Peralatan laboratorium biologi
molekuler
dr. Syazili Mustofa, M. Biomed
Kepala Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Biologi Molekuler
Fakultas Kedokteran Universitas Lampung
Peralatan laboratorium biologi
molekuler
•
Autoklav
•
Sentrifuga
•
Air displacement pippete
•
biosafety cabinet (BSC)
•
Plate readers
Autoklaf
•
Alat untuk mensterilkan
peralatan dan
perlengkapan dengan
memasukkannya ke uap
bertekanan tinggi pada 121
° C atau lebih selama
kurang lebih 15 menit.
•
Peningkatan tekanan pada
autoklaf tidak
dimaksudkan untuk
membunuh
mikroorganisme,
melainkan meningkatkan
suhu dalam autoklaf. Suhu
yang tinggi inilah yang
akan membunuh
microorganisme.
Autoklaf
•
Autoklaf terutama
ditujukan untuk
membunuh
endospora
,
yaitu
sel
resisten yang
diproduksi oleh
bakteri
, sel
ini tahan terhadap
pemanasan, kekeringan,
dan antibiotik. Pada
spesies yang sama,
endospora dapat bertahan
pada kondisi lingkungan
yang dapat membunuh sel
vegetatif bakteri tersebut.
Endospora dapat dibunuh
pada suhu 100 °C, yang
merupakan titik didih air
pada tekanan atmosfer
normal.
Autoklaf
•
Pada suhu 121 °C,
endospora dapat
dibunuh dalam waktu
4-5 menit, di mana sel
vegetatif bakteri dapat
dibunuh hanya dalam
waktu 6-30 detik pada
suhu 65 °C
•
Perhitungan waktu
sterilisasi autoklaf
dimulai ketika suhu di
dalam autoklaf
Autoklaf
•
Jika objek yang disterilisasi
cukup tebal atau banyak,
transfer panas pada bagian
dalam autoklaf akan
melambat, sehingga terjadi
perpanjangan waktu
pemanasan total untuk
memastikan bahwa semua
objek bersuhu 121 °C untuk
waktu 10-15 menit.
•
Perpanjangan waktu juga
dibutuhkan ketika cairan dalam
volume besar akan diautoklaf
karena volume yang besar
membutuhkan waktu yang
lebih lama untuk mencapai
suhu sterilisasi
[. Performa
autoklaf diuji dengan indicator
biologi, contohnya
Bacillus
jangan mengautoklaf
•
bahan yang mudah terbakar, reaktif, korosif, beracun
atau radioaktif.
•
Jangan pernah mengautoklaf pemutih kering atau
bahan terkait pemutih atau nitroselulosa karena kedua
senyawa tersebut menimbulkan risiko kebakaran atau
ledakan.
•
Jas lab yang telah terkontaminasi bahan kimia tidak
boleh diautoklaf tetapi dibersihkan oleh layanan binatu
yang disetujui atau dibuang sebagai limbah kimia.
•
Bahan radioaktif
•
Limbah patologis: Termasuk bangkai hewan, jaringan
dan organ serta jaringan dan organ manusia.
Sentrifugasi
•
Teknik sentrifugasi telah
dimanfaatkan baik untuk
keperluan penelitian
misalnya pada bidang
biologi sel dan bioloi
molekuler, maupun untuk
industri, misalnya dalam
pengayaan uranium dan
pengolahan anggur.
Sentrifugasi
•
Proses yang melibatkan
penggunaan gaya sentrifugal
untuk pemisahan campuran
dan menghasilkan
sedimentasi dengan
menggunakan mesin
sentrifuga.
•
Komponen campuran yang
lebih rapat akan bergerak
menjauh dari sumbu
sentrifuga dan membentuk
endapan (pelet) menyisakan
cairan supernatan yang
dapat diambil dengan
dekantasi.
Sentrifugasi
•
Komponen yang lebih
padat dari campuran
bermigrasi menjauh
dari sumbu sentrifus,
sementara komponen
yang kurang padat dari
campuran bermigrasi
ke arah sumbu.
•
Peningkatan gaya
gravitasi efektif pada
tabung
reaksi lebih
cepat dan sempurna
menyebabkan endapan
("pelet") berkumpul di
bagian bawah tabung.
