Penentuan N-Terminal Enzim
αααα
-Amilase dari Bakteri Lokal
Bacillus sp. B. 148
Yandri A.S.Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Lampung Jl. S. Brojonegoro No. 1 Bandar Lampung 35145
Abstract
The objective of the research is to determine N-terminal amino acids sequence of α-amylase from a local bacteria isolate, Bacillus sp B.148. The dansyl-chloride and Edman degradation methods were utilized. The activity of α-amylase was determined by Fuwa1 and Mandels2 methods, the protein content was measured by Lowry method3. The result showed that the molecular weight of α-amylase obtained from this local bacteria isolate, Bacillus sp B.148, was 67 kDa. The N-terminal amino acid residues sequence of purified enzyme are alanine-histidine-proline (Ala-His-Pro-).
Keywords:
α
-amylase, Bacillus sp B.148.Pendahuluan
Enzim α-amilase (α-1,4-glukan-4-glukanohidrolase, EC 3.2.1.1) adalah en-zim yang mengkatalisis penguraian pati, glikogen, dan macam-macam oligosa-karida. Enzim ini sudah dikaji secara luas dari berbagai aspek, seperti struktur dan fungsi, serta penggunaan dalam industri. Umumnya enzim α-amilase mempunyai bobot molekul sekitar 50 kDa4. Sedang-kan menurut Janecek & Balaz5, bobot molekul enzim α-amilase berkisar antara 45 – 60 kDa. Srivastava6 telah melaku-kan pemurnian pada enzim α-amilase dari B. stearothermophilus dengan menggu-nakan beberapa tahap pemurnian yaitu: pengendapan dengan etanol; pengen-dapan dengan amonium sulfat (45 – 70%); dialisis; dan kromatografi penukar ion DEAE-selulosa. Hasil penelitian menunjukkan enzim α-amilase hasil pe-murnian mempunyai bobot molekul 48 kDa, suhu optimum 80°C dan pH optimum 6,9. Ivanova7, juga telah mela-kukan pemurnian enzim α-amilase dari B. licheniformis 44 MB 82-A dengan
menggunakan fase partisi PEG-dekstran, kromatografi penyaringan molekul Sephadex G-100, kromatografi penukar ion CM-Sepharosa CL-6B. Enzim α-amilase hasil pemurnian memberikan satu pita pada SDS-PAGE dengan bobot molekul 58 kDa.
Struktur tiga dimensi Taka amilase A dari A. oryzae8, α-amilase dari pankreas babi9, dan α-amilase asam dari Aspergillus niger10 telah diketahui. Struktur tiga di-mensi dari α-amilase yang telah diketahui merupakan multi domain dengan satu rantai-polipeptida. Hingga akhir tahun 1992, hampir 50 urutan asam amino dari α-amilase telah ditentukan, tetapi hanya urutan-urutan asam amino dari Aspergil-lus oryzae dan enzim pankreas babi yang ditentukan secara langsung, yang lainnya ditentukan melalui urutan nukleotida. Enzim α-amilase yang dihasilkan dari bakteri lokal Bacillus sp B.148 hingga saat ini belum pernah ditentukan urutan asam aminonya. Untuk mempelajari struktur α-amilase yang dihasilkan dari
bakteri lokal Bacillus sp B.148 perlu dilakukan penentuan struktur lengkap dari enzim ini. Untuk mencapai tujuan terse-but perlu dilakukan pemurnian enzim, sehingga diperoleh enzim dengan tingkat kemurnian yang tinggi. Kemurnian en-zim ditunjukkan dengan data elektrofore-gram dan dengan penentuan urutan asam amino N terminalnya.
Metode Penelitian Bahan dan Alat
Enzim α-amilase yang akan digunakan untuk penentuan N terminal diperoleh dengan mengisolasi dan memurnikan dari bakteri lokal Bacillus sp B.14811. Bahan kimia yang digunakan mempunyai derajat pro analisis.
Peralatan yang digunakan dalam peneli-tian ini adalah: Spektrofotometer UV-Visible Shimadzu; Mikropipet Socorex; Oven Memmert-Germany; Neraca ana-litis Sartorius-Germany; pH meter Fisher-Canada; Magnetic stirrer NUOVA II-USA.
