OPTIMASI PRODUKSI PROTEIN NON STRUKTURAL 1 (NS1) VIRUS
DENGUE SEROTIPE 3 (DENV-3)
Fifit Juniarti1,∗, Doddy Irawan1, Subintoro1, Khayu Wahyunita1, Aris Rudiyanto1, Chaerul Malik1, dan Vanny Narita2 1Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi
Jl. MH. Thamrin 8, Jakarta Pusat 10340 2Universitas Al Azhar Indonesia Komplek Masjid Agung Al Azhar, Jakarta 12110
∗
e-Mail: [email protected] Disajikan 29-30 Nop 2012
ABSTRAK
Wabah demam berdarah dengue hingga saat ini masih merupakan salah satu masalah kesehatan yang utama di daerah tropikal dan sub tropikal di seluruh dunia termasuk Indonesia. Demam berdarah dengue disebabkan oleh infeksi virus dengue, dimana serotipe DENV-3 dari keempat serotipe virus dengue seringkali dikaitkan dengan kasus yang parah. Protein NS1, salah satu protein nonstruktural dalam virus dengue, merupakan protein potensial untuk dikembangkan sebagai kandidat vaksin maupun bahan dasar kit diagnostika. Studi ini bertujuan memperoleh metode produksi protein rekombinan NS1 virus Dengue serotype DENV-3 dalam Escherichia coli (E. coli). Pemilihan sistem ekspresi dalam E. coli didasarkan pada E. coli sebagai sistem ekspresi yang telah banyak dipelajari memiliki berbagai sistem salah satunya sistem Glutathione S-transferase (GST) yang dapat mengekspresi, purifikasi dan deteksi protein rekombinan.Dalam studi ini telah dilakukan optimasi suhu induksi dan metode lisis sel untuk memperoleh kondisi optimal produksi protein rekombinan NS1 dalam E. coli. Hasil studi menunjukkan bahwa kondisi optimal untuk induksi ekspresi protein rekombinan dengan IPTG adalah pada suhu 25◦C selama overnight. Setelah
membandingkan berbagai metode lisis sel baik secara fisik, kimiawi maupun kombinasi dapat disimpulkan bahwa metode optimal untuk lisis sel adalah kombinasi fisik dan kimiawi yakni dengan sonikasi namun menggunakan buffer lisis. Dalam studi ini juga dikembangkan metode deteksi protein rekombinan NS1 dengan pendekatan dot blot dan ELISA, metode ini dikembangkan karena lebih cepat dan murah dibandingkan Western blot. Kedua metode ini diharapkan dapat dikembangkan lebih lanjut menjadi kit diagnostika berbasis protein rekombinan NS1 virus Dengue serotype DENV-3.
Kata Kunci: DENV-3, protein rekombinan NS1, Escherichia coli (E. coli), Glutathione S-transferase (GST)
I.
PENDAHULUAN
Hingga saat ini, demam berdarah dengue masih menjadi masalah kesehatan di Indonesia. Kasus demam berdarah pertama kali ditemukan di Indonesia pada tahun 1968 dan terus terjadi hingga saat ini. Namun jumlah kematian yang disebabkan demam berdarah dengue saat ini sudah mulai menurun hal ini dise-babkan oleh meningkatnya pengetahuan masyarakat dan fasilitas layanan kesehatan akan penyakit tersebut, terdapatnya sistem diagnostik yang lebih baik serta ter-dapatnya protokol penanganan yang lebih baik.[2]Virus dengue memiliki 4 serotipe yakni DENV1-DENV4. Di Indonesia, keempat serotype virus dengue telah dite-mukan namun DENV-3 seringkali dikaitkan dengan kasus demam berdarah yang parah.[2] Virus dengue adalah virus dengan genom RNA beruntai tunggal positif yang menkode tiga protein struktural yakni C, PrM/ M dan E serta tujuh protein nonstruktural (NS1,
NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B dan NS5).[3] Protein NS1 merupakan glikoprotein 48 kDa yang fungsinya sebagai ko-faktor untuk replikasi virus.[4] Protein NS1 ditemukan sebagai protein tersekresi maupun terkait sebagai protein membrane. Kedua bentuk protein sama sama bersifat imunogenik.[5] Penelitian oleh Schlesingeret al.menunjukkan bahwa imunisasi hewan coba dengan protein NS1 dapat memicu terbentuknya imun respon protektif dimana antibodi anti-NS1 dapat melindungi terhadap infeksi virus dengue. Sehingga protein NS1 merupakan kandidat untuk vaksin.[6]
Selain itu, protein NS1 juga merupakan kandidat un-tuk deteksi karena antibodi anti-NS1 dapat ditemukan di pasien penderita demam berdarah baik yang terkena infeksi primer maupun sekunder.[7]
Potensi protein rekombinan NS1 terutama dari serotipe DENV-3 sebagai bahan dasar kit diagnostika dan vaksin sangat besar. Studi ini bertujuan
mempro-duksi protein rekombinan NS1 yang dapat digunakan sebagai bahan dasar kit diagnostika.
