1
UJI SITOTOKSISITAS DAN EFEK EKSTRAK SPONS LAUT Aaptos suberitoides
TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA (T47D) SECARA IN VITRO
CYTOTOXICITY TEST AND EFFECT OF Aaptos suberitoides EXTRACT ON BREAST
CANCER CELL LINE T47D IN VITRO
Awik Puji D.N1, Sukardiman2, Tri wahyu Ningsih3
1. Department of Biology, Faculty of Mathematic and Natural Science,Sepuluh Nopember Institute of Technology
2. Pharmaceutical Facult, Airlangga University Surabaya
3. Alumni of Department of Biology, Faculty of Mathematic and Natural Science,Sepuluh Nopember Institute of Technology
ABSTRACT
The main purpose of this reseach is to determine the effect of A.suberitoides extract on breast cancer cell line T47D in vitro, that using cytotoxicity test. The activity of A.suberitoides extract to inhibit the growth of cancer cell was determined by MTT assay. After the LC50 calculated, the cell proliferation
kinetic profiles were observed by doubling time test at 24th, 48th, and 72th hours and the IC50 calculated.
Apoptosis studies were done by double staining test using acridine orange and ethidium bromide. The study was used Completely Randomized Design with 5 treatment group, there are group I (treatment), II ( control cell ), III ( positive control), IV (medium control) and V ( cosolven control ), with three times duplication. The concentration of extract that use 7.5 ; 15 ; 30 ; 60 ; 120 ; 240 ; 480 ; 960 and 1920 µg/mL. The concentration of cisplatin, medicine cancer that use 2, 4, 8 dan 16 µg/mL. The data was analyzed with ANOVA and be continued by LSD test.
The result of this research shows that A.suberitoides extract have not cytotoxic activity on breast cancer cell line T47D with LC50 = 528.828 µg/mL at cytotoxicity test with MTT assay based NCI
(National Cancer Institut) criterion, that a compound was said to have sitotoksisitas's effect that poten if that compound have point LC50 ≤ 20 πg/mL. At doubling time test, A. suberitoides extract are not able to
inhibit proliferation of breast cancer cell line T47D with IC50 = 194.487 µg/mL based criterion of
Kamuhabwa et al. (2000), that extract has to assess IC 50 = 100 µg / ml can say to have antiproliferasi's
potencies. And A.suberitoides can induction apoptotic on breast cancer cell line T47D with activity as big as 19.23 %.
Key Words: A.suberitoides, T47D breast cancer cell, Cytotoxicity test PENDAHULUAN
Kanker merupakan penyebab utama kematian diseluruh dunia. Dari 58 juta kematian di seluruh dunia dalam tahun 2005, tercatat 7.6 juta (13%) diantaranya disebabkan oleh kanker (WHO, 2006 dalam Moeljopawiro, 2007). Jenis penyakit kanker yang paling umum dijumpai adalah kanker payudara. Kanker payudara merupakan penyebab utama kematian pada wanita di berbagai belahan dunia.
Spons merupakan salah satu komponen biota penyusun ekosistem terumbu karang yang mempunyai potensi bioaktif. Spons termasuk organisme multiseluler sesil dan merupakan invertebrata laut dengan tingkat taksonomi paling
rendah. (Hooper, 1997). Spons juga menghasilkan metabolit sekunder yang tinggi serta memiliki kemampuan untuk mensintesis bermacam-macam komponen organik seperti polyketida, alkaloid, peptid dan terpene (Sjorgen, 2006 dalam Nurhayati, 2009). Komponen organik tersebut dapat digunakan sebagai bahan obat- obatan (Amir dan Budiyanto, 1996 dalam Nurhayati, 2009). Spons juga menghasilkan toksin dan mempunyai prospek untuk dimanfaatkan dalam bidang pengobatan. Telah dilaporkan pula bahwa sebagian senyawa yang diisolasi dari spons mempunyai aktivitas toksik yang tinggi terhadap makhluk hidup. Isolat dari spons telah dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri, antikanker dan
2 antiparasit (Amir dan Budiyanto, 1996 dalam
Nurhayati, 2009).
Senyawa bioaktif yang dihasilkan spons laut merupakan sumber senyawa –senyawa baru yang memiliki aktivitas farmakologis sehingga dapat digunakan sebagai obat karena memiliki sifat toksik sehingga dapat digunakan untuk membunuh sel kanker (Astuti et al, 2005). Kebutuhan obat baru sebagai senyawa antikanker semakin mendesak, karena obat-obatan yang dipakai selama ini memiliki efektivitas rendah dan harga yang mahal. Pencarian sumber-sumber baru untuk menghasilkan senyawa antikanker terus dilakukan antara lain dari senyawa bioaktif yang dihasilkan organisme laut termasuk spons (Setyowati et al, 2007). Senyawa bioaktif yang akan digunakan sebagai produk farmasi untuk antikanker harus diujikan terlebih dahulu pada hewan percobaan dengan uji sitotoksik. Uji sitotoksik merupakan salah satu pengembangan metode untuk memprediksi keberadaan seyawa yang bersifat toksik pada sel yang merupakan syarat mutlak untuk obat-obat antikanker (Kurnijasanti et al, 2008).
Sebelas spesies spons yang diambil dari daerah perairan Pantai Pasir Putih Situbondo memiliki senyawa bioaktif yang berpotensi sebagai antikanker (Nurhayati et al., 2008). Hasil uji sitotoksisitas dengan metode Brine Shrimp Test (BST) menunjukkan bahwa Aaptos suberitoides memiliki tingkat toksisitas yang paling tinggi dengan nilai LC50 sebesar 134.136 ± 36.611 ppm, sehingga spesies spons A. suberitoides merupakan kandidat yang baik untuk antikanker (Nurhayati et
al, 2008). A. suberitoides dapat menghasilkan
senyawa alkaloid aaptamin (benzo 1,6-naphthyridin yang berpotensi sebagai senyawa
antikanker (Aoki et al., 2006), yang bekerja dengan mekanisme apoptosis (Mayer, 2008) dan antioksidan (Makarchenko, 2004). Setelah tahap praskrining terhadap senyawa antikanker dengan metode BST, maka perlu dilanjutkan dengan uji sitotoksisitas menggunakan sel kanker secara in
vitro. Untuk itu, perlunya uji sitotoksisitas spons
laut A. suberitoides pada sel kanker payudara (T47D), sehingga diketahui potensi sitotoksik spons laut A. suberitoides.
METODE PENELITIAN
Spons A.suberitoides diperoleh dari perairan Pecaron, Pantai Pasir Putih Situbondo, Jawa Timur. Sel T47D yang diujikan merupakan koleksi dari LPPT UGM.