Prosedur Kerja
Tahapan penelitian yang akan dilakukan adalah sebagai berikut: Pemurnian enzim dan karakterisasi enzim hasil pemurnian dengan menggunakan elektoforesis SDS gel poliakrilamida, serta penentuan urutan asam amino N terminal dengan metode gabungan dansil klorida dan degradasi Edman.
Identifikasi residu asam amino terminal
N suatu polipeptida12
Penentuan residu asam amino terminal N suatu polipeptida dilakukan dengan meto-de dansil. Pereaksi dansil klorida (1-dimetilamino naftalen-5-sulfonil klorida),
merupakan pereaksi spesifik yang hanya bereaksi dengan residu asam amino ter-minal N suatu rantai polipeptida. Selan-jutnnya dilakukan hidrolisis polipeptida menggunakan HCl 6 N untuk menghi-drolisis semua residu asam amino yang menyusun protein tersebut. Residu asam amino terminal N membentuk derivat dansil asam amino yang bersifat fluore-sensi sehingga dapat diidentifikasi di bawah sinar UV pada pelat kromatografi lapis tipis (KLT) poliamida dengan menggunakan pelarut sebagai berikut: pelarut pertama asam format 1,5%; pela-rut kedua asam asetat : toluen (1 : 9); pe-larut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2).
Penentuan residu asam amino terminal
N kedua dan ketiga12
Penentuan residu asam amino terminal N kedua dan ketiga dilakukan dengan me-tode gabungan dansil-Edman.
Dansilasi
Sebanyak 1 - 5 nmol protein dilarutkan dalam NaHCO3 0,2 M. Kemudian ditam-bahkan 10 µL DNS-Cl (2,5 mg/mL aseton) dan diinkubasi selama 1 jam pa-da suhu 37°C. Tambahkan 50 µL HCl 6 N, tabung ditutup, selanjutnya dilakukan hidrolisis pada suhu 105°C selama 18 jam. Tutup tabung dibuka, dan sisa pere-aksi dikeringkan dalam vakum yang dilengkapi zat pengering P2O5. Kemu-dian hasil reaksi dilarutkan dalam 5 µL etanol.
Kromatografi lapis tipis
Sebanyak 2 µL sampel (hasil dansilasi) ditotolkan pada pelat poliamida kira-kira 1 cm dari tiap sisi, dan dielusi dengan pelarut pertama. Eluen dibiarkan berge-rak sampai lebih kurang 1 cm dari sisi
atas, kemudian dikeringkan dengan udara panas (hair dryer). Selanjutnya pelat de-ngan posisi tegak lurus terhadap posisi pertama dielusi dengan pelarut kedua, eluen dibiarkan bergerak sampai lebih kurang 1 cm dari sisi atas, dan dike-ringkan dengan udara panas. Pelat dielusi kembali dengan pelarut ketiga, arah elusi sama dengan arah elusi kedua, dan dike-ringkan dengan udara panas. Kemudian bercak dilihat di bawah sinar UV, dan dibandingkan dengan bercak standar. Degradasi Edman
Sampel polipeptida dalam jumlah lebih besar (sekitar 100 nmol) didegradasi me-nurut cara Edman untuk menghilangkan residu asam amino ujung yang telah di-identifikasi melalui metode dansil. Uru-tan pengerjaan selanjutnya adalah sebagai berikut:
Pada sampel polipeptida kering ditam-bahkan 20 µL piridin (50%), kemudian ditambahkan 100 µL 5% PITC dalam piridin, tutup tabung disemprot dengan gas N2. Campuran dicampur dengan sek-sama dan diinkubasi pada suhu 45°C selama 60 menit. Kemudian ditambahkan 200 µL TFA anhidrat, tutup tabung disemprot dengan N2, dan diinkubasi pada 45°C selama 30 menit. Campuran dikeringkan dengan alat vakum. Selan-jutnya ditambahkan 100 µL aquadest dan dilakukan 3 kali ekstraksi dengan 1,5 mL n-butil asetat, lalu dikocok dengan seksama dan dipisahkan masing-masing dengan sentrifugasi selama 1 - 2 menit. Lapisan atas (butil asetat) dibuang dengan pipet Pasteur. Sampel dikeringkan de-ngan vakum. Selanjutnya sebagian dari sampel didansilasi untuk menentukan urutan residu asam amino terminal N kedua. Sampel yang lainnya digunakan untuk mengulangi prosedur degradasi Edman.pada penentuan urutan residu asam amino berikutnya.