Sentrifugasi
•
Solusi yang tersisa
dengan tepat disebut
"supernate" atau
"supernatant liquid".
•
Cairan supernatan
kemudian dengan
cepat tertuang dari
tabung tanpa
mengganggu
endapan, atau ditarik
dengan pipet Pasteur.
Sentrifugasi
• Laju sentrifugasi ditentukan oleh percepatan yang diterapkan pada sampel, biasanya diukur dalam putaran per menit (RPM) atau g.
• Kecepatan pengendapan partikel dalam sentrifugasi bergantung pada ukuran dan bentuknya, percepatan sentrifugal, fraksi volume padatan yang ada, perbedaan densitas antara partikel dan cairan, dan
viskositas.
Homogenat sel Mitokondria, lisosom, peroksisom Mikrosom dan vesikel kecil lainnya Sel utuh, nukleus, sitoskelet on Ribosom , virus, makromolekul besar
mikropipet
•
alat yang digunakan untuk mengambil
dan/atau memindahkan cairan dalam jumlah
kecil secara akurat.
•
Sebenarnya mikropipet mempunyai fungsi
seperti pipet biasa, yaitu untuk memindahkan
cairan atau larutan. Hanya saja beda akurasi
antara mikropipet dengan pipet biasa.”
mikropipet
•
Fungsi dari mikropipet ini digunakan untuk
memindahkan cairan dalam jumlah yang kecil(mikro)
secara akurat.
•
Jika kita sebelumnya pernah pakai pipet ukur gelas,
tentu akurasinya kurang presisi
•
Mikropipet juga sering disebut dengan pipet otomatis.
Selain tingkat ke-presisiannya yang tinggi dan volume
yang bisa di setting, alat yang satu ini juga mudah dan
nyaman dalam genggaman.
•
Penggunaan mikropipet sebagai alat bantu di
laboratorium tentu sangat penting guna mendukung
aplikasi atau expertiment yang sedang di kerjakan.
Jenis
•
berdasarkan jumlah channel pada mikropipet:
– Single channel(hanya memiliki satu ujung masuk dan keluar)
– Multi channel(memiliki banyak ujung masuk dan keluar)
•
berdasarkan teknologi :
– Mikropipet Manual(butuh penekanan)
– Mikropipet Otomatis(dilengkapi dengan motor, modul elektronik, display elektronik)
•
berdasarkan volume :
– Fixed volume mikropipet
– Variable volume mikropipet
•
fiturnya:
– Mikropipet tanpa fitur autoclavable
•
Tombol penekan / button /
Plunger button, berfungsi untuk
menyedot atau memompa
larutan atau cairan dengan cara
menekannya.
•
Scale volume / parameter knob
/ tuas penyetel volume cairan,
hanya terdapat di mikropipet
dengan tipe variable volume.
•
Tuas fungsi / function wheel,
tuas yang digunakan untuk
memilih menu pada mikropipet,
karena beberapa mikropipet
bisa saja memiliki beberapa
fungsi seperti(menyedot,
memompa, mencampur)
•
Pipet tip / pipet tipcone / tips,
merupakan aksesoris tambahan
yang sangat penting karena
mempengaruhi ke akuratan
cairan dalam proses menyedot
dan memompa larutan.
•
Display / elektronik display /
parameter volume, merupakan
bagian yang memberikan
gambaran berapa volume yang
sedang di set.
Air displacement
pipette
Mikropipet dapat mengambil volume minimum 0,2 µL dan volume maksimum 10.000 µL (10 mL).
Volume pipet yang tersedia secara
umum
Rentang volume pipet yang kecil seperti 10–100 µL menghasilkan akurasi yang jauh lebih tinggi daripada rentang luas dari 0,1–1.000 µL per pipet.
Sebaiknya pilih pipet terkecil yang dapat menangani volume yang dibutuhkan. Ini penting karena keakuratan menurun jika volume yang disetel mendekati kapasitas minimum pipet. Misalnya, jika 50 µl dibagikan dengan menggunakan pipet 5.000 µl, hasilnya akan kurang akurat dibandingkan penggunaan pipet 300 µl akan memberikan hasil yang lebih baik, sedangkan penggunaan pipet 50 µl akan lebih ideal
Cara Menggunakan Mikropipet
•
Atur volume mikropipet dengan
memutar/menekan tombol volume navigasi
sesuai dengan yang dibutuhkan.
