UNIVERSITI PUTRA MALAYSIA
PEMBENTUKAN KAEDAH PENGESAN RACUN MAKHLUK PEROSAK
MENGGUNAKAN TEKNIK ELEKTROD ENZIM DAN ENZIM IMUNOASAI
FARIDAH BT. SALAM
PEMBENTUKAN KAEDAH PENGESAN RACUN MAKHLUK PEROSAK MENGGUNAKAN TEKNIK ELEKTROD ENZIM DAN ENZIM IMUNOASAI
OLEH
FARIDAH BT. SALAM
Tesis yang dikemukakan sebagai Memenuhi Keperluan untuk memperolehi Ijazah Master Sains di
Fakulti Sains dan Pengaj ian Alam Sekitar U niversiti Pertanian Malaysia
PENGHARGAAN
Alhamdullilah, bersyukur saya kehadrat Allah S.W.t. kerana dengan izinNya saya dapat menyempumakan projek penyelidikan dan penulisan tesis ini sehingga kepada noktahnya.
Setinggi-tinggi jutaan terima kasih saya ucapkan kepada pengerusi saya iaitu Prof. Dr. Abu Bakar Salleh yang telah memberi tunjukajar yang bermakna di peringkat akhir penyelidikan dan penulisan tesis. Prof. Dr. Kamaruzaman Ampon yang telah menyelia saya dengan penuh kesabaran sebelum beliau bertukar ke Universiti Sabah. Juga kepada Prof. Madya Dr. Che Nyonya Abd. Razak yang telah memberi semangat dan perangsang semasa memulakan penyelidikan.
Begitu juga dengan kakitangan makmal, kak Rohaida dan Yati yang telah banyak membantu dan bekeIjasama dalam mendapatkan bahan kimia dan penggunaan alatan makmal. Juga kepada Prof. Madya Dr. Noraini Samad yang telah membenarkan penggunaan alat pembaca ELISA Tidak ketinggalan juga kepada Shake, Zan, Maz, Su, Yam, Khanom dan Rena yang menghidupkan suasana riang di makmal penyelidikan.
Untuk keluarga tercinta, Jamil, Liana dan Fikri serta ibu dan ayah tersayang segala pengorbanan kalian tidak akan dilupakan.
KANDUNGAN
MUKASURAT
PENGHARGAAN... . .... . . .... . . .. . . .. . . I
SENARAI JADUAL.... ... .. . . .. . . VI SENARAI RAJAH ... . ... ... . ..
VII
NAMA SINGKATAN... IX ABSTRAK... XI ABSTRACT... ... . . . .. . . .. . . .. . . .. . . .. . . XIII BABI PENGENALAN ... . 1
II SOROTAN LITERA TUR Racun makhluk perosak. . . ... . . .. . . 4
Racun rumpai 2,4-D. . . .. . . 4
Paration. . . ... . . 5
Karbofuran. . . ... . . 7
Kesan racun makhluk perosak. . . . ... . . .... .... . . 7
Pemonitoran alam sekitar.. .. ... . ... . . . .. . . 8
Biosensor. . . 1 1 Bioreseptor. . . .. . . ... . . ... . . . ... . . 12
Enzim. ... . . . 12
Mikroorganisma. . . ... ... ... ... ... 13
Tisu dan organel. . . ... . . 13
Reseptor imunologi. . . ... . . .... . . ... . . . 1 4 "Transducertl. . . 1 4 Sekatgerak bioreseptor. . . 1 5 Pemerangkapan fizikal. . . ... . . 1 5 Tautsilang. . . .. . . .. . . .. .. . . .. . . . .. . . .. . . ... .. . . .... .. . . .. . . 1 5 Aruhan elektromagnet. . . ... ... . . . .. . . ... . . 16 Elektrod enzim. . . ... . . . 1 7 I I
Asetilkolin ... . Asetilkolinesterase ... . Kolin oksidase ... . Aplikasi elektrod enzim ... . Enzim imunoasai ... . Hapten ... . Perlekatan hapten-protein ... . P enClnan antIgen ... . .. . Penghasilan antibodi ... . Fonnat enzim imunoasai ... . E nztm Imunoasat ompetetI ... . . . . k 'f Kelebihan teknik enzim imunoasai ... . ill BAHAN DAN KAEDAH
17 18 19 19 20 20 21 22 22 23 24 27
Sumber bahan kimia... 29
Instrumentasi... 30
Kaedah elektrod enzim... 30
Alat pengesan makhluk perosak... 30
Kaedah penyediaan membran dialisis... 32
Cara menyekatgerakkan enzim ... 32
Kaedah asai aktiviti enzim AchE dan ChO bebas... 34
Kaedah asai aktiviti elektrod enzim... 35
Penentuan julat perencat bagi enzim bebas... 35
Penentuan julat perencat bagi elektrod enzim... ... 36
Penentuan kesan pengaktifan 2-PAM ke atas pengaktifan aktiviti enzim bebas yang didedahkan kepada Paration pada kepekatan
Iso...