Hasil dan Pembahasan Uji homogenitas dan penentuan bobot molekul enzim hasil pemurnian dengan elektroforesis SDS-gel poliakrilamida
Uji homogenitas dan penentuan bobot molekul enzim hasil pemurnian dilakukan dengan metode SDS gel poliakrilamida menurut Bollag et al.13, sebagai berikut: protein enzim direduksi dengan β-merkaptoetanol kemudian direaksikan dengan sodium dodesil sulfat (SDS), sehingga terbentuk kompleks protein-SDS yang bermuatan total negatif. Dengan adanya pengaruh medan listrik, protein yang bermuatan dalam gel poli-akrilamida akan bergerak menuju anoda. Diperoleh elektroforegram pada Gambar 1. Gambar ini menunjukkan bahwa enzim telah homogen yang ditunjukkan dengan satu pita tunggal (lajur nomor 7 dan nomor 8). Untuk menentukan bobot molekul enzim α-amilase hasil pemur-nian, dibuat grafik antara log BM terha-dap mobilitas relatif protein. Mobilitas relatif (Rf) dihitung dengan rumus berikut:
La x Dp Lb x Dw Rf =
dengan:
La: Panjang gel sebelum pewarnaan Lb: Panjang gel setelah penghilangan warna
Dp: Jarak migrasi protein Dw: Jarak migrasi zat warna
Karena panjang gel setelah pewarnaan dan setelah penghilangan warna sama maka mobilitas relatif protein (Rf) dihitung sebagai jarak migrasi protein dibagi jarak migrasi zat warna. Dengan mengalurkan logaritma bobot molekul protein standar sebagai sumbu Y terhadap mobilitas relatif sebagai sumbu X diperoleh grafik seperti pada Gambar 2.
Gambar 1. Elektroforegram SDS-gel poliakrilamida αααα-amilase hasil pemurnian
Keterangan: Bobot molekul protein standar: miosin (200,0 kDa.), β-galaktosidase (116,3 kDa.), fosfori- lase b (94,4 kDa.), albumin sapi (67,0 kDa.), glutamat dehidrogenase (55,4 kDa.), laktat dehidrogenase (36,5 kDa.), karbonat anhidrase (31,0 kDa.), tripsin inhibitor (21,5 kDa.), lisozim (14,4 kDa.), aprotinin (6 kDa.), insulin B.(3,5 kDa.). Lajur nomor 1 protein standar; lajur nomor 2 ekstrak kasar enzim; lajur nomor 3 enzim hasil fraksinasi dengan amonium sulfat; lajur nomor 4 enzim hasil pemurnian dengan DEAE- selulosa; lajur nomor 5 enzim hasil pemurnian dengan CM-selulosa; lajur nomor 6, 7, dan 8 berturut-turut enzim hasil pemurnian dengan Sephadex G-100 fraksi nomor 17, 18, dan 19
y = -0.0106x + 2.1093 R2 = 0.9893 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Mobilitas relatif (%) L o g B M
Gambar 2. Grafik semi-log αααα-amilase hasil pemurnian dari bakteri lokal Bacillus sp. B.148 Dari grafik semi-log di atas didapatkan
logaritma bobot molekul enzim tersebut sebesar 1,826, atau bobot molekul α-amilase hasil pemurnian adalah 67 kDa.
