Penggunaan Gen GH sebagai Marka Molekuler DNA Gurami, Osphronemus goramy dalam Pengembangan Teknologi Surrogate Broodstock | Achmad | Jurnal Perikanan Universitas Gadjah Mada 7 35 1 PB

(1)

157 Jurnal Perikanan (J. Fish. Sci.) XI (2): 157-160 ISSN: 0853-6384

PENGGUNAAN GEN GH SEBAGAI MARKA MOLEKULER DNA GURAMI,

Osphronemus goramy DALAM PENGEMBANGAN TEKNOLOGI SURROGATE BROODSTOCK

THE USE OF GH GENE AS DNA MOLECULAR MARKER OF GIANT GOURAMY, Osphronemus goramy TOWARDS DEVELOPMENT OF SURROGATE BROODSTOCK

TECHNOLOGY

Marlina Achmad1, Alimuddin2*, Odang Carman2, Harton Arfah2 dan Muhammad Zairin2

1_{Jurusan Perikanan, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, Universitas Hasanuddin, Makassar, Sulawesi Selatan.} 2_{Departmen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680.}

*Penulis untuk korespondensi, E-mail: [email protected]; [email protected]

Abstract

The technology of ish germ cell transplantation had been established to create broodstock systems by which

a target offspring can be produced from a surrogate parent. Donor cell for transplantation is derived from

transgenic ish carrying green luorescent protein gene as a marker to distinguish the donor from recipient

cell. In this study, an alternative technique was developed for identifying gouramy-derived donor cell and Nile

tilapia as recipient by PCR ampliication method using growth hormone (GH) gene as a molecular marker. Speciic primer for GH gouramy was designed by using Genetyx version 7 software. β-actin gene was used as an internal control of DNA loading. The result showed that a speciic PCR ampliication product of 340 in

length was obtained from DNA template of gouramy, while no PCR product from Nile tilapia. The minimum concentration of genomic DNA of gouramy mixed with a 700 ng/µl of Nile tilapia that could be detected by

PCR was 1 ng/µl. Thus, PCR method with speciic GH primer may be useful to detect the incorporation of

donor cell in recipient gonad towards development of surrogate broodstock technology.

Key words: giant gouramy, GH, molecular marker, PCR, transplantation

Pengantar

Teknologi transplantasi sel germinal ikan telah dikembangkan baru-baru ini untuk merekayasa produksi benih ikan melalui induk “semang” atau surrogate broodstock (Okutsu et al., 2006a). Teknologi induk semang tersebut dilakukan dengan cara mentransplantasikan sel germinal berupa primordial germ cells (PGC) (Takeuchi et al., 2003) atau sel spermatogonia (Okutsu et al., 2006b) ke dalam rongga perut larva ikan resipien, selanjutnya sel donor berdiferensiasi menjadi telur atau sperma. Pemijahan antar ikan semang/resipien yang membawa sperma dan telur yang berkembang dari sel donor, akan menghasilkan ikan target (Okutsu et al., 2006a). Keberhasilan teknologi ini telah ditunjukkan pada ikan trout pelangi/rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) menggunakan induk semang salmon masu (Oncorhynchus masou) (Takeuchi et al., 2004). Teknik ini berpotensi digunakan untuk merekayasa produksi benih ikan budidaya di Indonesia, khususnya ikan yang matang gonad relatif lambat seperti gurami (Osphronemus goramy).

Gurami merupakan salah satu jenis ikan air tawar yang memiliki harga jual relatif tinggi dan pengembangan

usaha budidayanya telah menjadi salah satu fokus revitalisasi perikanan budidaya 2009-2025 (Nurdjana, 2008). Waktu pencapaian matang gonad pertama kali pada gurami cukup lama, yakni sekitar 2-4 tahun, sehingga dibutuhkan waktu relatif panjang untuk memproduksi induk gurami.

Aplikasi teknologi transplantasi sel germinal gurami pada ikan semang yang cepat matang gonad diduga dapat mengatasi keterlambatan gurami matang gonad dan selanjutnya dapat mendukung

peningkatan produksi benih gurami secara signiikan

di masa mendatang.

