dicukupkan sampai 5 ml air laut buatan tanpa penambahan isolat. Data dianalisis dengan metode analisis probit untuk menentukan LC50.Bagan uji
sitotoksik dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 44.
3.10 PerhitunganLC
Uji sitotoksik dilakukan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test menggunakan larva Artemia salina Leach terhadap larutan isolat fukoidan sehingga diperoleh suatu data yang kemudian diolah dengan menggunakan model analisis probit untuk menentukan nilai LC
50
Pengukuran dilakukan dengan menghitung jumlah Artemia salina Leach yang mati sebanyak 50 % dari total larva uji (10 ekor pada vial). Kemudian nilai LC
50.
50
a. Rumus persen kematian
dihitung dengan memasukkan angka probit (50 % kematian larva uji).Efek sitotoksik dihitung dari persen kematian larva Artemia salina Leach dan persamaan regresi linear (Rahma, et al., 2013).
b. Persamaan regresi linier.
Keterangan: y = Nilai probit x = log konsentrasi
a = Intercept (garis potong)
x100%
yang mati, maka persen kematian ditentukan dengan rumus Abbot:
Keterangan :
T = jumlah larva uji yang mati K = jumlah larva kontrol yang mati 10 = jumlah larva uji
Perhitungan LC50 fukoidan hasil isolasi dari talus rumputSargassum
ilicifolium (Turner) C. Agard dapat dilihat pada lampiran 11, halaman 56.
3.11Analisis Data Sitotoksik
Ada banyak cara untuk menentukan nilai LC50. Salah satu cara yaitu
dengan metode probit. Untuk menghitung LC50 berdasarkan metode probit,
berikut merupakan langkah pembuatan perhitungan LC50
1. Mempunyai tabel probit
, yaitu :
2. Menentukan nilai probit dari % kematian tiap kelompok hewan uji 3. Menentukan log dosis tiap-tiap kelompok
4. Menentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log dosis, y = a+bx
5. Masukkan nilai 5 (probit 50% kematian hewan coba) pada persamaan garis lurus, pada nilai y. Nilai LC50
Ekstrak dikatakan bersifat toksis jika harga LC
dihitung dari nilai antilog x pada saat y = 5.
50< 1000 ppm, sedangkan untuk
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1Hasil Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan dilakukan di Pusat Penelitian Oseanografi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Jakarta, Indonesia adalah rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard, suku Sargassaceae. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 41.
4.2 Hasil Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan karakterisasi rumput laut Sargassum ilicifolium (Turner) C. Agard secara makroskopik dilakukan untuk memperoleh identitas simplisia.Hasil pemeriksaan makroskopik rumput laut coklatyaitu rumput laut coklat memiliki warna coklat, mempunyai bau khas, daun berbentuk lonjong kecil dengan tepibergerigi, dan batang kecil berwarna coklat.Hasil pemeriksaan makroskopik yang dilakukan terhadap simplisia rumput laut coklat yaitu simplisia berwarna coklat tua.Hasil pemeriksaan makroskopik rumput laut coklat dapat dilihat padaLampiran 5, halaman 45.
4.3Hasil Isolasi Senyawa Fukoidan
4.4. Hasil Penetapan Susut Pengeringan
Penetapan susut pengeringan dilakukan untuk menunjukkan jumlah air yang terkandung dalam senyawa fukoidan.Penetapan susut pengeringan dilakukan untuk memberikan batasan kandungan air yang masih dapat ditolerir untuk menjaga stabilitasnya. Hasil rata-rata penetapan susut pengeringan senyawa fukoidan adalah 19,32%. Perhitungan susut pengeringan isolat senyawa fukoidan dari rumput laut coklat dapat dilihat pada Lampiran 8, halaman 51.