36Penentuan kesan 2-P AM ke atas aktiviti elektrod enzim yang telah didedahkan kepada Paration pada kepekatan
Iso...
37Kesan perencat keatas aktiviti elektrod enzim... 37
Kaedah enzim immunoasai ... . Penyediaan konjugat 2,4-D - BSA. ... . Penyediaan konjugat 3-Hidroksikarbofuran tiroglobulin .. . Penyediaan konjugatParation terturun BSA. ... . Immunosasi dalam amab ... . Penyediaan konjugat IgG - Alkalin fosfatase ... . Penentuan kesan agen penghalang te�had..ap perlekatan yang tidak spesifik pada pennukaan pe
p
ejal0 0 ok 0
plnng ffil rotlter ... . Kaedah ELISA . .. . . . Penentuan titer IgG 2,4-D, Paration.dan Karbofuran menggunakan kaedah kompetetif
ELISA secara langsung ... . Penentuan graf piawai 2,4-D, Paration dan Karbofuran Menggunakan kaedah kompetetif
ELISA secara langsung ... . Penentuan kespesifikan antibodi 2,4-D
terhadap lain-lain terbitan 2,4-D ... . Penyediaan sampel tanah ... . Pengekstrakkan 2,4-D ... . Penyediaan sampel air ... . Penyediaan sampel sayur -sayuran dan buah-buahan ... .
IV KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN
Kaedah enzim elektrod ... . Aktiviti enzim bebas ... . Akt· IVltI enzlm se atgera ... . . 0 k k . Julat perencat bagi enzim bebas ... . Julat perencat bagi enzim sekatgerak ... .
IV 38 38 38 39 40 44 44 45 48 48 49 50 50 51 5 1 52 52 53 60 63
Pengaktifan AchE dengan 2-PAM... 67
Kaedah enzim imunoasai... 68
Titer antibodi... 71
Pengoptimuman kaedah ELISA... 77
Penganalisisan sampel air... 87
Penganalisisan 2,4-D dalam sampel tanah... 87
Penganalisisan sampel buah-buahan dan sayuran... 9 1 Perbandingan julat kepekatan racun makhluk perosak yang dapat dikesan menggunakan kaedah elektrod enzim dan enzim imunoasai... 95
V KESIMPULAN... 98
RUJUKAN.... ... ... ... 100
VITA... 108
PENERBITAN... 109
SENARAI JAD UAL
Jadual �ukasurat
1 Kesan barah oleh racun makhluk perosak terhadap haiwan percubaan
dan manusia (Fan, 1993)... 9 2
3
4
5
Iadual penyuntikan amab ... .
Senarai agen penghalang lain yang
pernah dilaporkan ... .
Perbandinganjulat kepekatan racun yang dapat
dikesan mengunakan kaedah ELISA. ... . Pengekstrakkan 2,4-D menggunakan 2 kaedah dan tiga jenis pelarut berbeza dan pengasaiannya menggunakan
kaedah ELISA secara langsung ... . 6 Kit ELISA komersial untuk
41
82
86
90
pengesanan racun makhluk perosak... 94 7 Perbandingan kepekatan racun makhluk perosak yang dapat
dikesan oleh kaedah elektrod enzim
dan enzim immunoasai... 96
Rajah 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 SENARAI RAJAH Mukasurat Struktur kimia 2,4-0 ... .