Identiikasi sel donor dalam individu ikan resipien

umumnya dilakukan dengan cara mengamati pendaran sel yang mengekspresikan gen GFP (green luorescent protein) menggunakan mikroskop fluoresens. Sel donor tersebut diperoleh dari ikan transgenik (Yoshizaki et al., 2000). Saat ini, gurami transgenik yang memiliki sel germinal mengeksrepsikan gen GFP belum tersedia. Karena waktu matang gonad gurami secara alamiah cukup lama, maka waktu yang dibutuhkan untuk membuat gurami transgenik juga panjang. Selain itu, metode

(2)

Achmad et al., 2009 158

belum diketahui. Ketersediaan mikroskop luoresens

yang masih terbatas di Indonesia juga menjadi salah satu kendala penggunaan sel berpendar sebagai donor. Oleh karena itu, pada penelitian ini

dikembangkan metode alternatif untuk identiikasi sel

donor menggunakan gurami bukan transgenik. Sistem penanda sel germinal donor yang berasal dari ikan bukan transgenik telah dikembangkan meggunakan PKH26. Sel donor akan berpendar merah bila terpapar dengan sinar UV, sehingga dapat dibedakan dengan sel endogenus ikan resipien. PKH26 telah digunakan dalam penelitian transplantasi sel testikular ikan mulloway Argyrosomus hololepidotus pada ikan nibe Jepang Nibea mitsukurii (Takeuchi et al., 2009). Seperti halnya pada sel donor mengekspresikan

gen GFP, identiikasi sel donor yang ditandai dengan PKH26 juga membutuhkan mikroskop luoresens.

Dengan demikian, penggunaan PKH26 juga belum

eisien diaplikasikan di Indonesia.

Pada penelitian ini dikembangkan metode alternatif yang lebih aplikatif yang didukung oleh ketersediaan fasilitas. Metode alternatif yang memungkinkan diaplikasikan saat ini di Indonesia adalah marka molekular DNA, yang dapat dideteksi dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan

primer spesiik bagi ikan donor. Mesin PCR sudah tersebar di seluruh Indonesia. Primer spesiik didisain

dari sekuen gen target ikan donor. Pada gurami, sekuen gen yang tersedia adalah gen penyandi hormon pertumbuhan (growth hormone, GH) (Nugroho et al., 2008). Pada penelitian ini gen GH tersebut dikembangkan sebagai marka molekular pendeteksi DNA gurami yang dicampur dengan DNA nila sebagai pendekatan dalam mendeteksi sel gonad donor dalam individu resipien.

Bahan dan Metode

Disain Primer untuk Marka Molekular

Primer spesifik untuk GH dirancang dengan menyejajarkan (alignment) sekuens GH gurami (Nugroho et al., 2008) dan sekuens GH nila (no. aksesi Bank Gen: M26916) (Gambar 1). Seperti

halnya pada GH, primer β-aktin juga dirancang dengan menyejajarkan β-aktin gurami (Nugroho et al., 2009) dan nila (no. aksesi Bank Gen: AY116536), tetapi primer tersebut didisain sedemikian rupa sehingga mampu anneal dengan sekuens β-aktin gurami dan nila.

Penyejajaran sekuens dilakukan menggunakan program GENETYX versi 7, untuk memperoleh area potensial sebagai primer forward dan reverse sebagai

marka molekular penanda sel gonad gurami. β-aktin

berfungsi sebagai kontrol internal loading DNA dalam

ampliikasi PCR. Sekuens nukleotida primer GH gurami

adalah F1GH (5’-TGTTCTCTGACGGCGTGGTT-3’) dan R1GH (5’-GCAACAAAAAACCACCAG-AAAGAG-3’). Primer forward untuk β-aktin adalah aktin-F (5’-GTGCCCATCT-ACGAGGGTTA-3’), sedangkan primer reverse adalah aktin-R (5’-TTTGAT-GTCACGCACGATTT-3’).