Ekstraksi Spons Laut
Ekstraksi spons dilakukan dengan metode yang dilakukan oleh Harada dan Kamei (1997) dan Horikawa et al (1999). Spons diambil , dipotong-potong menggunakan pisau selanjutnya ditambahkan alkohol pada potongan spons untuk mencegah tumbuhnya jamur. Potongan spons dikeringanginkan selama 1 minggu hingga kering. Selanjutnya potongan spons yang telah kering dihaluskan dengan menggunakan blender sehingga terbentuk ekstrak kasar. Ekstrak kasar yang telah didapat kemudian dimaserasi. Ekstrak kasar spons dimasukkan ke dalam maserator dengan kapasitas 2,5 kg. Ekstrak kasar spons direndam dalam etanol sampai seluruh ekstrak spon terendam, campuran disaring dan dihasilkan ekstrak spons. Filtrat spons yang telah didapat dievaporasi. Proses selanjutnya yaitu pengadukan filtrat dengan stiring magnetic mulai dari pelarut polar hingga pelarut non polar. Filtrat diaduk dengan pelarut kloroform dengan perbandingan 1:5. pengadukan dilakukan dengan replikasi 3 kali selama 2 jam untuk tiap kali replikasi. Dari proses tersebut akan didapatkan filtrat dan supernatan. Filtrat yang diperoleh dievaporasi untuk menghilangkan etanol. Hasil yang diperoleh merupakan ekstrak kloroform yang selanjutnya digunakan dalam uji sitotoksisitas.
Uji Sitotoksisitas Metode MTT assay
Suspensi sel kanker payudara (T47D) sebanyak 100 µL dengan kepadatan 3 x 104 sel/100 µL media didistribusikan ke dalam sumuran- sumuran pada 96-well plate dan diinkubasikan selama 24 jam. Setelah diinkubasi, ke dalam sumuran dimasukkan 100 µL larutan uji pada berbagai seri konsentrasi. Sebagai kontrol positif ditambahkan 100 µL medium kultur, kemudian 100 µL cisplatin pada berbagai seri konsentrasi ke dalam sumuran yang telah berisi 100 µL suspensi sel. Sebagai kontrol sel ditambahkan 100 µL medium kultur ke dalam sumuran yang berisi 100 µL suspensi sel dan sebagai kontrol pelarut ditambahkan 100 µL DMSO ke dalam sumuran yang berisi 100 µL medium kultur dan 100 µL suspensi sel dengan delusi yang sesuai dengan delusi konsentrasi larutan uji, kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 dan 95% O2. Pada akhir inkubasi, media kultur dibuang lalu ditambahkan 10 µL larutan MTT (5 mg/mL PBS), dan medium diganti dengan 190 µL medium RPMI 1640 komplit. Kemudian sel diinkubasi selama 3-4 jam. Reaksi MTT dihentikan dengan
3 penambahan reagen stopper SDS (100 µL).
Microplate kemudian dibungkus dengan tissue
dan diinkubasi selama 1 malam pada suhu kamar dan ruangan gelap. Sel yang hidup bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu. Hasil pengujian dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm (Ola at al., 2008; Mae
et al., 2000 dalam Dheta, 2009).
Pengamatan Kinetika Proliferasi Sel ( Uji
Doubling Time)
Suspensi sel kanker payudara (T47D) sebanyak 100 µL dengan kepadatan 3 x 104 sel/100 µl media didistribusikan ke dalam sumuran-sumuran pada 96-well plate dan diinkubasi selama 24 jam dalam incubator dalam suhu 37°C dan dialiri 5% CO2. Selanjutnya ditambahkan 100 µL larutan uji dengan 3 variasi konsentrasi yaitu pada LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 pada uji sitotoksisitas tersebut di atas, kemudian inkubasi dilanjutkan dengan variasi waktu 24, 48 dan 72 jam. Pada setiap akhir inkubasi, medium kultur dibuang dan ke dalam masing- masing sumuran ditambahkan 10 µL larutan MTT (5 mg/mL PBS) dan medium diganti dengan menambahkan 190 µL medium RPMI 1640 komplit kedalamnya. Kemudian sel diinkubasi selama 3-4 jam sampai terbentuk formazon. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan reagen stopper SDS (100 µL).
Microplate yang berisi suspensi sel diseker ± 5
menit kemudian dibungkus dengan tissue dan diinkubasi selama 1 malam pada suhu kamar dan ruangan gelap. Sel yang hidup bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu. Hasil pengujian dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Hasil absorbansi yang terbaca dikonversi ke dalam % (persentase) kehidupan (viabilitas) sel (Dhiani et al., 2006 dalam Dheta, 2009).
Uji Apopotosis dengan Metode Double Staining Sel yang telah dipanen dipuasakan sebelum perlakuan menyamakan umur sel seperti pada uji aktifitas proliferasi. Sel kanker yang akan dipuasakan dimasukkan ke dalam plate 24 well yang berisi coverslip, masing-masing sebanyak 500 µL dengan kepadatan 3x104 sel/100 µL media, kemudian sel diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2 370C. Selanjutnya sel diberi perlakuan dengan 500 µL ekstrak spons laut A.
suberitoides dengan 3 variasi konsentrasi yaitu
pada LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 pada uji sitoktoksisitas tersebut di atas. Sebagai kontrol sel, ditambahkan 500 µL media kultur RPMI,
kontrol positif ditambah 500 µL cisplatin pada konsentrasi LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 dan kontrol pelarut ditambah 500 µL DMSO pada konsentrasi LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50, kemudian sel diinkubasi selama 24 jam dalam incubator. Pada akhir inkubasi, medium dibuang dan coverslip dikeluarkan dari sumuran, diletakkan pada gelas benda Poly-L-Lysine secara merata dan dibuat rangkap dua. Sebanyal 5 µL larutan staining ditambahkan pada permukaan
coverslip tersebut, kemudian didiamkan ± 2 menit
agar larutan berinteraksi dengan sel. Sel segera diamati di bawah mikroskop flouresen dengan perbesaran dengan perbesaran 100 x dan hasil pengamatan difoto dengan kamera digital. Sel yang hidup akan berflurosen hijau dengan
acridine orange dan sel yang mati akan
berflurosen oranye dengan ethidium bromide (Dhiani et al., 2006; Nururlita & Mahdalena, 2006 dalam Dheta 2009). Jumlah sel yang mengalami apoptosis dihitung untuk tiap lapang pandang dengan jumlah minimal 100 sel (Spector, 1998 dalam Sukardiman, 2005).
Analisis Data
Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT assay Data yang diperoleh dari hasil pembacaan ELISA reader (λ = 595 nm) berupa absorbansi masing-masing sumuran dikonversikan dalam % kematian sel dengan rumus:
Keterangan :
Abs = Absorbansi
Kemudian dianalisis dengan program SPSS Windows 16.0 menggunakan uji One Way ANOVA. Analisis statistik ditentukan hipotesis statistik sebagai berikut :
Ho = Tidak ada pengaruh penambahan ekstrak spons A.suberitoides pada sel T47D dibandingkan dengan kontrol negatif pelarut DMSO
Ha = Ada pengaruh penambahan ekstrak spons
A.suberitoides pada sel T47D dibandingkan
dengan kontrol negatif pelarut DMSO
Pengambilan kesim-pulan jika harga Fhitung > Ftabel maka Ho ditolak, sedangkan jika harga Fhitung < Ftabel maka Ho diterima dengan derajad kepercayaan 0,95 (α = 0,05). Jika ada perbedaan
4 bermakna, perhitungan dilanjutkan dengan uji
LSD.