Protein rekombinan dapat diproduksi dalam bebe-rapa sistem ekspresi seperti bakteri, yeast (jamur), ta-naman maupun sel mamalia dalam kultur. Masing-masing sistem ekspresi memiliki kelebihan dan ke-kurangan masing masing seperti terangkum dalam
TABEL1.[8]
Dalam studi ini, protein rekombinan NS1 diekspre-sikan dalam E. coli walaupun sistem ini memiliki be-berapa kekurangan namun sebagai sistem yang paling banyak dipelajari memiliki banyak keuntungan seperti terlihat dalam Tabel 2.[8]
Dari berbagai sistem yang telah dikembangkan un-tuk ekspresi protein rekombinan dalam E. coli, sistem Glutathione S-transferase (GST) dapat mengekspresi, purifikasi dan deteksi protein rekombinan. Sistem ini berbasis pada ekspresi gen yang difusikan dengan GST untuk mempermudah deteksi dan purifikasi. Selain itu ekspresi gen yang tinggi dapat dikontrol karena memer-lukan induksi untuk ekspresi.[9]
Salah satu permasalahan yang dihadapi dalam mem-produksi protein rekombinan dalam E. coli adalah ter-bentuknya inclusion body yakni protein rekombinan beragregat dalam bentuk tidak larut dalam sitoplasma. Fenomena ini menjadi kendala dalam efisiensi produksi protein rekombinan.
Salah satu faktor penentu terbentuknya inclusion body adalah suhu induksi dan konsentrasi IPTGyang digunakan.[10] Selain itu, metode lisis sel E. coli akan menentukan efisiensi produksi protein rekombinan. Studi ini bertujuan memperoleh metode optimal untuk produksi protein rekombinan NS1 dalam E. coli.
II.
METODOLOGI
Gen NS1
Gen NS1 yang digunakan adalah gen NS1 DEN-3 strain KJ71 yang diisolasi dari pasien di Jakarta pada KLB tahun 2004. Sample diperoleh dari kerjasama Pusat Teknologi Farmasi dan Medika - BPPT dengan Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran - Uni-versitas Indonesia.
Vektor pGEX-6P1
Vektor ekspresi yang digunakan adalah pGEX-6P1 dari GE Healthcare. Vektor ini menggunakan promo-tor tac yang ekspresinya diinduksi dengan isopropyl
β-D thiogalactoside (IPTG) dan memiliki gen AmpR sehingga ampisilin dapat digunakan untuk seleksi Es-cherichia coli (E. coli) rekombinan.[8]
Sel Inang Eschericia coli BL21 StarTM
Sel inang yang digunakan adalah Eschericia coli BL21 StarTM. E. coli BL21 memiliki adalah strain E. coli yang protease-minussehingga menguntungkan un-tuk digunakan sebagai sistem ekspresi.[8]
Plasmid rekombinan pGEX-NS1
Secara ringkas, plasmid pGEX-6P1 dan gen NS1 DEN-3 strain KJ71 yang telah dipotong menggunakan enzim BamH1 dan Xho1 kemudian dipurifikasi dan di-lakukan proses ligasi menggunakan enzim T4 ligase.