Struktur kimia Paration ... . Struktur kimia Karbofuan ... . P · . b' nnslp losensor ... . Kaedah penangkapan kompetetif. ... . Kaedah "Sandwich" asai ... . Carta kaedah elektrod enzim ... .
Graf penulenan IgG menggunakan turus
o EAE-selulosa ... . Carta alir kaedah kompetetif
ELISA secara langsung ... . Carta alir kaedah DAS-ELISA. ... . Carta alir kaedah Nitroselulosa-ELISA. ... . Penentuan kadar tindakbalas yang
dimangkinkan oleh AchE mengikut
peningkatan kepekatan substrat. ... . Penentuan kadar tindakbalas mengikut
peningkatan kepekatan AchE ... . Penentuan kadar tindakbalas mengikut
peningkatan kepekatan ChO ... . Penentuan amaun AchE untuk disekat
gerak pada membran elektrod (kepekatan
ChO adalah konstan, 7U/ml) ... . Penentuan aktiviti enzim sekatgerak
mengikut peningkatan kepekatan
substrat AcI. . . . VII 5 6 7 1 1 25 26 31 43 45 46 47 55 56 57 58 59
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
Julat kepekatan racun makhluk perosak yang dapat merencat aktiviti enzim AchE
bebas . . . . Penentuan kadar tindakbalas AchE pada
separuh perencatan maksimum
(Iso)
mengikutpeningkatan kepekatan substrat Ad ... .
Julat kepekatan perencat yang dapat
merencat aktiviti enzim AchE yang disekatgerak ... . Kesan 2-P AM ke atas aktiviti enzim
bebas yang telah didedahkan kepada
Paration
Iso ...
.Kesan 2-P AM ke atas aktiviti enzim sekatgerak yang telah didedahkan kepada Paration
Iso ...
. Titer IgG terhadap 2,4-D . . . ... . . .Titer IgG terhadap Paration ... .
Titer IgG terhadap Karbofuran ... .
Kespesifikan antibodi 2,4-D terhadap
lain-lain terbitan 2,4-D ... .
Kaedah DAS-ELISA. ... .
Strip NC-ELISA. ... . Kesan agen penghalang terhadap
perlekatan yang tidak spesifik
pada plat mikrotiter. ... .
Graf piawai 2,4-D ... .
Graf piawai Paration ... .
Graf piawai Karbofuran ... .
Penganalisaan 2,4-D dalam sampel
air dari sumber yang berbeza ... .
Kandungan residu Paration dan Karbofuran dalam sampel buah-buahan dan sayuran
dari ladang MARDI. ... .
VI I I 61 62 65 69 70 73 74 75 76 78 79 81 83 84 85 88 92
NAMA SINGKATAN
AchE Asetilkolinesterase
ChO Kolin Oksidase
AcI Asetilkolin Iodida
BSA Albumin Serum Lembu
ECA Albumin Telur Ayam
OA Ovalbumin
2,4-D 2,4-Dwiklorofenoksi asid asetik
IgG Immunoglobulin G
2-PAM Piridin-2-Aldoximide Metiodida Klorida NBS N-Hidroksisuksinimid
DCC N,N'-Dwisikloheksilkarbodiimid
NH2 Kumpulan amina
OR Kumpulan hidroksil
COOR Kumpulan karboksil
SH Kumpulan sulfilhidril
ELISA "Enzyme-linked Immunosorbent Assay" DAS-ELISA "Double Antibody Sandwich"-ELISA NC-ELISA Nitroselulosa-ELISA
ppm Bahagian per sejuta ppb Bahagian per bilion
Ach Asetilkolin
BuchE Butirilkolinesterase
MCPA CPA 2,4,5-T sm PBS-T PBS BOD FCA PIA DE-52 BaM
4-Kloro-2-metilfenoksi asid asetik (±)-2-(4-Klorofenoksi) asid propionik 2,4,5-Triklorofenoksi asid propionik sentimeter
Kepekatan perencat yang menyebabkan setengah perencatan maksimum Penimbal fosfat bergaram yang mengandungi 0.05% Tween-20
Penimbal fosfat bergaram "Biological Oxygen Demand" Adjuvan Freund's lengkap Adjuvan Freund's tak lengkap DwietiIaminoetiIselulosa
Alat Pemonitoran oksigen
Abstrak tesis yang dikernukakan kepada Senat Universiti Pertanian Malaysia sebagai rnernenuhi syarat untuk rnendapatkan Ijazah Master Sains