Ekstraksi DNA Genom

DNA diekstraksi dari jaringan sirip menggunakan kit isolasi DNA (Gentra, Minneapolis, USA) sesuai dengan prosedur yang ada. Inkubasi untuk proses lisis sel dilakukan pada suhu 55o_{C selama semalam.}

RNase (4 mg/ml) sebanyak 1,5 µl ditambahkan ke dalam mikrotub berisi sel yang telah terlisis dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37o_{C selama 60}

[image:2.595.97.498.594.726.2]

menit. Protein diendapkan menggunakan protein precipitation solution 100 µl dan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam mikrotub yang berisikan 300 µl isopropanol, dan DNA diendapkan dengan

Gambar 1. Penyejajaran sekuens parsial gen GH gurami (Nugroho et al., 2008) dan nila (no. aksesi Bank Gen:

(3)

159 Jurnal Perikanan (J. Fish. Sci.) XI (2): 157-160 ISSN: 0853-6384

menit. Supernatan dibuang dan selanjutnya pelet DNA dicuci dengan etanol dingin 70% sebanyak 300 µl. Setelah dikeringudarakan, DNA dilarutkan dengan 30 µl ion exchange water.

Konsentrasi DNA genom hasil ekstraksi diukur menggunakan spektrofotometer dengan mesin DNA/RNA calculator (GenQuant, Amersham) pada

panjang gelombang λ260. Konsentrasi DNA genom

hasil ekstraksi dari gurami dan nila masing-masing adalah 1424 dan 760 ng/µl.

Ampliikasi DNA dengan Polymerase Chain Reaction

(PCR)

Ampliikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan menggunakan

PCR dengan primer spesifik GH gurami. Untuk menguji sensitivitas PCR dalam mendeteksi DNA gurami dan nila, dilakukan dengan cara membuat campuran DNA gurami dan nila dengan rasio yang berbeda yaitu 700:700; 600:700; 500:700; 400:700; 300:700; 200:700; 100:700; 50:700; 10:700; 1:700;

0,1: 700 ng/μL.

Total volume untuk reaksi PCR adalah 10 µl, mengandung 1 µl 10x Ex Taq buffer; 1 µl dNTPs mix; 0,05 µL Ex Taq polimerase (Takara Bio, Shiga, Japan); 1 µl DNA cetakan; dan 1 µl masing-masing primer forward dan reverse; sisanya adalah ion exchange water. Program PCR untuk primer spesiik GH adalah pre-denaturasi 94o_{C selama 3 menit; 35 siklus untuk}

denaturasi 94o_{C selama 30 detik,}_annealing₅₈o_C

selama 30 detik, ekstensi 72o_{C selama 1 menit; dan}

ekstensi akhir 72o_{C selama 3 menit. Program PCR}

untuk β-aktin adalah pre-denaturasi 94o_{C selama 3}

menit; 35 siklus untuk denaturasi 94o_{C selama 30}

detik, annealing 59o_{C selama 30 detik, ekstensi 72}o_C

selama 1 menit; dan ekstensi akhir 72o_{C selama}

3 menit. Produk PCR diseparasi menggunakan elektroforesis dengan gel agarosa 0,7%, dan selanjutnya divisualisasi menggunakan sinar UV.

Hasil dan Pembahasan

Primer spesiik adalah primer yang dapat mengenali

sekuens berdasarkan cetakan DNA target, sementara sekuens dengan cetakan DNA dari ikan yang lain tidak dapat dikenali. Seperti ditunjukkan pada Gambar 2 (atas), produk PCR dengan cetakan DNA dari gurami menghasilkan pita dengan panjang sekitar 340 bp,

sedangkan DNA dari nila tidak dapat diampliikasi. Dengan demikian, primer spesiik GH tersebut dapat

menjadi marka molekular untuk membedakan ikan donor dengan ikan resipien dan menjadi alternatif marka molekular untuk mendeteksi sel germinal gurami yang ditransplantasikan. Sebagai kontrol internal loading DNA, primer β-aktin didisain untuk bisa anneal pada gen β-aktin gurami dan nila. Dengan menggunakan DNA yang sama pada proses

PCR menggunakan primer spesiik GH, ampliikasi PCR menggunakan primer β-aktin semuanya

menghasilkan pita DNA dengan panjang sekitar 150 bp (Gambar 2).