E. coli BL21 rekombinan
E.coli BL21 rekombinan dihasilkan dari proses trans-formasi E.coli BL21 dengan hasil ligasi plasmid pGEX-6P1 dan gen NS1 DEN-3. Proses transformasi di-lakukan menggunakan metode CaCl2. Hasil trans-formasi kemudian diseleksi menggunakan metode α -komplementasi, single-digestion BamH1 dan PCR.
Ekstraksi protein rekombinan NS1
Optimasi proses ekstraksi protein NS1 dilakukan un-tuk memperoleh metode optimal unun-tuk ekspresi. Fak-tor yang dioptimasi antara kondisi induksi dan metode ekstraksi. Secara garis besar, E. coli BL21 rekombinan yang telah ditumbuhkan overnight disubkultur dan kultur dengan OD6000.2 diinduksi dengan IPTG.
Sete-lah diinduksi, E. coli rekombinan kemudian dilisis se-cara fisik maupun kimiawi untuk memperoleh protein rekombinan NS1. Hasil lisis kemudian disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dan pelet yang kemu-dian kemu-dianalisis untuk mendeteksi keberadaan protein rekombinan NS1.
Lisis E. coli recombinan
Setelah E. coli rekombinan diinduksi dengan IPTG guna mengekspresikan protein rekombinan, E. coli dili-sis untuk memecah dinding sel dengan metode sebagai berikut:
Sonikasi. Pelet E. coli rekombinan diresuspensi dalam PBS kemudian disonikasi selama 5 detik 20 kali. Kemudian hasil sonikasi disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dan pellet.
Frozen sonikasi. Pelet E. coli rekombinan dibekukan dalam Nitrogen cair sebelum diresuspensi dalam PBS kemudian disonikasi selama 5 detik 20 kali. Kemudian hasil sonikasi disentrifugasi untuk memisahkan super-natan dan pellet.
B-PER. B-PERR Bacterial Protein Extraction Reagent adalah reagen untuk ekstraksi protein rekombinan dari Thermo Fisher Scientific Inc. Reagen ini mengguna-kan deterjen nonionic dalam 20 mM Tris·HCl (pH 7.5) untuk melisis sel bakteri. Pelet E. coli rekombinan diresuspensi dalam reagen B-PER, divorteks dan di-inkubasi selama 10-15 menit sebelum disentrifugasi un-tuk memisahkan supernatan dan pelet.
Frozen B-PER. Pelet E. coli rekombinan dibekukan dalam Nitrogen cair sebelum diresuspensi dalam reagen B-PER, divorteks dan diinkubasi selama 10-15 menit sebelum disentrifugasi untuk memisahkan su-pernatan dan pelet.
Kombinasi sonikasi dan B-PER. Pelet E. coli rekom-binan diresuspensi dalam PBS kemudian disonikasi
se-TABEL1: Perbandingan berbagai system ekspresi protein rekombinan
Bakteri Jamur (yeast) Kultur sel tanaman Kultur sel mamalia Keuntungan •Hasil tinggi
•Berbagai pilihan system •Biomassa •Dapat disekresi •Biomassa •Dapat disekresi •Dapat disekresi •Dapat digunakan untuk molekul kompleks Kekurangan •Tidak ada
modifikasi post translasi
•Sulit disekresikan
•Profil glikosilasi belum tentu tepat
•Profil glikosilasi belum tentu tepat
•Hasil rendah
Scale-up •Potensi sangat bagus
•Potensi sangat bagus
•Tidak terbatas •Potensi bagus
Harga •Rendah hingga
menengah
•Rendah hingga menengah
•Rendah •Tinggi hingga sangat tinggi Tahap
pengembangan
•Produksi •Produksi •Pengembangan •Produksi
TABEL2: Karakteristik sistem ekspresi E. coli
Keuntungan Kekurangan
.Ekspresi cepat .Tidak ada modifikasi post translasi
.Hasil tinggi .Protein diproduksi dengan endotoksin
.Modifikasi kultur dan genom mudah .Protein diproduksi dalam inclusion body
.Tidak mahal
.Produksi skala besar cepat dan murah
lama 5 detik 20 kali. B-PER ditambahkan kepada hasil sonikasidivorteks dan diinkubasi selama 10-15 menit sebelum disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dan pelet.