•
Pasang Tips mikropipet sesuai dengan
kebutuhan, proses pemasangan tips yang
dianjurkan adalah dengan
Cara Menggunakan Mikropipet
•
Memegang mikropipet dengan kondisi tangan yang
nyaman, beberapa artikel menyebutnya menyerupai
simbol tangan like di facebook.
•
Menyedot masuk dan memompa keluar cairan sesuai
dengan kebutuhan. Pastikan anda melakukannya
dengan cara yang benar dan tidak terburu-buru.
Beberapa jenis mikropipet memiliki sensitifitas yang
berbeda-beda pada setiap buttonnya. Jika anda pernah
menggunakan beberapa jenis mikropipet, tentu anda
bisa merasakan perbedaan pada setiap jenis
mikropipet dan merk mikropipet seperti scilogex,
thermo dan fischerbrand.
biosafety cabinet (BSC)
•
ruang kerja
laboratorium tertutup
dan berventilasi untuk
bekerja dengan aman
dengan bahan yang
terkontaminasi (atau
berpotensi
terkontaminasi)
patogen yang
memerlukan tingkat
keamanan hayati yang
ditentukan.
•
Tujuan utama BSC adalah berfungsi sebagai
sarana untuk melindungi pekerja laboratorium
dan lingkungan sekitarnya dari patogen. Semua
udara buangan disaring HEPA saat keluar dari
Tipe
1. Biosafety Kelas I
kecepatan minimum 0,38 m/s. Sementara, jendela depan ruangan tetap dibiarkan terbuka agar udara dapat masuk dan disaring dengan HEPA
Filter. Dalam kelas ini, memang akan ada risiko kontaminasi pada sampel. Biasanya, biosafety ini digunakan untuk peralatan khusus seperti
centrifuge.
2. Biosafety Kelas II
Di kelas ini, biosafety yang diproteksi ada dua, yaitu produk sampel dan lingkungan. Cara kerjanya, udara dari luar + chamber ditarik oleh kipas hisap yang dipasang di atas lemari, kemudian disaring dengan HEPA Filter, baru digunakan untuk sirkulasi atau balik keluar kembali. Dengan sistem seperti ini, personel tetap aman karena udara diarahkan pada sistem saringan.
3. Biosafety Kelas III
Pada kelas ini, perlindungan yang diberikan sangat maksimal, meliputi personel, produk sampel, dan lingkungan. Ruangan didesain sedemikian rupa sehingga sirkulasi udara di dalam chambar tertutup rapat. Semua material yang keluar masuk harus menggunakan pass box. Personel juga harus menggunakan sarung tangan agar tidak langsung dengan produk sampel saat bekerja.
Plate readers
•
adalah instrumen yang
digunakan untuk
mendeteksi peristiwa
biologis, kimiawi, atau fisik
sampel di pelat mikrotiter.
•
banyak digunakan di
laboratorium untuk
berbagai aplikasi, mulai dari
enzyme-linked
immunosorbent assays
(ELISA) hingga pengukuran
NADH, deteksi interaksi
protein-protein hingga
pengujian anggur.
Microplate reader juga
banyak digunakan dalam
penelitian dasar, imunologi,
validasi bioassay,
pengembangan obat dan
proteomik.
Plate readers
•
Instrumen multiguna
ini memfasilitasi
penelitian dengan
meminimalkan waktu
operasional,
meningkatkan proses
dan efisiensi dan
menghemat biaya.
•
Reaksi sampel dapat
diuji dalam pelat
mikrotiter format
1-1536 dengan baik.
Plate readers
• Format pelat mikro yang paling umum digunakan di laboratorium penelitian akademis atau
laboratorium diagnostik klinis adalah 96 lubang (matriks 8 kali 12) dengan volume reaksi tipikal antara 100 dan 200 µL per sumur.