Untuk mengetahui harga LC50 ditentukan dengan menggunakan analisis persen probit pada program SPSS Windows 16.0. Prinsip pengolahan data pada program ini adalah mengkorelasi antara persen kematian sel dengan konsentrasi ekstrak. Pengamatan Kinetika Proliferasi Sel
Data yang diperoleh dari hasil pembacaan ELISA reader berupa absorbansi masing-masing sumuran dikonversikan dalam % kehidupan sel (viabilitas) dengan rumus:
Berdasarkan data tersebut dibuat profil hubungan antara persentase sel hidup dan waktu inkubasi, kemudian dibuat persamaan regresi linier. Slope dari persamaan ini menggambarkan kinetika pertumbuhan sel. Data absorbansi dan persentase sel hidup selanjutnya dilakukan analisis varian satu arah (ANOVA) (α = 0,05) untuk mengetahui adanya perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan pada setiap waktu inkubasi, dimana hasil uji bermakna jika diperoleh harga p ≤ 0.05. Jika terdapat perbedaan yang nyata, dilanjutkan dengan uji Least Significant
Difference (LSD). Kedua uji tersebut dilakukan pada taraf kepercayaan 95% dengan menggunakan program SPSS Windows 16.0.
Pengamatan Apoptosis
Data apoptosis berupa data kualitatif yang diperoleh dari hasil pengamatan morfologi sel menggunakan mikroskop flouresens. Sel yang hidup akan berflouresen hijau dengan acridine
orange dan sel yang mati akan berflouresens
orange dengan ethidium-bromide.
Perhitungan sel yang mengalami apoptosis dihitung dengan rumus:
% Apoptosis =
Jumlah sel apoptosis x 100% ∑ Total sel
HASIL
Uji Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut
A.suberitoides Terhadap Sel Kanker Payudara
(T47D) dengan Metode MTT assay
Hasil pengukuran dengan menggunakan ELISA reader menunjukkan bahwa persentase kematian sel T47D terus meningkat sebanding dengan kenaikan konsentrasi ekstrak yang diberikan. Kematian sel terbesar terdapat pada pemberian konsentrasi ekstrak 480 µg/ml yaitu
sebesar 97,649 % (Tabel 1).
Tabel 1. Persentase kematian sel T47D dengan perlakuan ekstrak spons laut A.suberitoides Seri Ekstrak ke- Konsentrasi (µg/ml) Persen Kematian Sel (%)
1 7.5 5.356 2 15 8.208 3 30 10.212 4 60 20.655 5 120 22.582 6 240 32.062 7 480 97.649 8 960 96.686 9 1440 90.559 10 1920 86.551
5 Gambar 2. Hasil uji sitotoksisitas cisplatin terhadap sel T47D dengan metode MTT assay
Tabel 2. Persentase kematian sel T47D dengan perlakuan DMSO Konsentrasi (µg/ml) Persen Kematian Sel
(%)
0.95 29.364
0.72 -0.578
0.475 6.821
Tabel 3. Persentase kematian sel T47D dengan perlakuan cisplatin Konsentrasi (µg/ml) Persen Kematian Sel
(%)
2 9.818
4 8.155
8 7.878
16 52.652
Adapun persentase kematian dari sediaan kontrol negatif DMSO adalah 6.821 % (Tabel 2) dan pada kontrol positif obat kanker cisplatin dimulai pada konsentrasi 2 µg/mL dengan persentase kematian sebesar 9.818%. Persentase kematian sel T47D terus meningkat sampai dengan konsentrasi tertinggi yaitu 16 µg/mL
sebesar 52.652 %, sejalan dengan kenaikan konsentrasi cisplatin (Tabel 3). Nilai LC50 pada uji sitotoksisitas ekstrak spons laut A.suberitoides terhadap sel T47D adalah 528.828 µg/mL (Gambar 1), sedangkan pada obat kanker cisplatin sebesar 16.818 µg/mL (Gambar 2).
Efek Ekstrak Spons Laut A.suberitoides Terhadap Proliferasi Sel Kanker Payudara (T47D)
Konsentrasi yang digunakan adalah pada LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 yaitu 528.828 µg/mL, 264.414 µg/mL dan 132.207 µg/mL dari hasil uji sitotoksisitas dengan waktu inkubasi 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Hasil uji
Doubling time pada inkubasi 72 jam terjadi
penurunan persentase sel yang hidup pada berbagai konsentrasi ekstrak dengan IC50 sebesar 194.487 µg/mL (Tabel 4). Sedangkan pemberian cisplatin pada uji doubling time signifikan terhadap kehidupan sel T47D selama periode inkubasi, dan didapatkan IC50 sebesar 28.569 µg/mL (Tabel 5).
Pengaruh Ekstrak Spons Laut A.suberitoides Terhadap Apoptosis Sel Kanker Payudara (T47D)
Hasil pengamatan dibawah mikroskop
flourosen memperlihatkan bahwa sel T47D yang
hidup akan berflouresen hijau dengan Acridine
orange dan sel yang mati berflouresen orange
dengan Ethidium bromide (Gambar 3). Hasil uji apoptosis sel T47D, cisplatin menunjukkan persentase apoptosis yang paling tinggi dibandingkan dengan ekstrak, DMSO serta kontrol (Gambar 4). Ekstrak spons laut
A.suberitoides mampu menginduksi apoptosis
pada sel kanker T47D dengan aktifitas sebesar 19.23 %.
6 Tabel 4. Persentase kehidupan sel T47D dengan perlakuan ekstrak spons laut A.suberitoides pada uji
Doubling time
Konsentrasi (µg/ml)
Persentase Kehidupan Sel (%) Waktu Inkubasi (jam)
24 48 72
528.828 53,757 61,649 32,258
264.414 57,161 67,881 47,177
132.207 63,470 74,804 56,048
Tabel 5. Persentase kehidupan sel T47D dengan perlakuan cisplatin pada uji Doubling time Konsentrasi
(µg/ml)
Persentase Kehidupan Sel (%) Waktu Inkubasi (jam)
24 48 72
16.818 57.880 48.242 32,258
8.409 75.924 42.674 47,177
4.205 56.860 48.388 56,048
Gambar 3. Sel T47D dengan perlakuan ekstrak spons A.suberitoides pada konsentrasi LC50 setelah diwarnai dengan acridine orange-ethidium bromide (florescent microscope perbesaran 100 x), a) sel mulai mengalami apoptosis dengan kondensasi kromatin, b) sel yang mengalami blebbing, c) merupakan
tahap akhir apoptosis d) sel yang mengalami nekrosis dan e) sel T47D normal
Gambar 4. Perbandingan persentase apoptosis sel T47D oleh perlakuan Kontrol, LC50 ekstrak, LC50 cisplatin dan DMSO
PEMBAHASAN
Hasil pengamatan dengan menggunakan mikroskop menunjukkan sel T47D yang hidup tampak seperti berserabut berwarna gelap dan saling berdempet dengan sel lain yang berada
disekitarnya, ditunjukkan oleh panah berwarna kuning. Warna gelap dan berserabut yang nampak pada pengamatan merupakan kristal formazon. Kristal-kristal formazon tersebut dapat menembus membran sel dan terakumulasi di dalam sel sehat. Jumlah produk formazan secara langsung
b
a
c
e
7 proposional dengan jumlah sel hidup. Semakin
banyak sel hidup maka semakin banyak sel yang aktif melakukan metabolisme sehingga jumlah produk formazan yang terbentuk juga semakin banyak. Semakin banyak produk formazan yang terakumulaasi ini menyebabakan intensitas warna ungu meningkat dalam plate.