Freeze thaw. Pelet E. coli rekombinan diresuspensi dalam PBS kemudiandimasukan ke dalam Nitrogen cair selama 1 menit dan dimasukan ke dalam air men-didih selama 30 detik atau 1 menit, diulang sebanyak 5 kali. Kemudian hasil freeze thaw disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dan pellet.
Deteksi Protein Rekombinan NS1
Protein rekombinan NS1 dideteksi dengan tiga metode yakni 1) Western blot, 2) Dot blot dan 3) ELISA. Metode dot blot dan ELISA dikembangkan untuk dapat menapis secara cepat protein rekombinan NS1.
Western Blot. Gel poliakrilamid ditransfer ke mem-bran nitroselulosa. Setelah protein ditransfer, memmem-bran direndam dalam larutan Ponceau S. dan dicuci dalam larutan asam asetat. Membran kemudian diblocking dengan skim milk dalam PBST overnight. Selanjutnya, membran diinkubasi dengan antibodi anti GST-HRP se-lama 2 jam. Kemudian membran dicuci dengan PBST. Untuk visualisasi membran direndam dalam substrat DAB (3,3’-Diaminobenzidine) dalam keadaan gelap.
Dot Blot. Protein rekombinan diteteskna pada po-tongan membrane nitroselulose dan dibiarkan sampai kering di suhu ruang. Membran kemudian diblocking
dengan skim milk dalam PBST overnight. Selanjutnya, membran diinkubasi dengan antibodi anti GST-HRP se-lama 2 jam. Kemudian membran dicuci dengan PBST. Untuk visualisasi membran direndam dalam substrat DAB (3,3’-Diaminobenzidine) dalam keadaan gelap.
ELISA.96 well plate di coating dengan protein rekombinan dalam coating buffer (Na2CO3, NaHCO3
dan H2O) overnight. Plate kemudian diblocking
dengan skim milkselama 2 dicuci dengan PBST. Se-lanjutnya, membran diinkubasi dengan antibodi anti GST-HRP selama 2 jam. Kemudian membran dicuci dengan PBST. Untuk visualisasi membran direndam dalam substrat TMB(3,3f,5,5f-Tetramethylbenzidine) dalam keadaan gelap. Reaksi dihentikan dengan Stop Solution. Hasil dibaca menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm.
III.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Konstruksi plasmid rekombinan pGEX-NS1.Plasmid rekombinan pGEX-NS1 yang telah ditransformasi ke dalam E. coli diverifikasi dengan metode digesti meng-gunakan enzim restriksi BamHI. Enzim BamHI dipilih sebagai enzim verifikasi karena dapat memotong plas-mid rekombinan satu tempat pada situs perlekatan (lig-asi) plasmid pGEX-6P1 dan gen NS1 dengue sehingga pita DNA yang tampak pada hasil elektroforesis adalah pita linier tunggal berukuran 6.120 pb, hasil ligasi
frag-men gen NS1 dengue (∼1.160 pb) dan vektor pGEX-6P1 (4.960 pb) (GAMBAR1).
GAMBAR1: Hasil verifikasi plasmid rekombinan pGEX-NS1 de-ngan digesti BamHI. M: Marker 1kb Plus DNA ladders, 1: Kontrol plasmid pGEX-6P1, 2: Plasmid rekombinan pGEX-NS1
Selain itu hasil transformasi E. coli dengan plasmid rekombinan pGEX-NS1 diverifikasi dengan amplifikasi PCR dan hasil pada gel agarosa merupakan fragmen gen NS1 dengue berukuran 1.160 pb (GAMBAR2).
Induksi ekspresi protein rekombinan NS1 dengan IPTG.Berbagai literatur menyatakan bahwa suhu dan lama induksi dapat mempengaruhi terbentuknya clusion body. Studi ini melakukan optimasi suhu in-duksi yakni 29◦C dan 25◦C serta lama induksi yakni overnight dan 1 jam. Hipotesanya adalah apabila in-duksi dilakukan pada suhu rendah dan cepat maka pro-tein rekombinan akan diproduksi secara perlahan dan waktu induksi yang cepat membuat protein rekombi-nan masih larut tidak membentuk inclusion body.