Identifikasi residu asam amino terminal N
Hasil penentuan residu asam amino terminal N pertama dari α-amilase hasil pemurnian dapat dilihat pada Gambar 3. 26,88
Fosforilase b
Glutamat dehidrogenase Laktat dehidrogenase
Lisozim Tripsin inhibitor
Karbonat anhidrase Serum albumin sapi 1,824 α αα α-amilase 116,3 94,4 67,0 55,4 36,5 31,0 5 200,0 21,5 14,4 6,0 3,5 8 7 6 1 2 3 4 α-amilase
• Pelarut 1
Gambar 3. KLT poliamida dari residu asam amino terminal N menggunakan dansil klorida. Pelarut pertama asam format 1,5%, pelarut kedua asam asetat : toluen (1 : 9), pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2)
Keterangan: A = alanin
Gambar 3 di atas menunjukkan bahwa bercak yang terbentuk setelah elusi dengan ketiga pelarut: pelarut pertama asam format 1,5%, pelarut kedua asam asetat: toluen (1 : 9), pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2), berwarna kuning kehijauan. Berdasarkan warna dan posisi bercak pada KLT dapat diperkirakan bahwa residu asam amino terminal N pertama α
-amilase hasil pemurnian adalah alanin (sesuai dengan posisi bercak standar).
Identifikasi residu asam amino terminal N kedua dan ketiga
Hasil penentuan residu asam amino terminal N kedua dapat dilihat pada Gambar 4.
• Pelarut 1
Gambar 4 KLT poliamida dari residu asam amino terminal N menggunakan metode degradasi Edman dan dansil klorida. Pelarut pertama asam format 1,5%, pelarut kedua asam asetat : toluen (1 : 9), pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2) Keterangan: H = histidin
Gambar 4. menunjukkan bahwa bercak yang terbentuk setelah elusi dengan ketiga pelarut: pelarut pertama asam format 1,5%, pelarut kedua asam asetat : toluen (1 : 9), pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2), berwarna kuning jingga. Dari warna dan posisi bercak pada KLT dapat
diperkirakan bahwa residu asam amino terminal N kedua α-amilase hasil pemurnian adalah histidin (sesuai dengan posisi bercak standar).
Penentuan residu asam amino terminal N ketiga dapat dilihat pada Gambar 5.
DNS-OH DNS-NH2 A DNS-OH DNS-NH2 A P el ar u t 3 P el ar u t 2 • • DNS-OH DNS-NH2 H DNS-OH DNS-NH2 H P el ar u t 3 P el ar u t 2 • • Pelarut 1 Pelarut 1
•
Gambar 5. KLT poliamida dari residu asam amino terminal N menggunakan metode degradasi Edman dan dansil klorida. Pelarut pertama asam format 1,5%, pelarut kedua asam asetat : toluen (1 : 9), pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2) Keterangan: P = prolin
Gambar 5. menunjukkan bahwa bahwa bercak yang terbentuk setelah elusi dengan ketiga pelarut: pelarut pertama asam format 1,5%, pelarut kedua asam asetat : toluen (1 : 9), pelarut ketiga metanol : butil asetat : asam asetat (40 : 60 : 2), berwarna kuning muda. Dari warna dan posisi bercak pada KLT dapat diperkirakan bahwa residu asam amino terminal N ketiga α-amilase hasil pemur-nian adalah prolin (sesuai dengan posisi bercak standar).
Dari penentuan residu asam amino ter-minal N menggunakan metode gabungan degradasi Edman dan dansil klorida dapat ditentukan tiga residu asam amino termi-nal N α-amilase hasil pemurnian yaitu: Ala-His-Pro-. Hasil ini menunjukkan enzim yang diperoleh sudah murni14. Urutan ini hampir sama dengan urutan residu asam amino terminal N α-amilase beberapa Bacillus sp. yang mempunyai urutan alanin diikuti alanin dan prolin (AAP) 15-17. Sedangkan urutan residu asam amino terminal N α-amilase bebe-rapa Bacillus subtilis adalah leusin, treo-nin, dan alanin (LTA)18-20.
Kesimpulan
Penelitian ini telah berhasil mendapatkan enzim α-amilase dari bakteri lokal Bacillus sp B.148 dengan tingkat kemur-nian yang tinggi dengan bobot molekul 67 kDa. Pada penentuan urutan asam amino N terminal enzim α-amilase hasil pemurnian menunjukkan tiga residu asam amino yaitu: Ala-His-Pro-.
Daftar Pustaka
1. Fuwa, H. 1954. A new method for mi-crodetermination of amylase activity by the use of amylose as the substrate, J. Biochem. (Tokyo), 41, 583-603.