Sedangkan sel T47D yang mati karena perlakuan pemberian ekstrak yang tinggi (1920 µg/ml), tampak bulat dan cenderung tersebar ataupun soliter, ditunjukkan oleh panah berwarna merah. Sel yang mati tidak dapat terwarnai oleh garam MTT sehingga tidak membentuk warna ungu seperti pada sel hidup. Mitokondria sel mati pada uji sitotoksisitas metode MTT ini tidak mampu berespirasi sehingga tidak menghasilkan enzim suksinat reduktase tetrazolium yang dapat
mereduksi reagen MTT menjadi produk formazan. Akibatnya pada sel mati tidak terbentuk formazan yang berwarna ungu, tetapi warnanya tetap kuning seperti medium. Pada kontrol sel terlihat jumlah sel yang berwarna gelap dan berserabut lebih banyak di banding dengan perlakuan lainnya. Penampakan sel pada kontrol DMSO tertinggipun (0,95%) juga terlihat tidak berdampak signifikan terhadap jumlah sel yang mati. Pada kenampakan sel T47D dengan perlakuan ekstrak, dapat dilihat jumlah sel yang berwarna gelap dan berserabut secara berangsur-angsur turun dari konsentrasi pemberian ekstrak tertinggi (1920 µg/ml) hingga ekstrak terendah (7.5 µg/ml). Hal ini dapat diindikasikan bahwa pemberian ekstrak berpengaruh terhadap jumlah kematian sel secara kualitatif.
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
Gambar 5. Pembentukan kristal formazon setelah pemberian MTT pada sel T47D. (A) Kontrol sel, (B) Kontrol DMSO 0.95%, (C) Konsentrasi ekstrak 1920 µl/ml, (D) Konsentrasi ekstrak 120 µl/ml, (E) Konsentrasi ekstrak 30
µl/ml, (F) Konsentrasi ekstrak 7.5 µl/ml Hasil pengukuran dengan menggunakan
ELISA reader menunjukkan bahwa persentase kematian sel T47D terus meningkat sebanding dengan kenaikan konsentrasi ekstrak yang diberikan. Kematian sel terbesar terdapat pada pemberian konsentrasi ekstrak 480 µg/ml yaitu sebesar 97,649 % (Tabel 1), sedangkan persentase kematian dari sediaan kontrol negatif DMSO adalah 6.821 % (Tabel 2). Hasil penelitian tersebut kemudian dianalisis menggunakan SPSS windows 16.0 dengan program One Way ANOVA dan program analisis persen probit.
Dari analisis uji One Way ANOVA (α = 0.05) menunjukkan hasil yang signifikan dan
diperoleh Fhitung sebesar 197.160 µg/ml. Sedangkan Ftabel sebesar 2.30, karena harga Fhitung lebih besar daripada harga Ftabel maka terdapat pengaruh penambahan ekstrak spons
A.suberitoides pada sel T47D dibandingkan
dengan kontrol negatif pelarut DMSO.
Untuk mengetahui perbedaan bermakna dilanjutkan dengan analisis LSD (Least Significant Difference). Dari hasil perhitungan diperoleh nilai LSD sebesar 7.253 (Lampiran 41). Karena rata-rata nilai LSD lebih besar daripada nilai LSD hitung, maka terdapat perbedaan bermakna dari masing-masing kelompok.
8 Perhitungan nilai LC50 ditentukan dengan
menggunakan analisis persen probit pada program SPSS Windows 16.0. LC50 digunakan sebagai parameter untuk mengevaluasi potensi sitotoksisitas ekstrak spons laut A.suberitoides terhadap sel T47D. Untuk melakukan uji sitotoksisitas terhadap ekstrak, NCI (National
Cancer Institute) menetapkan suatu standar
bahwa harga LC50 adalah ≤ 20 µg/mL (Suffness, 1991). Karena harga LC50 dari ekstrak
A.suberitoides diperoleh pada konsentrasi 528.828 µg/mL, maka dapat dikatakan bahwa ekstrak spons A.suberitoides tidak mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara (T47D) berdasarkan kriteria yang ditetapkan oleh NCI (National Cancer Institut).
Sebagai kontrol positif digunakan cisplatin. Cisplatin secara klinis digunakan sebagai obat kanker termasuk juga kanker payudara (T47D), sehingga secara tidak langsung dapat dibandingkan dengan ekstrak spons
A.suberitoides. Cisplatin (cisplatinum atau cis
diamminedichloroplatinum (II)) merupakan obat kemoterapi kanker yang berbasis logam platinum. Cisplatin bekerja sebagai anti kanker dengan cara menempelkan diri pada DNA (deoxyribonucleic
acid) sel kanker dan mencegah pertumbuhannya.
Jika senyawa ini terlarut dalam air, ligan kloro pada cisplatin diganti satu persatu oleh ligan air (aqua) melalui reaksi hidrolisis. Selanjutnya ikatan Pt-OH2 yang terdapat dalam senyawa kompleks monoaquaplatina dan diaquaplatina yang terbentuk akan jauh lebih reaktif, sehingga kompleks tersebut akan lebih mudah bereaksi dengan ligan donor beratom nitrogen pada basa DNA (Putra, 2008).
Kontrol positif bertujuan untuk mengevaluasi keberhasilan uji sitotoksisitas sebagai bukti terjadinya efek sitotoksik. Hasil uji sitotoksisitas dengan perlakuan cisplatin pada berbagai konsentrasi dapat dilihat pada lampiran 2. Pada hasil penelitian, cisplatin dapat menyebabkan kematian sel T47D yang dimulai pada konsentrasi 2 µg/mL dengan persentase kematian sebesar 9.818%. Persentase kematian sel T47D terus meningkat sampai dengan konsentrasi tertinggi yaitu 16 µg/mL sebesar 52.652 %, sejalan dengan kenaikan konsentrasi cisplatin. Hasil uji One Way ANOVA (α = 0.05) adalah signifikan, menunjukkan harga Fhitung lebih besar daripada harga Ftabel (Fhitung =30.626 dan Ftabel = 3.48) berarti terdapat pengaruh penambahan cisplatin pada sel T47D
dibandingkan dengan kontrol negatif pelarut DMSO.
Untuk mengetahui perbedaan bermakna dilanjutkan dengan analisis LSD (Least Significant Difference). Dari hasil perhitungan diperoleh nilai LSD sebesar 9.825 . karena nilai LSD lebih besar daripada nilai LSD hitung, maka terdapat perbedaan bermakna dari masing-masing kelompok dengan metode MTT assay.
Perhitungan nilai LC50 cisplatin ditentukan dengan menggunakan analisis persen probit pada program SPSS Windows 16.0 dan diperoleh pada konsentrasi 16.818 µg/mL. LC50 dengan perlakuan cisplatin ini lebih rendah daripada LC50 dengan perlakuan ekstrak spons
A.suberitoides.