Induksi E. coli rekombinan pada suhu 29◦C dengan
IPTG overnight menghasilkan protein yang larut (su-pernatan) walaupun masih sangat sedikit dibanding-kan dengan induksi IPTG 1 jam (GAMBAR3). Sehingga dapat disimpulkan bahwa induksi selama 1 jam belum cukup lama untuk memproduksi protein rekombinan dalam jumlah yang cukup untuk dideteksi.
Namun, ketika induksi IPTG dilakukan pada suhu 25◦C terlihat bahwa produksi protein rekombinan yang larut (supernatant) sudah semakin banyak namun
GAMBAR2: Hasil verifikasi plasmid rekombinan pGEX-NS1 de-ngan amplifikasi PCR. 1: Kontrol negatif PCR, 2: Kontrol positif PCR,3: Plasmid rekombinan pGEX-NS1, M: Marker DNA 1 kb Plus DNA Ladders
GAMBAR3: SDS-page pada induksi IPTG pada suhu 29◦C dan
lisis E. coli dengan sonikasi. M: Marker page ruler prestained lad-der, 1: BL21 pellet induksi overnight, 2: BL21 supernatan induksi overnight, 3: pGEX pellet induksi overnight, 4: pGEX supernatan induksi overnight, 5: GST NS1 pellet induksi overnight, 6: GST NS1 supernatan induksi overnight, 7: BL21 supernatan induksi 1 jam, 8: BL21 supernatan induksi 1 jam, 9: pGEX pellet induksi 1 jam, 10: pGEX supernatan induksi 1 jam, 11: GST NS1 pellet induksi 1 jam, 12: GST NS1 supernatan induksi 1 jam
masih lebih dominan yang tidak larut (GAMBAR3). Lisis E. coli rekombinan. Untuk memperoleh protein rekombinan, E. coli rekombinan harus terlebih dahulu guna memecah dinding sel E. coli. Lisis sel dapat dilakukan secara fisik, kimiawi maupun kombinasi. Metode lisis sel yang paling sering digunakan adalah dengan sonikasi yang menghasilkan protein yang larut (supernatan) namun metode ini masih belum optimal (GAMBAR5) dengan terlihatnya protein di pelet yang cukup signifikan.
Oleh sebab itu dilakukan optimasi metode lisis baik secara fisik dengan sonikasi, kimiawi dengan kit
B-GAMBAR 4: SDS-page pada induksi IPTG pada suhu 25◦C dan lisis E. coli dengan sonikasi. M: Marker Page ruler Prestained pro-tein ladder, 1: Pellet GST NS1(kultur 20 ml induksi overnight) sonikasi, 2: Supernatan GST NS1 (kultur 20 ml induksi overnight) sonikasi,3: Pellet GST NS1 (kultur 20 ml induksi overnight) B-PER, 4: Supernatan GST NS1 (kultur 20 ml induksi overnight) B-PER, 5: Pellet GST NS1 (kultur300 ml induksi overnight) sonikasi,6: Supernatan GST NS1 (kultur 300 ml induksi overnight) sonikasi, 7: Pellet GST NS1 (kultur 200 ml induksi overnight) sonikasi, 8: Supernatan GST NS1(kultur 200 ml induksi overnight) sonikasi,9: Pellet GST NS1 (kultur 100 ml induksi 1 jam) sonikasi, 10: Supernatan GST NS1 (kultur 100 ml induksi 1 jam) sonikasi, 11: Pellet GST NS1 (kultur 100 ml induksi 1 jam) BPER, 12: Su-pernatan GST NS1 (kultur 100 ml induksi 1 jam) BPER, 13: Pel-let GST NS1 (kultur 20 ml induksi overnight dilanjutkan inkubasi suhu 37◦C 1 jam) sonikasi, 14: Supernatan GST NS1(kultur 20 ml induksi overnight dilanjutkan inkubasi suhu 37◦C 1 jam) sonikasi, 15: Pellet BL21 sonikasi, 16: Supernatan BL21 sonikasi, 17: Pellet GST sonikasi, 18: Supernatan GST sonikasi
PER maupun kombinasi. Namun hasil ekstraksi de-ngan metode ini belum menunjukkan hasil yang sig-nifikan (GAMBAR6). Terlihat hasil yang menarik pada E. coli rekombinan yang dilisis dengan menggunakan B-PER menghasilkan pita tebal yang baru pada super-natan perlu dilakukan uji western blot untuk mende-teksi keberadaan protein rekombinan.