PEMB ENTUKAN KAED AH PENGESAN RACUN MAKHLUK PERO SAK MENGGUNAKAN TEKNIK ELEKTROD ENZ� D AN ENZ�
� MUNO ASAI Oleh
F ARIDAH B TE SALAM Mei, 1996
Pengerusi : Prof Abu Bakar Salleh, PhD Fakulti : Sains dan Pengajian Alarn Sekitar
Kaedah elektrod enzirn dan kaedah enzirn irnunoasai telah dibentuk untuk rnenganggarkan kepekatan racun rnakhluk perosak dalarn pernonitoran alarn sekitar. Enzirn Asetilkolinesterase (AchE) dan Kolin Oksidase (ChO) yang disekatgerak pada rnernbran elektrod oksigen secara fizikal, taut silang dan pernerangkapan gelatin telah digunakan sebagai elektrod enzirn. Sekatgerak enzirn secara taut silang didapati paling sensitif untuk penentuan racun rnakhluk perosak. Racun Paration, Karbofuran dan asid 2,4-Dwiklorofenoksi asetik (2,4-D) telah digunakan untuk rnenguji darjah kesensitifan elektrod enzirn. Elektrod enzirn dengan enzirn yang disekatgerak secara taut silang rnenunjukkan separuh perencatan rnaksirnurn (I50) bagi Paration ialah 0.00001 11g!L dan 0.000211g/L bagi Karbofuran. Tiada kesan perencatan bagi racun 2,4-D. Julat kepekatan racun yang boleh dikesan oleh elektrod enzirn adalah 0.00001-0.0001 11g!L bagi Paration dan 0.00001-0.00 111g/L bagi Karbofuran. 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol (2-PAM) pada kepekatan 1 x 10-3M didapati sesuai digunakan sebagai bahan pengaktif bagi
enzirn pada elektrod yang telah didedahkan kepada racun rnakhluk perosak.
Dalam kaedah enzim imunoasai, antibodi poliklonal terhadap racun Paration, Karbofuran dan 2,4-D disediakan dengan mengimunkan amab dengan imunogen yang terdiri daripada konjugat Paration terturun-serum albumin lembu ( BSA), 3- hidroksi Karbofuran-Tiroglobulin dan 2,4-D-BSA Titer imunoglobulin G (IgG) terhadap Paration adalah 1: 102400, 1: 51200 bagi Karbofuran dan 1: 512000 bagi 2, 4- D. Antibodi terhadap 2,4-D didapati boleh bertindaksilang dengan kesemua terbitan 2,4- D yang dikaji. Tiga kaedah asai imunojerapan berpaut enzim (ELISA) telah dibentuk iaitu kaedah " Double Antibody Sandwich-ELISA" (DAS- ELISA), Nitroselulosa- ELISA (NC-ELISA) dan kompetetif ELISA secara langsung. Kaedah kompetetif ELISA secara lang sung didapati berkesan untuk pengesanan ketiga-tiga jenis racun yang dikaji. Larutan 1 % susu tepung tanpa lemak merupakan agen penghalang terbaik untuk kaedah ini. Julat kepekatan racun yang boleh dikesan adalah 0.01 ng/ml hingga 500 ng/ml bagi Paration, 0.01 ng/ml hingga 100 ng/ml bagi Karbofuran dan 1 ng/ml hingga 1000 ng/mt bagi 2,4- D.
Kaedah elektrod enzim dan enzim imunoasai dapat mengesan racun makhluk perosak pada kepekatan yang rendah iaitu kurang daripada 1 Ilg/L (lppm). Kaedah elektrod enzim adalah sensitif terhadap racun kumpulan organofosfat (Paration) dan karbamat (Karbofuran) tetapi tidak sensitif terhadap racun daripada kumpulan lain (
2,4-D). Elektrod enzim merupakan kaedah yang cepat di mana ia dapat menentukan kehadiran racun makhluk perosak dalam masa kurang daripada lima minit manakala kaedah enzim imunoasai adalah kaedah yang sensitif untuk kesemua jenis racun makhluk perosak tetapi memerlukan masa asai yang lama.