Efek Ekstrak Spons Laut A.suberitoides Terhadap Proliferasi Sel Kanker Payudara (T47D)
Uji doubling time dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak spons A.suberitoides terhadap proliferasi sel T47D. Konsentrasi yang digunakan adalah pada LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 yaitu 528.828 µg/mL, 264.414 µg/mL dan 132.207 µg/mL dari hasil uji sitotoksisitas dengan waktu inkubasi 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Uji ini dilakukan dengan metode MTT assay, kemudian dihitung prosentase sel yang hidup (viabel). Hasil uji doubling time ekstrak dapat dilihat pada tabel 4. Pada tabel tersebut tampak bahwa setelah pemberian ekstrak dan penginkubasian selama 24 jam terjadi penurunan persentase sel yang hidup pada berbagai konsentrasi ekstrak dengan IC50 sebesar 194.487 µg/mL. Akan tetapi hasil uji LSD (α = 0,05) menunjukkan perbedaan yang nyata antara konsentrasi 528.828 µg/mL dengan 264.414 µg/mL serta 264.414 µg/mL dengan 132.207 µg/mL. Perbedaan yang tidak nyata terlihat antara konsentrasi 528.828 µg/mL dengan 132.207 µg/mL Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak spons
A. suberitoides telah berinteraksi dengan sel
T47D untuk menghambat pertumbuhan sel tersebut.
Data yang diperoleh dari uji doubling
time pada perlakuan ekstrak A. suberitoides
selanjutnya dibuat profil hubungan antara persentase sel hidup dan waktu inkubasi, dimana nilai X adalah waktu inkubasi dan nilai Y adalah persen kehidupan sel kanker payudara T47D. Kemudian dibuat persamaan regresi linier, sehingga dapat dihitung IC50 berdasarkan
9 persamaan garis yang diperoleh. Nilai IC50
merupakan nilai konsentrasi dosis bahan uji yang menghambat pertumbuhan sel sebanyak 50 %. Nilai IC50 dalam penelitian ini menunjukkan nilai konsentrasi ekstrak spons A. suberitoides yang menghasilkan hambatan pertumbuhan sel T47D sebesar 50 % dari populasi.
Berdasarkan pengertian tersebut, maka nilai Y dapat ditentukan yaitu 50.
Dari persamaan garis (Gambar1) diperoleh nilai, Y = -0.078 X + 65.17
Y = 50,
Maka 50 = - 0.078 X + 65.17 X = 50 – 65.17 = 194.487 -0.078
Maka nilai konsentrasi ekstrak spons A.
suberitoides yang menghasilkan hambatan pertumbuhan sel T47D sebesar 50 % dari populasi, yakni sebesar 194.487 µg/mL. Sehingga dapat disimpulkan bahwa dosis IC50 ekstrak spons A. suberitoides adalah 194.487 µg/mL.
Uji doubling time juga dilakukan pada kontrol positif, yakni cisplatin untuk melihat pengaruh antiproliferatif obat kanker cisplatin terhadap pertumbuhan sel kanker T47D. Konsentrasi yang digunakan juga merupakan konsentrasi LC50 dan 2 konsentrasi dibawah LC50 yaitu 16.818 µg/mL; 8.409 µg/mL; dan 4.205 µg/mL dari hasil uji sitotoksisitas dengan waktu inkubasi 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Pemberian cisplatin pada sel T47D pada uji doubling time juga memberikan hasil yang signifikan terhadap persentase kehidupan sel T47D selama periode inkubasi.
Hasil uji LSD menunjukkan adanya beda nyata antara kelompok perlakuan. Hingga inkubasi 72 jam, persentase sel yang hidup menurun. Hal ini menunjukkan bahwa cisplatin mempunyai kemampuan menghambat proliferasi sel T47D dengan peningkatan konsentrasi obat dan penambahan waktu inkubasi.
Data yang diperoleh dari uji doubling
time pada perlakuan cisplatin selanjutnya dibuat
profil hubungan antara persentase sel hidup dan waktu inkubasi, dimana nilai X adalah waktu inkubasi dan nilai Y adalah persen kehidupan sel kanker payudara T47D. Kemudian dibuat persamaan regresi linier, sehingga dapat dihitung IC50 berdasarkan persamaan garis yang diperoleh. Nilai IC50 merupakan nilai konsentrasi dosis bahan uji yang menghambat pertumbuhan sel
sebanyak 50 %. Nilai IC50 dalam penelitian ini menunjukkan nilai konsentrasi ekstrak spons A.
suberitoides yang menghasilkan hambatan pertumbuhan sel T47D sebesar 50 % dari populasi. Berdasarkan pengertian tersebut, maka nilai Y dapat ditentukan yaitu 50.
Dari persamaan garis (Gambar2) diperoleh nilai, Y = -0.51 X + 64,57 Y = 50, Maka 50 = - 0.51 X + 64.57 X = 50 – 64.57 = 28.569 -0.51
Maka nilai konsentrasi cisplatin yang menghasilkan hambatan pertumbuhan sel T47D sebesar 50 % dari populasi, yakni sebesar 28.569 µg/mL. Sehingga dapat disimpulkan bahwa dosis IC50 cisplatin adalah 28.569 µg/mL.
Nilai IC50 dalam penelitian ini menunjukkan nilai konsentrasi ekstrak spons A.
suberitoides yang menghasilkan hambatan pertumbuhan sel T47D sebesar 50 % dari populasi, yakni sebesar 194.487 µg/mL. Nilai tersebut juga menunjukkan apakah ekstrak spons tersebut bersifat antiproliferatif terhadap sel T47D. Sedangkan nilai IC50 cisplatin sebesar 28.569 µg/mL, hal ini menunjukkan bahwa cisplatin memiliki aktivitas yang lebih tinggi dalam menghambat proliferasi sel kanker payudara T47D.
Nilai IC50 cisplatin jauh lebih rendah dibandingkan IC50 ekstrak. Nilai IC50 yang rendah menunjukkan aktivitas penghambatan proliferasi sel yang baik karena dengan konsentrasi yang sangat sedikit sudah dapat menghambat proliferasi sel sebesar 50%. Hal ini disebabkan karena cisplatin bekerja sebagai anti kanker dengan cara menempel diri pada DNA (deoxyribonucleic acid) sel kanker dan mencegah pertumbuhan sel kanker. Oleh karena itu nilai IC50 nya lebih rendah dibandingkan ekstrak karena cisplatin cenderung menyembuhkan kanker melalui penghambatan proliferasi sel kanker.
Menurut Kamuhabwa et al. (2000), jika ekstrak memiliki nilai IC50 ≤ 100 µg/ml dapat dikatakan memiliki potensi antiproliferasi. Sedangkan menurut Mans et al. (2000) batas ambang yang ditetapkan untuk bahan alam yang dapat dikembangkan sebagai antikanker yaitu ≤ 50 µg/ml ( Mans et al., 2000). Berdasarkan kedua acuan diatas, dapat dikatakan bahwa ekstrak etanol spons A. suberitoides dengan nilai IC50 sebesar 194.487 µg/mL belum signifikan dalam
10 menghambat proliferasi sel T47D sehingga perlu
upaya fraksinasi dan isolasi bahan bioaktifnya. Pengaruh Ekstrak Spons Laut A.suberitoides Terhadap Apoptosis Sel Kanker Payudara (T47D)
Kematian sel T47D akibat perlakuan ekstrak spons A.suberitoides dapat diketahui juga melalui uji apoptosis. Konsentrasi yang digunakan untuk uji apoptosis adalah 528.828 µg/mL, 264.414 µg/mL dan 132.207 µg/mL (ekstrak), serta 16.818 µg/mL; 8.409 µg/mL; dan 4.205 µg/mL (cisplatin).