Metode lain untuk melisis sel yang juga sering digu-nakan adalah metode freeze thaw. Dalam metode ini perubahan suhu ekstrem dan cepat diharapkan mem-percepat proses lisis sel. Dengan metode freeze thaw
GAMBAR 5: SDS-page hasil lisis E. coli dengan sonikasi. 1: Marker page ruler unstained ladder, 2: BL21 pellet, 3: BL21 su-pernatan, 4: pGEX pellet, 5: pGEX susu-pernatan, 6: GST NS1 pellet, 7: GST NS1 supernatan, 8: BL21 supernatan, 9: pGEX supernatan, 10: GST NS1 supernatan
GAMBAR 6: SDS-page hasil lisis E. coli dengan metode fisik de-ngan sonikasi, kimiawi dede-ngan kit B-PER maupun kombinasi. 1: Marker page ruler unstained ladder, 2: Pellet GST NS1 Sonikasi, 3: Supernatan GST NS1 sonikasi, 4: Pellet GST NS1 sonikasi B-PER, 5: Supernatan GST NS1 B-B-PER, 6: Pellet GST NS1 B-B-PER, 7: Supernatan GST NS1 B-PER
ini terlihat bahwa protein yang larut sudah lebih dom-inan daripada yang tidak larut (GAMBAR7). Penggu-naan buffer lisis, juga dapat digunakan untuk melisis E. coli rekombinan. Dengan menggunakan buffer tersebut terlihat bahwa terdapat protein yang larut namun seba-gian besar masih tetap tidak larut pellet (GAMBAR8).
Namun semua data hasil ekstraksi belum mende-teksi keberadaan protein rekombinan NS1. Keberadaan protein rekombinan NS1 dideteksi menggunakan West-ern blot, dot blot maupun ELISA.
GAMBAR 7: SDS-page hasil lisis E. coli dengan metode freeze thaw dan pre-treatment pembekuan dalam nitrogen cair (frozen). 1: Marker Page ruler Unstained ladder, 2: Pelet GST NS1 freeze thaw (1 menit freeze 1 menit thaw), 3: Supernatan GST NS1 freeze thaw (1 menit freeze 1 menit thaw), 4: Supernatan GST NS1 freeze thaw (1 menit freeze 30 detik thaw), 5: Pelet GST NS1 freeze thaw (1 menit freeze 30 detik thaw), 6: Pellet GST NS1 froz B-PER, 7: Supernatan GST NS1 froz PER, 8: Pellet GST NS1 sonikasi B-PER, 9: Supernatan GST NS1 froz sonikasi, 10: Supernatan GST NS1 sonikasi B-PER
GAMBAR 8: SDS-page hasil lisis E. coli dengan metode sonikasi dalam lysis buffer. 1: Marker page ruler prestained protein ladder, 2: Pellet GST NS1 (a) sonikasi, 3: Supernatan GST NS1 (a) sonikasi; 4: Pellet GST NS1 (a) sonikasi lysis buffer I, 5: Supernatan GST NS1 (a) sonikasi lysis buffer I, 6: Pellet GST NS1 (a) sonikasi lysis buffer II, 7: Supernatan GST NS1 (a) sonikasi lysis buffer II, 8: Pellet GST NS1 (d) sonikasi, 9: Supernatan GST NS1 (d) sonikasi, 10: Pellet GST NS1 (d) sonikasi lysis buffer I, 11: Supernatan GST NS1 (d) sonikasi lysis buffer I, 12: Pellet GST NS1 (d) sonikasi lysis buffer II, 13: Supernatan GST NS1 (d) sonikasi lysis buffer II
Deteksi protein rekombinan NS1. Untuk mende-teksi keberadaan protein rekombinan NS1, tiga metode dikembangkan yakni Western blot, dot blot maupun ELISA. Protein rekombinan NS1 yang diproduksi meru-pakan protein NS1 yang difusi dengan GST, untuk keperluan deteksi antibodi anti-GST digunakan. Prin-sip deteksi protein rekombinan NS1-GST digambarkan padaGAMBAR9.