Agar sel germinal yang berkoloni dalam gonad individu resipien dapat dideteksi oleh penanda (marka), maka perlu menentukan konsentrasi pencampuran sel donor dan sel resipien. Sebagai pendekatan terhadap pencampuran sel donor dan resipien tersebut, pada penelitian ini dilakukan pencampuran DNA hasil ekstraksi dari gurami dan nila. Hasil pengujian sensitivitas PCR menunjukkan bahwa konsentrasi pencampuran DNA gurami dan nila yang paling rendah yang dapat dideteksi adalah

1:700 ng/μl (Gambar 3). Dengan kata lain, marka molekuler GH mampu mendeteksi DNA gurami 1 ng/μl dalam 700 ng/μl DNA nila. Selanjutnya, semakin kecil

[image:3.595.152.447.619.707.2]

rasio perbandingan konsentrasi pencampuran DNA, maka semakin tipis fragmen DNA yang dihasilkan (Gambar 3).

Gambar 2. Elektroforegram produk PCR dengan primer spesiik GH (atas) dan β-aktin (bawah). M = marka

panjang fragmen DNA (2-log ladder, BioLabs Inc., New England); N1-N3= DNA nila; G1-G4 = DNA gurami.

(4)

Achmad et al., 2009 160

1. Marka GH spesifik dapat dijadikan sebagai penanda untuk mengidentifikasi sel germinal donor (gurami) di dalam gonad resipien (nila).

2. Konsentrasi minimum DNA gurami dalam 700 ng/μl

DNA nila yang dapat dideteksi adalah 1 ng/μl.

Ucapan Terima Kasih

Penelitian ini sebagian didanai dari Grant DIPA IPB No. 50/13.24.4/SPK/BG-PSN/2009.

Daftar Pustaka

Nugroho, E., Alimuddin, A.H. Kristanto, O. Carman, N. Megawati & K. Sumantadinata. 2008. Kloning cDNA hormon pertumbuhan dari gurami (Osphronemus gouramy). J. Ris. Akuakultur 3: 183-190.

Nugroho, E., Alimuddin, A.H. Kristanto & O. Carman.

2009. Kloning promoter β-aktin dari gurami

(Osphronemus gouramy). J. Ris. Akuakultur 4: 23-31.

Nurdjana, M.L. 2008. Roadmap mencapai industri perikanan budidaya yang tangguh di tahun 2025. Forum pemantapan konsep rencana pembangunan jangka panjang perikanan budidaya 2010-2025. Safari Garden Hotel, Bogor, 2-5 Desember 2008.

Okutsu, T., A. Yano, K. Nagasawa, S. Shikina, T. Kobayashi, K. Takeuchi & G. Yoshizaki. 2006a. Manipulation of fish germ cell: visualization, cryopservation and tranplantation. J Reprod Dev 52:685.

Okutsu, T., K. Suzuki, Y. Takeuchi, T. Tekeuchi & G. Yoshizaki. 2006b. Testicular germ cells can colonize sexually undifferentiated embryonic

gonad and produce functional egg in ish. Proc

Natl Acad Sci. USA. 103: 2725-2729.

Takeuchi, Y., G. Yoshizaki & T. Takeuchi. 2003. Generation of live fry from intraperitonally transplanted primordial germ cells in rainbow trout. Biology of Reproduction 6: 1142-1149.

Takeuchi, Y., G. Yoshizaki & T. Takeuchi. 2004. Surrogate broodstock produces salmonids. Nature. 430: 629-630.

Takeuchi, Y., K. Higuchi, T. Yatabe, M. Miwa & G. Yoshizaki. 2009. Development of spermatogonial cell transplantation in nibe croaker, Nibea mitsukurii (Perciformes, Sciaenidae). Biology of Reproduction. 81:1055-1063.

Yoshizaki, G., Y. Takeuchi, S. Sakatani & T. Takeuchi. 2000. Germ cell-specific expression of green

luorescent protein in transgenic rainbow trout

[image:4.595.105.501.84.182.2]

under control of the rainbow trout vasa-like gene promoter. Int.J.Dev. Biol. 44: 323-326.

Gambar 3. Elektroforegram produk PCR dengan cetakan DNA campuran dari gurami dan nila. M= marker panjang fragmen DNA (2-log ladder, BioLabs Inc., New England); angka 700 s/d 0,1= konsentrasi DNA gurami yang dicampur dengan 700 ng/µl DNA nila; tanda minus (-) = produk PCR tanpa cetakan DNA.