Metode yang digunakan adalah
doublestaining DNA dengan menggunakan
ethidium bromide-acridine orange. Kedua macam
zat warna ini digunakan secara bersamaan karena dapat menghasilkan warna kontras, sehingga mempermudah pengamatan dibawah mikroskop
fluorosen. Pengamatan terhadap morfologi sel
harus dilakukan dengan segera karena jika larutan
doublestaining terlalu lama berinteraksi dengan
sel, maka sel yang hidup akan mati. Hal ini disebabkan karena etidium bromide bersifat toksik, sehingga dalam penelitian hanya digunakan konsentrasi yang sangat kecil 5 µL.
Ethidium bromide dalam konsentrasi kecil akan
dilawan oleh antibodi sel hidup.
Ethidium bromide-acridine orange
mampu menembus membran sel dan berinteraksi dengan DNA sel. Hasil pengamatan di bawah mikroskop fluorosen memperlihatkan bahwa sel T47D yang hidup akan berfluoresen hijau dengan
acridine orange sedangkan sel yang mati
berfluoresen oranye dengan ethidium bromide.
Ethidium bromide hanya dapat
menembus membran sel mati karena terjadi penurunan integritas membran sel mati sehingga tidak permeabel terhadap senyawa yang masuk, sedangkan acridine orange mengandung gugus kation sehingga dapat berinteraksi dengan DNA sel hidup yang bersifat anionik membentuk garam terdisosiasi (Nurulita & Mahdalena, 2006 dalam Meye, 2009)
Hasil uji induksi apoptosis ekstrak spons
A.suberitoides terhadap sel T47D menunjukkan
bahwa ekstrak tersebut memiliki kemampuan untuk menginduksi apoptosis pada sel T47D. Pada gambar 3 a dibawah, tampak sel yang mengalami apoptosis dengan inti yang terfragmentasi dan terbentuknya tonjolan-tonjolan pada sel yang menunjukkan mulainya apoptosis (apoptotic body) (Gambar 3 b). Sel yang
mengalami nekrosis (Gambar 3 d) bentuknya bulat seperti pada sel normal namun tetap berwarna oranye. Diduga, senyawa aaptamin yang terkandung dalam sponge A. suberitoides inilah yang berperan dalam memicu apoptosis sel T47D dengan perlakuan pemberian ekstrak.
Pada penelitian ini diperoleh persentase apoptosis yang disebabkan oleh ekstrak dan cisplatin berturut-turut 19.23 % dan 22.53 % (Gambar 4). Jumlah apoptosis dengan perlakuan ekstrak terhitung lebih kecil dari cisplatin karena senyawa dalam cisplatin telah terbukti menghambat proliferasi sel dengan cara apoptosis. Sedangkan ekstrak masih mengandung senyawa-senyawa yang dapat bekerja sinergis membentuk apoptosis atau bahkan menghambat apoptosis. Meskipun demikian, masih dapat dikatakan bahwa senyawa yang terkandung dalam ekstrak spons A. suberitoides dapat memacu apoptosis pada sel kanker T47D. Sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak spons laut
A.suberitoides mampu menginduksi apoptosis
pada sel kanker T47D dengan aktifitas sebesar 19.23 %. Diduga senyawa aaptamin yang terkandung dalam spons A. suberitoides dapat menginduksi gen p53 sebagai regulator apoptosis untuk mengendalikan kematian sel T47D secara terprogram.
KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan menunjukkan bahwa :
1. Ekstrak spons laut A.suberitoides tidak mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan harga LC50 sebesar 528.828 µg/mL pada uji sitotoksisitas dengan metode MTT assay berdasarkan kriteria yang ditetapkan oleh NCI (National
Cancer Institut) bahwa suatu senyawa
dikatakan memiliki efek sitotoksisitas yang poten bila senyawa tersebut mempunyai nilai LC50 ≤ 20 πg/mL.
2. Ekstrak spons laut A.suberitoides belum signifikan dalam menghambat proliferasi sel T47D dengan nilai IC50 sebesar 194.487 µg/mL pada uji Doubling Time berdasarkan kriteria yang ditetapkan oleh Kamuhabwa et
al. (2000), jika ekstrak memiliki nilai IC50 ≤ 100 µg/ml dapat dikatakan memiliki potensi antiproliferasi.
3. Ekstrak spons laut A.suberitoides mampu menginduksi apoptosis pada sel kanker T47D dengan aktifitas sebesar 19.23 %.
11 SARAN
1. Perlu dilakukan fraksinasi dan isolasi pada ekstrak spons laut A.suberitoides
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan uji in vivo untuk menambah informasi ilmiah tentang efek toksisitas ekstrak spons laut
A.suberitoides terhadap hewan uji, sehingga
komponen kimiawi yang terkandung di dalamnya dapat dijadikan sebagai salah satu agen antikanker.
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada Ibu Awik Puji Dyah Nurhayati, S.Si, M.Si beserta Prof. Dr. Drs. Sukardiman, Apt, MS selaku dosen pembimbing yang bersedia meluangkan waktu untuk bimbingan. Ibu Dra. Dian Saptarini, M.Sc, Ibu Dra. Nurlita Abdulgani, M.Si beserta Ibu Ir.Sri Nurhatika, MP sebagai Dosen Penguji dan Ibu Dra. Dian Saptarini, M. Sc. selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA ITS. Bapak M. Muryono, M.Si selaku Koordinator Tugas Akhir Jurusan Biologi FMIPA ITS. Ibunda tercinta, kakakku tersayang serta mas Uun yang selalu memberikan motivasi, do’a dan dukungan baik material maupun spiritual selama ini dan teman-teman angkatan 2006 yang banyak membantu, serta kepada semua pihak yang telah membantu penelitian ini.
KEPUSTAKAAN
Abcam. 2007.
T47D (Human ductal breast
epithelial tumor cell line) Whole Cell
Lysate
(ab14899)
datasheet
.<URL:http://www.abcam.com/
index.html?datasheet=14899,
diakses
Februari 2007
Ahmad, T, Panrerengi, A. Suryati, E. 2000.
“Potensi Sponge Penghasil Bakterisida
dan Fungisida Alami Belum Banyak
Dimanfaatkan”.
Warta
Penelitian
Perikanan Indonesia 8, 3 : 34-45
Alatas, Zubaidah. 2007. Faktor Genetik
dalam Karsinogenesis yang Diinduksi
oleh Radiasi Pengion. PTKMR-BATAN.
Anonim.2008.
Senyawa
Metabolit
Sekunder.
<URL:http://www.invivogen.com/family.
php?ID=2-19&ID_cat=12>
Anonim.2009.BenzoPiren.<URL:http://www
.pharmastate.com/staticgallery/
pathologybenzopiren/m>
Anonim. 2009. Conective Tissue .
<URL:http://www.visualhistology.com>
Anonim. 2010. Fibrosarcoma. <URL:http://
www.pathconsultddx.com
>
Aoki, S., Dexin K., Hideaki S., Yoshihiro S.,
Toshiyuki S., Andi S., and Motomasa K.