Protein rekombinan NS1 yang diekstraksi dengan melisis E. coli rekombinan secara fisik dengan sonikasi, kimiawi dengan kit B-PER maupun kombinasi
dide-GAMBAR9: Skema deteksi protein rekombinan NS1-GST
teksi dengan western blot (GAMBAR10). Hasil West-ern blot menunjukkan bahwa protein rekombinan NS1 masih belum terlarut (pellet).
GAMBAR10: Western blot hasil lisis E. coli dengan metode fisik dengan sonikasi, kimiawi dengan kit B-PER maupun kombinasi. M: marker, 1: Supernatan pGEX sonikasi, 2:Supernatan pGEX BPER, 3: Pelet NS1 non treatment, 4: Pelet NS1 sonikasi, 5: Supernatan NS1 sonikasi, 6: Pelet NS1 BPER, 7: Supernatan NS1 BP, 8: Su-pernatan NS1 sonikasi BPER, 9: SuSu-pernatan NS1 sonikasi BPER
Sedangkan deteksi protein rekombinan NS1 yang dihasilkan E. coli rekombinan dilisis menggunakan metode freeze thaw dideteksi dengan metode dot blot (GAMBAR11). Metode ini dikembangkan guna mende-teksi keberadaan protein rekombinan NS1 secara cepat.
Supernatan dari hasil lisis E. coli rekombinan dengan metode freeze thaw menunjukkan keberadaan protein rekombinan NS1 namun yang tidak larut masih tetap lebih banyak.
GAMBAR11:Dot blot hasil lisis E. coli dengan metode freeze thaw dan pre-treatment pembekuan dalam nitrogen cair (frozen). 1: Pellet GST-NS1freeze bPER, 2: Supenatan GST-NS1 freeze bPER, 3: Pel-let GST-NS1 freeze bPER sonikasi, 4: Supernatant GST-NS1 freeze sonikasi, 5: Supernatant GST-NS1 freeze bPER sonikasi, 6: Pel-let GST-NS1 freeze thaw sonikasi, 7: Supernatan GST-NS1 freeze thaw, 8: Supernatan NS1 freeze thaw sonikasi, 9: Pellet GST-NS1 freeze thaw, 10: Supernatan GST-GST-NS1 freeze thaw, C. Kontrol negative
Protein rekombinan NS1 yang dihasilkan E. coli rekombinan dilisis menggunakan metode sonikasi dalam lysis buffer dideteksi dengan western blot (GAM -BAR12). Protein rekombinan NS1 terlihat positif pada hasil Western blot sample supernatan GST NS1 (b).
GAMBAR 12: Western blot hasil lisis E. coli dengan metode sonikasi dalam lysis buffer. 1: Supernatan GST NS1 (a37), 2: Pellet GST NS1 (a37), 3: Pellet GST NS1 non treatment (+), 4: Super-natan GST NS1 (d), 5: Pellet GST NS1 (d), 6: SuperSuper-natan GST NS1 (c), 7: Pellet GST NS1 (c), 8: Supernatan GST NS1 (b), 9: Pellet GST NS1 (b), 10: Supernatan GST NS1 (a), 11: Pellet GST NS1 (a)
Dalam studi ini dikembangkan metode deteksi pro-tein rekombinan NS1 berbasis ELISA, keunggulan metode ini adalah dapat mendeteksi protein rekom-binan NS1 secara semi kuantitatif. Protein dalam E. coli rekombinan yang dilisis menggunakan metode sonikasi dalam lysis buffer dideteksi dengan ELISA (GAMBAR13). Hasil analisa ELISA menunjukkan
pro-tein rekombinan masih banyak terdapat dipelet (tidak larut), namun dengan perlakuan lysis buffer II meng-hasilkan protein soluble yang lebih tinggi.