• Pelat mikro dengan kepadatan lebih tinggi (pelat mikro 384 atau 1536 sumur) biasanya digunakan untuk aplikasi skrining, ketika banyak jumlah sampel per hari yang diproses dan biaya pengujian per sampel menjadi parameter penting, dengan volume pengujian tipikal antara 5 dan 50 µL per
Plate readers
• Format pelat mikro yang paling umum digunakan di laboratorium penelitian akademis atau
laboratorium diagnostik klinis adalah 96 lubang (matriks 8 kali 12) dengan volume reaksi tipikal antara 100 dan 200 µL per sumur.
• Pelat mikro dengan kepadatan lebih tinggi (pelat mikro 384 atau 1536 sumur) biasanya digunakan untuk aplikasi skrining, ketika banyak jumlah sampel per hari yang diproses dan biaya pengujian per sampel menjadi parameter penting, dengan volume pengujian tipikal antara 5 dan 50 µL per
• Banyak mode pendeteksian – absorbansi – intensitas fluoresensi – Luminesensi – fluoresensi yang diselesaikan waktu – polarisasi fluoresensi)
• tersedia berdiri sendiri di pembaca pelat khusus, tetapi sangat sering ditemukan saat ini digabungkan menjadi
satu instrumen (pembaca pelat multi-mode).
• Ada juga instrumen untuk mengukur cahaya
dinamis atau statis yang tersebar dari sampel dalam pelat mikro.
• Kisaran aplikasi untuk pembaca pelat multi-mode sangat besar.
CARA KERJA
•
Pembaca pelat mikro mendeteksi sinyal cahaya
yang dihasilkan oleh sampel yang telah dipipet ke
dalam pelat mikro.
•
sinyal cahaya yang dihasilkan oleh sampel, diubah
oleh sampel atau dikirim melalui sampel
kemudian
diukur dengan detektor, biasanya
photomultiplier tube
(PMT).
•
PMT mengubah foton menjadi listrik yang
kemudian diukur oleh microplate reader.
Keluaran dari proses ini adalah angka-angka
dimana sampel dihitung.
•
Beberapa tes yang paling umum adalah:
–
ELISA
–
Tes pertumbuhan protein dan sel Protein
–
interaksi protein
–
Tes reporter
–
Kuantitasi asam nukleat
–
Interaksi molekuler
–
Aktivitas enzim
–
Toksisitas sel, proliferasi, dan viabilitas
–
Kuantifikasi ATP
Thermal cycler
•
juga dikenal sebagai thermocycler, mesin PCR atau penguat
DNA
•
peralatan laboratorium yang paling umum digunakan untuk
memperkuat segmen DNA melalui polymerase chain
reaction (PCR).
•
juga dapat digunakan di laboratorium untuk memfasilitasi
reaksi sensitif suhu lainnya, termasuk pencernaan enzim
restriksi atau diagnosis cepat.
•
Perangkat memiliki blok termal dengan lubang di mana
tabung yang menahan campuran reaksi dapat dimasukkan.
Mesin ini kemudian menaikkan dan menurunkan suhu blok
secara terpisah, langkah-langkah yang telah diprogram
•
blok termal dengan lubang dapat menampung
tabung reaksi (tube) yang menampung
reagensia. Thermal Cycler kemudian
mengontrol suhu, naik dan turun sesuai
dengan program yang dimasukan kedalam
komputer PCR tersebut, sehingga proses
polymerase chain reaction (PCR) terjadi
Komponen pelengkap mesin PCR
• Taq polymerase, yaitu enzim DNA polimerase stabil yang berhasil diisolasi dari bakteri termofilik ekstrem Thermus aquaticus yang hidup pada dinding geyser vulkanik. Sifatnya yang thermostabil membuat Taq polymerase ideal untuk digunakan pada tahap pemisahan (denaturasi) template DNA.
• Primer juga dibutuhkan, sekuen nukleotida pendek yang dapat
menginisiasi starting point dari sintesis DNA. Dalam reaksi berantai (Polimerase Chain Reaction) PCR, pelaku eksperimen sudah
menentukan sebelumnya daerah DNA mana yang akan dikopi dan diamplifikasi dengan memilih urutan primer mana yang akan
digunakan. Primer PCR berupa single stranded DNA dan panjangnya berukuran sekitar 20 nukleotida. Pada prinsip kerja PCR, digunakan sebanyak 2 primer yang didesain mengapit daerah DNA yang ingin diperbanyak.