2006. Aaptamin, a Spongean Alkaloid,
Activates p21 Promoter in a
p53-Independent Manner. Biochemical and
Biophysical Research Communications
342 (2006)101-106
Arrozi, Hanifah. 2006. Uji Sitotoksisitas In
Vitro Fraksi Aktif Bahan Kinca
(Limonia accidissima Auct non L)
Hasil
Pemisahan
dengan
Kolom
Vacuum Cair Pada Sel Hela. UGM :
Yogyakarta
Astuti, P., Alam, G., Tahir, A., and
Wahyuono, S., 2002. “Toxicity Studies of
Sponges Collected from Barrang Lompo
Island Against Artemia salina Leach”. J.
Trad. Med 7, 21 : 19-23.
Astuti, Puji. 2005. “Uji Sitotoksik Senyawa
Alkaloid dari Spons Petrosia sp :
Potensial
Pengembangan
Sebagai
Antikanker”.
Majalah
Farmasi
Indonesia 16 , 1 : 58-62.
Badisa,
,
R.B.
et.al.
2006.
“Selective
Anticancer
Activity
of
Pure
Licamichauxiioic-B Acid in Cultured Cell
Lines”. Pharmaceutical Biology 44, 2 :
141-145
Bavelender,
Gerrit.
1988.
Dasar-dasar
Histologi. Erlangga. Jakarta
Ben Best. 2006. Cancer Death Causes &
Prevention.
<
http://benzo/Hasil%20Penelusuran%20
Gambar%20Google%20untuk%20httpww
w_benbest_comhealthBenzoPyr_gif_files
/cancer.htm
>
Belo, A.V. 2004. “Inhibition of Inflammatory
Angiogenesis By Distant Subcutaneous
Tumor in Mice”. Life Science 74 :
2827-2837
12
Beyersman, Detmar. 2002. “Effect of
Carcinogenic Metal on Gene Expression”.
Toxicology Letters 127 : 63-68
Brannon, Heather. 2007. “Skin Anatomy”.
Journal of Histology 184, 11
Burdall, E.S., Hanby M.A., Landsdown,
R.J.M., dan Speirs, V. 2003. Bereast
Cancer Cell Line, Breast Cancer Res.
5(2): 89-95.
Coutinho, A., Chanas, B., Souza, T.
Frugrulhetti, I., dan Epifanio. 2002. “Anti
HSV-1
Alkaloids
from
a
Feeding
Deterrent Marine Spongse of The Genus
Aaptos”. Heterocycles 57 : 1265-1272
Dewi, Rahmawati Nirmala. 2005. Uji
Aktivitas
Antikanker
Senyawa
Andrografolida dari Isolat Herba
Sambiloto (Andrographis paniculata
Nees)
terhadap
Sel
Kanker
Fibrosarcoma Mencit secara In Vivo.
Skripsi Sarjana Fakultas Farmasi Unair
Dheta, Ermelinda Meye. 2009. Sitotoksisitas
dan Efek Ekstrak Etanol Kulit Buah
Jambu Mente (Anacardium occidentale
L.) Terhadap Sel Mieloma. Fakultas
Biologi UGM. Yogyakarta
Doyle, A., Griffith, S .J . B., 2000. Cell and
Tissue Culture for Medical Research,
49, John Willey and Sons, Ltd., New
York
Freshney, R.I. 1986. Animal Cell Culture, A
Practical Approach 1st Ed. IRL Press;
Washington D.C.
Guillen, David and Cockerell, Clay. 2001.
“Cutaneous and Subcutaneous Sarcoma”.
Clinics in Dermatology 19: 262-268
Hanahan, D., and Weinberg, R. A., 2000,
“The Hallmarks of Cancer”. Cell 100,
57-70
Hanani, E., Mun’im, A. dan Sekarini. 2005.
”Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam
Spons Callyspongia sp dari Kepulauan
Seribu”. Majalah Ilmu Kefarmasian II,
3 : 127 – 133
Herlinawati. 1998. Pengaruh Pemberian
Isometamidium
dan
Kombinasinya
dengan Potassium Tartrat terhadap
Histopatologi
Ginjal
Tikus
Putih
(Rattus norvegicus) yang Diinfeksi
Trypanosoma
evansi
Isolat
Banyuwangi. Skripsi Sarjana Fakultas
Kedokteran Hewan Unair
Heti, Dany. 2008. Uji Sitotoksik Ekstrak
Etanol
70%
Herba
Sisik
Naga
(Drymoglossum
piloselloides
Presl.)
Terhadap Sel T47D. Fakultas Farmasi
Universitas
Muhamadiyah
Surakarta:
Surakarta
Hossfeld, D.K., 1990, D.K.,Sherman, C.D.,
Love, R.R., Bosch, F.X (Eds), Manual of
Clinical
Oncology,
Fifth
edition.,
Spinger-Verlag,
Berlin,
Heidelberg,
Germany
Huang. J, Bay.B.H, Tan.P.H. 2000. “Nuclear
Morphology In Breast Cancer”. Medical
Hypotheses 55, 1 : 26-28
Jasin, Maskuri. 1992. Zoologi Invertebrata.
Sinar Wijaya: Surabaya
Jesudason, M.D, Muthusami J.C, Subhasini
M.D,
Ramakrishna
M.D.
2005.
”Histologicaly
Benign
Pleomorphic
Adenoma with Subcutaneous Metastase”.
Otolaryngology
Head
and
Neck
Surgery 133 : 985-986
Kamuhabwa, A., Nshimo, C. & de Witte, P.
2000. “Cytotoxicity of Some Medicinal
Plant
Extracts
Used
in
Tanzanian
Tradisional
Medicine”.
J.
Ethnopharmacol.70 : 143-149
Larghi, E., Obrist, B., and Kaufman, T. 2008.
A formal total synthesis of the marine
alkaloid aaptamine.Tetrahedron Volume
64, Issue 22
Lenny, Sovia. 2006. Senyawa Terpenoid
dan Steroida. Karya Ilmiah Departemen
Kimia FMIPA Universitas Sumatra Utara.
Medan
Mader, Sylvia. 2001. Biology, Seventh
Edition. Mc Graw Hill Higher Education.
New York
Makarchaenko, A. dan Utkina, N. 2004.
Antiradical Activity of Alkaloids from
Marine
Sponges.
International
Conference on Natural Products and
Physiologically
Active
Substances
(ICNPAS-2004) September 12-17, 2004,
Novosibirsk, Russia
13
Mayer, A., Gustafson, K. 2008. ”Marine
Pharmacology in 2005–2006: Antitumour
and Cytotoxic Compounds”. European
Journal Of Cancer 44 : 2357–2387
Meiyanto, E., and Septisetyani, E. P. 2005.
“Efek Antiproliferatif dan Apoptosis
Fraksi Fenolik Ekstraketanolik Daun
Gynura Procumbens terhadap Sel HeLa”.
Artocarpus 5 , 2 : 74-80
Meyer, B, N., N. R Ferrigni, J. E. Putnam, L.
B. Jacobsen, D. E. Nichols, J. L.
McLaughlin., 1982. “Brine Shrimp; A.
Convinient General Bioassay for Active
Plant Constituent”.Planta Med. 45: 31-34
Moeljopawiro,
S.,
M.R.