4.5Hasil Identifikasi Senyawa Fukoidan 4.5.1 Identifikasi secara spektrofotometri UV
Identifikasi senyawa isolat fukoidan dan bakufukoidan dilakukan secara Spektrofotometri UV. Spektrum ultraviolet fukoidan hasil isolasi dari rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard memberikan panjang gelombang maksimum 203,81 nm. Kurva serapan dan panjang gelombang maksimum senyawa fukoidan hasil isolasi identik dengan senyawa baku fukoidan. Spektrum ultraviolet dari senyawa isolat dan baku fukoidan dapat dilihat pada Gambar 4.1 dan Gambar 4.2
Gambar 4.2 Spektrum ultraviolet bakufukoidan
4.5.2 Identifikasi secara spektrofotometri FTIR
Spektrum inframerah senyawa isolat fukoidan dari rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard dan bakufukoidan dapat dilihat pada Gambar 4.3 dan Gambar 4.4
Gambar 4.4. Spektrum inframerah baku fukoidan
2014). Bilangan gelombang 1072,42 cm-1 pada baku fukoidan menunjukkan vibrasi regang gugus S=O simetris. Pada fukoidan isolat, bilangan gelombang 1022,27 cm-1 menunjukkan adanya gugus C-O, sedangkan pada baku fukoidan terletak pada bilangan gelombang 1041,56 cm-1. Bilangan gelombang dibawah 1500 cm-1
Berdasarkan puncak serapan yang diperoleh dibandingkan dengan baku pembanding menunjukkan bahwa bahan yang diisolasi dari talus rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard adalah senyawa fukoidan. Pergeseran spektrum disebabkan karena fukoidan isolat dan baku diperoleh dari spesies rumput laut coklat yang berbeda Puncak serapan senyawa isolat fukoidan dan baku fukoidan dapat dilihat pada Tabel 4.1.
merupakan daerah sidik jari (finger print). Kegunaan terpenting dari daerah sidik jari (finger print) setiap senyawa memberikan pola yang berbeda pada daerah ini (Yadav, 2005).
Tabel 4.1 Hasil spektrofotometri FTIR senyawa isolat dan baku fukoidan Sargassum ilicifolium (Turner) C. Agard
No Bilangan gelombang (cm
-1
Gugus Fungsi )
Isolat Fukoidan Baku Fukoidan
1 3421,72 3421,72 Gugus O-H
3.6 Hasil Uji Sitotoksik
rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard pada konsentrasi 10, 100, dan 1000 µg/ml. Selain itu, dibuat kontrol negatif berupa air laut dan larva tanpa penambahan isolat. Hal ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh air laut maupun faktor lain terhadap kematian larva. Sehingga dapat dipastikan bahwa kematian larva hanya karena penambahan isolat. Percobaan ini dilakukan dengan 3 kali pengulangan dengan tujuan agar mendapat data yang lebih baik dan lebih akurat.
Berikut adalah data persen kematian larva Artemia salina Leach dengan pemberian isolat fukoidan rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard.
Tabel 4.2 Persen kematian larva Artemia salina Leach dengan pemberian isolat fukoidan
Isolat fukoidan Kematian larva Artemia salina Leach Konsentrasi (µg/ml) P1 P2 P3 % kematian
10 1 1 2 13.33
100 3 2 3 26.67
1000 3 2 5 33.33
Kontrol negatif (air laut) 0 0 0 0
Hasil Artemia salina Leach yang mati karena penambahan isolat fukoidan yang telah dilakukan dengan 3 kali pengulangan. Konsentrasi 10 µg/ml menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach 13,33%, pada konsentrasi 100 µg/ml persen kematian larva 26,67%, pada konsentrasi 1000 µg/ml persen kematian larva 33,33% dan kontrol negatif persen kematian larva adalah 0%.
larva yang digunakan tiap konsentrasi. Persentase kematian didapat dengan mengalikan rata-rata kematian dengan 100.
Tabel 4.2 menunjukkan bahwa adanya hubungan antara konsentrasi penambahan isolat fukoidan dengan total kematian larva. Semakin tinggi konsentrasi yang diberikan akan meningkatkan kematian larva. Artemia salina Leach yang digunakan pada percobaan yaitu larva yang berusia 48 jam atau berada pada fase instar II-III karena pada usia ini Artemia salina paling sensitif terhadap bahan uji (Hamidi, et al., 2014).
Kematian larva diamati setelah 24 jam pemberian isolat. Berdasarkan kriteria standar larva dikatakan mati apabila larva tidak bergerak selama 10 detik observasi (Krishnakumar, et al., 2007).
Harga LC50 yang diperoleh dari uji sitotoksik senyawa fukoidan hasil
isolasi rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard adalah 13658,4 µg/ml. Ekstrak dikatakan bersifat toksik atau memiliki aktivitas biologi terhadap Artemia salina Leach apabila memiliki harga LC50< 1000 µg/ml (Meyer, et al.,
1982). Harga LC50 menunjukkan bahwa fukoidan hasil isolasi tidak memiliki sifat
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan dapat diperoleh kesimpulan sebagai berikut:
a. Senyawa fukoidan dari isolasirumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard mempunyai persen rendemen 3,61%.
b. Senyawa fukoidan hasil isolasi dari rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard pada konsentrasi 10 µg/ml, 100 µg/ml, dan 1000 µg/ml memiliki LC50 sebesar 13658,4 µg/ml, sehingga tidak memiliki sifat
sitotoksik terhadap Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test.
5.2 Saran