2. Mandels, M., Raymond, A., Charles, R. 1976. Measurement of sacchari-fying cellulase, Biotech. & Bioeng. Symp., No. 6, John Wiley & Sons Inc.
3. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. 1951. Protein mea-surment with the Folin phenol rea-gent, J. Biol. Chem., 193-265.
4. Fogarty, W.M. and Kelly, C.T. 1979. Enzyme and Fermentation
Biotech-DNS-OH DNS-NH2 P DNS-OH DNS-NH2 P P el ar u t 3 P el ar u t 2 • • Pelarut 1
nology, Ellis Horwood Limited, West Sussex, England, pp.45-52.
5. Janecek, S. and Balaz, S. 1992. α -Amylase and approaches leading to their enhanced stability, Febs Lett.,
304 (1), 1-3.
6. Srivastava, R.A.K. 1987. Purification and chemical characterization of ther-mostable amylases produced by Ba-cillus stearothermophilus, Enzyme Microb. Technol., 9, 749-754.
7. Ivanova,V.N., Dobreva, E.P., Ema-nuilova, E.I. 1993. Purifications and characterization of a thermostable α-amylase from Bacillus licheniformis, J. Biotechnol ., 28, 277-289.
8. Matsuura, Y., Kusunoki, M., Harada, W. and Kakudo, M.1984. Structure and possible catalytic residues of Taka-amylase A., J. Biochem., 95, 697-702.
9. Buisson, G., Duee, E., Haser, R. and Payan, F.1987. Three dimensional structure of porcina pancreatic α-amylase at 2.9 Å resolution. role of calcium in structure and activity, EMBO J., 6, 3909-3916.
10. Boel, E., Brady, L., Brozozowski, A.M., Derewenda, Z., Dodson, G.G., Jensen, V.J., Petersen, S.B., Swift, H., Thim, L. and Woldike, H.F. 1990. Biochemistry, 29, 6244-6249.
11. Yandri, A.S. 2000. Isolasi, pemurnian dan karakterisasi enzim α-amilase termostabil dari bakteri lokal Bacillus
sp B. 148, Prosiding Kimia Bersama ITB-UKM Keempat, Bandung, 294-302.
12. Findlay, J.B.C. and Geisow, M.J. 1989. Protein Sequencing, Oxford Univ., New York, 134-144.
13. Bollag, D. M., Rozycki, M. D., Edelstein, S. J. 1996. Protein Methods 2 nd ed., John Wiley & Sons, Inc., Publication, New York, 91-93; 232-274.
14. Scopes, R. K. (1994), Protein Purification 3 rd ed., Springer–Verlag, New York., 308-309.
15. Itkor P., N. Tsukagoshi, S. Udaka (1990), Nucleotide sequence of the raw-starch-digesting amylase gene from Bacillus sp. B1018 and its strong homology to the cyclodextrin glucanotransferase genes, Biochem. Biophys. Res. Commun., 166, 630-636.
16. Sidhu, G.S., Chakarbarti, T. 1996. Molecular cloning and expression of the gene encoding for thermostable alphamylase of a thermophilic bacte-rial isolate, EMBL/GenBank/DDBJ databases.
17. Sumitani, J., Tottori, T., Kawaguchi, T., Arai, M. 2002. New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp. no. 195 Alpha-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading, Biochem. J., 350, 477-484.
18. Fujimoto, Z., Takase, K., Doui, N., Momma, M., Matsumoto, T. and
Mizuno, H. 1998. Crystal structure of a catalityc-site mutant α-amylase from Bacillus subtilis complexed with maltopentaose, J. Mol. Biol., 277, 393-407.
19. Kunst F., Ogasawara, N., Moszer, I., Albertini, A.M., G. Alloni, V. Aze-vedo, M. G. Bertero, Bessieres, P. et al. 1997. The complete genome sequence of the Gram-positive
Bacterium Bacillus subtilis, Nature,
390/6657, 249-256.
20. Ohmura, K., Yamazaki, H., Takeichi, Y., Nakayama, A., Otozai, K., Yamane, K., Yamasaki, M., Tamura, G. 1983. Nucleotide sequence of the promoter and NH2-terminal signal peptide region of Bacillus subtilis alpha-amylase gene cloned in puB110, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 678-683.