GAMBAR 13: Analisis ELISA hasil lisis E. coli dengan metode sonikasi dalam lysis buffer. A1: Pellet GST NS1 sonikasi, A4: Pel-let GST NS1 sonikasi dengan lysis buffer I, A5: PelPel-let GST NS1 sonikasi dengan lysis buffer II, B2: Pellet GST NS1 sonikasi dengan lysis buffer I, C2: Pellet GST NS1 sonikasi, D3: Pellet GST NS1 sonikasi lysis buffer I, D1: Pellet GST NS1 sonikasi, D4: Pellet GST NS1 sonikasi dengan lysis buffer II, pGEX, B: kontrol negative
IV.
KESIMPULAN
Permasalahan yang sering manjadi kendala dalam memproduksi protein rekombinan dalam E. coli adalah terbentuknya inclusion body. Beberapa faktor yang dapat meningkatkan jumlah protein rekombinan yang larut dan mengurangi terbentuknya inclusion body adalah kondisi induksi dengan IPTG dan metode li-sis E. coli rekombinan. Dalam studi ini dapat disim-pulkan bahwa kondisi optimal produksi protein rekom-binan NS1 adalah dengan induksi IPTG pada suhu 25◦C overnight dan melisis sel dengan menggunakan
sonikasi dalam buffer lisis. Melihat potensi NS1 sebagai bahan dasar pengembangan kit diagnostika, studi ini mengembangkan metode deteksi protein rekombinan NS1 dengan pendekatan dot blot dan ELISA. Masing masing metode yang dikembangkan memilikikelebihan masing masing yakni metode dot blot dapat mendeteksi protein rekombinan NS1 dalam waktu cepat sedangkan metode ELISA bersifat semi kuantitatif.
DAFTAR PUSTAKA
[1] Setiati, TA., Wagenaar, JFP., de Kruif, MD., Mairuhu, ATA., van Gorp, ECM. dan Soemantri, A. (2006), Changing Epidemiology of Dengue Haem-morrhagic Fever in Indonesia, Dengue Bulletin, 30:1-14
[2] Rice CM, Lenches EM, Eddy SR, Shin SJ, Sheet RL, Strauss JH. 1985. Nucleotide sequence of yellow
fever virus: implication for flavivirus gene expres-sion and evolution. Science 229:726-733.
[3] Mackenzie, JM., Jones, MK. and Young PR. (1996), Immunolocalization of the Dengue Virus Non-structural Glycoprotein NS1 Suggest a Role in Viral RNA Replication, Virol. 220: 232-240
[4] Falconar AKI, Young PR. 1990. Immunoaffinity pu-rification of native dimer forms of the flavivirus nonstructural glycoprotein, NS1. J Virol Methods 30:323-332.
[5] Schlesiger JJ, Brandriss MW, Walsh EE. 1987. Pro-tection of mice against dengue 2 virus encephali-tis by immunization with the dengue 2 virus non-structural glycoprotein NS1. J Gen Virol 68:853-857. [6] Huang, JL., Huang, JH., Shyu, RH., Teng, CW., Lin, YL., Kuo, MD., Yao, CW. dan Shaio, MF. (2001), High-Level Expression of Recombinant Dengue Viral NS-1 Protein and Its Potential Use as a Di-agnostic Antigen, J Med Virol, 65:553-60
[7] Sodoyer, R. (2004), Expression Systems for the Production of Recombinant Pharmaceuticals, Bio-drugs, 18(1): 51-62
[8] Demain, AL. dan Vaishnav, P. (2009), Production of Recombinant Proteins by Microbes and Higher Organisms, Biotechnology Advances, 27: 297-306 [9] Amersham Biosciences, GST Gene Fusion System [10] Strandberg, L. dan Enfors, SO. (1991), Factors
In-fluencing Inclusion Body Formation in the Produc-tion of a Fused Protein in Escherichia coli, Appl. Environ. Microbiol., 57(6):1669-74