Anggela,
D.
Ayuningtyas, B. Widaryanti, Y.Sari, dan
I.M.Budi. 2007. “Pengaruh Sari Buah
Merah (Pandanus conoideus Lamk.)
Terhadap
Pertumbuhan
Sel
Kanker
Payudara dan Sel Kanker Usus Besar”.
Berkala Ilmiah Biologi 6, 2 : 121 - 130
Muniarsih T, dan Rachmaniar R. 1999.
“Isolasi Substansi Bioaktif Antimikroba
dari Spons Asal Pulau Pari Kepulauan
Seribu”.
Prosidings
Seminar
Bioteknologi Kelautan Indonesia I .
Jakarta 14 – 15 Oktober 1998
Murray, Robert K, dkk. 2003. Biokimia
Harper. Penerbit Buku Kedokteran EGC:
Jakarta
Nurlaila, Ika dan Hadi, Miftachul. 2009.
Kanker: Pertumbuhan, Terapi dan
Nanomedis. Biophysics Group, Physics
Research
Centre
LIPI.
Nanotech
Indonesia
Nurhayati, Awik Puji Dyah. 2009. Skrining,
Isolasi,
dan
Evaluasi
In
Vivo
Antikanker dari Spons Laut. LPPM ITS
Pamilih, H. 2009. Uji Sitotoksik Ekstrak
Etil Asetat Herba Bandotan (Ageratum
Conyzoides L.) Terhadap Sel Kanker
Payudara
(T47D)
Dan
Profil
Kromatografi Lapis Tipis. Fakultas
Farmasi UMS, Surakarta
Powers, Barbara and Dernell, William. 1998.
“Tumor Biology and Patology”. Clinical
Techniques in Small Animal Practice
13, 1 : 97-102
Romihmohtarto, K. dan Juwana S. 1999.
Biologi
Laut.
Ilmu
Pengetahuan
tentang Biota Laut. Pusat Penelitian dan
Pengembangan Oseanologi-LIPI. Jakarta.
hlm 115 – 128.
Ruppert EE, and Barnes RD. 1991.
Invertebrates Zoology. Sixth Edition.
Rundle, A., Tang D., Hibshoosh H.,
Estabrook A., Schanabel F., Cao W.,
Grumet S., and Perera F,. 2000.“ The
Relationship Between Genetic Damage
from Polycyclic Aromatic Hydrocarbons
in Breast Tissue and Breast Cancer“.
Carcinogenesis 2, 7 :1281-1289
Sanif
R.
2001.
Sinopsis
Onkologi
Ginekologi.
Sub
bagian
Onkologi
Ginekologi
Bagian
Obstetri
dan
Ginekologi FKUI/RSUPN dr. Cipto
Mangun kusumo. Jakarta; 45-63
Setyowati, Erna. 2005. “Isolasi Senyawa
Sitotoksik Spons Kaliapsis“. Majalah
Farmasi Indonesia 18, 4 : 183-189.
Shaari , Khozirah, et al. 2008. ”Cytotoxic
Aaptamines from Malaysian Aaptos
aaptos”. Mar Drugs 7, 1 : 1–8.
Shimada.H, Uchida. M, Okawara.T. 2005.
”Inhibitory Effect of Flavonoids on The
Reduction of Progesterone to
20α-hydroxiprogesterone
in
Rat
Liver”.
Journal of Steroid Biochemistry and
Molecular Biology 93 : 73-79
Smith, John B dkk. 1988. Pemeliharaan,
Pembiakan dan Penggunaan Hewan
Percobaan di Daerah Tropis. UI Press.
Jakarta.
Suffness, M., and J. M. pezzuto. 1991.
“Assays
Related
to
Cancer
Drug
Discovery’,
Methods
in
Plant
Biochemistry ; Assays for Bioactivity.
Vol. 6. London Academic Press, 71-133
Sukardiman,
Abdul
Rahman,
Wiwied
Ekasari, dan Sismindari. 2005. “Induksi
Apoptosis Senyawa Andrografolida dari
Sambiloto
(Andrographis
paniculata
Nees) Terhadap Kultur Sel Kanker”.
Media Kedokteran Hewan 21, 3
Sukardiman, Ekasari. W, Hapsari. P.P. 2006.
“Aktivitas
Antikanker
dan
Induksi
14
(Carica papaya L) terhadap Kultur Sel
Kanker Mieloma”. Media Kedokteran
Hewan 22, 2 : 104-111
Suparno. 2005. Kajian Bioaktif Spons Laut
(Porifera:
Demospongiae)
Suatu
Peluang
Alternatif
Pemanfaatan
Ekosistem Karang Indonesia Dalam
Bidang Farmasi. IPB: Bogor
Susilawati, Sri. 2006. Pengaruh Tepung
Tempe terhadap Ukuran Jaringan
Kanker Mammae dan Gambaran
Mikroanatomi Hepar Mencit (Mus
musculus)
Galur
C3H
setelah
Ditransplantasi Sel Adenocarcinoma
Mammae. Universitas Negeri Semarang
Syaifudin, Mukh. 2007. “Gen Penekan
Tumor p53 Kanker dan Radiasi Pengion”.
Buletin Alara 8, 3 : 119 – 128
Tadjudin, M.K. 2006. Apoptosis Pada
Glioma Otak. Simposium: Apoptosis
Charming to Death FK UI
Tsukamoto Sachiko; Yamanokuchi Rumi;
Yoshitomi Makiko; Sato Kohei; Ikeda
Tsuyoshi; Rotinsulu Henki; Mangindaan
Remy E P; de Voogd Nicole J; van Soest
R W M; Yokosawa Hideyoshi. 2010.
“Aaptamine, an Alkaloid From The
Sponge Aaptos suberitoides , Fungtions
as a Proteasome Inhibitor”. Bioorganic
Medicinal Chemistry Letters 20 , 11 :
3341-3
Van Soest, R.M.W. 1989. “The Indonesian
Sponge
Fauna:
Status
Report”.
Netherland Journal of Sea Research 23,
2 : 223-230
Widodo,
Nanang.
2007.
Isolasi
dan
Karakterisasi Senyawa Alkaloid yang
Terkandung dalam Jamur Tiram Putih
(Pleurotus ostreotus). Jurusan Kimia
FMIPA Universitas Negeri Semarang.
Semarang
Widyastuti, Shanti. 2008. Uji Toksisitas
Ekstrak Daun Iprih (Ficus glabella
Blume) terhadap Artemia salina Leach
dan Profil Kromatografi Lapis Tipis.
Jurusan
Farmasi
Universitas
Muhamadiyah Surakarta
Yana,
Sumpena.
Dkk.
2009.
“Uji
Mutagenisitas Benzo(a) piren dengan
Metode ikronukleus pada SumsumTulang
Mencit Albino (Mus musculus”). Cdk
167 36, 1 : 76-85
Yuwono,
Triwibowo.
2005.
Biologi
Molekular. Erlangga, Jakarta
Zakaria, Fransiska R. 2001. ”Pangan dan
Pencegahan Kanker”. Jurnal Teknologi
dan Industri Pangan
15
![Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah [Piper crocatum Ruiz & Pav] terhadap kultur sel raji.](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)