Abstract of thesis submitted to the Senate ofUniversiti Pertanian Malaysia in fulfilment of the requirement for the degree of Master of Science
D EVELOP MENT O F AN ENZY ME ELECTROD E AND ENZY ME IM MUNO ASSAY TECHNIQ UES FO R P ESTICID ES D ETERMINATIO N
By
F ARID AH B T S ALAM May, 1 996
Chairman: Prof Abu Bakar Salleh, PhD. Faculty: Science and Environmental Study
An enzyme electrode and enzyme immunoassay techniques were developed to determine the concentration of pesticides in environmental monitorings. Acetycholinesterase (AchE) and Choline Oxidase (ChO) immobilized by physical, cross-linking and gelatin entrapment were used as enzyme electrode. Cross-linked enzyme was the most sensitive for pesticide detection. Parathion, Carbofuran and 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D) were used to test the sensitivity of the enzyme electrode. The electrode with cross-linking enzyme showed 50% inhibition by Parathion and Carbofuran at a concentration of 0.00001 �g/L and 0.0002 �g/L respectively. There was no inhibition for 2,4-D. The detection limit of the pesticide concentration for cross-linking enzyme was found between of 0.00001 �g/L and 0.0001 �g/L for Parathion and 0.00001 �glL to 0.001 �g/L for Carbofuran. 2-PAM (1 x 1 0-3 M) was found to be useful for reactivation of the enzyme electrode after it had been exposed to pesticides.
In an enzyme immunoassay method, polyclonal antibodies against Parathion, Carbofuran and 2,4-D were raised in rabbits by immunization with haptein reduced Parathion-BSA, 3 -hydroxy-Carbofuran-Thyroglobulin and 2, 4-D-BSA conjugate. The IgG titer against Parathion, Carbofuran and 2,4-D were found at 1: 102400, 1: 51200 and 1: 512000 respectively. The 2,4-D antibody showed the cross reactivity with alI 2,4-D derivatives which had been tested. Of the three ELISA methods used (Double antibody sandwich-ELISA, Nitrocellulose-ELISA and Direct competitive ELISA), direct competitive ELISA was found to be the most sensitive in the detection of the pesticides tested. One percent of non fat dry milk solution was found to be the best blocking agent in this ELISA method. The decetion limit of the pesticides concentration was at between 0.01 ng/ml to 500 ng/ml for Parathion, 0.01 ng/ml to 100 ng/ml for Carbofuran and 1 to 1000 ng/ml for 2, 4-D.
Both of the methods studied could determine low concentrations of the pesticides (less than 1 flg/L, 1 ppm). The enzyme electrode was sensitive to organophophorus and cabarmate pesticides but was not sensitive for the other pesticides. It was found that the electrode enzyme was the fastest method for detection of pesticides, while the enzyme immunoassay was more sensitive for all types of pesticides.
B AB I PENGENALAN
Penggunaan racun makhluk perosak semakin meningkat di negara ini kerana sebahagian besar daripada racun perosak tersebut digunakan dalam sektor pertanian untuk mengawal perosak-perosak tanaman. Kejayaan penggunaannya terbukti boleh meningkatkan pengeluaran hasil pertanian dan beIjaya membasmi serangga pembawa kuman penyakit. Tetapi, di samping kejayaan penggunaan racun perosak, tidak dapat dinafikan bahawa penggunaannya yang sangat tinggi juga boleh menimbulkan berbagai bagai kesan buruk ke atas persekitaran dan juga kepada manusia sendiri.
Pendedahan racun makhluk perosak di kalangan petani sering mengakibatkan gangguan kesihatan seperti gangguan fizikal dan mental. Selain itu, masalah aras sisa racun perosak yang tinggi dalam bahan makanan khususnya sayur-sayuran dan buah buahan yang dijual di negara ini juga boleh menyebabkan keracunan pada manusia dan ternakan. Penumpukan sisa racun yang kekal agak lama di dalam tanah juga boleh menyebabkan kerosakkan kepada tanaman. Di samping itu, ia juga boleh mengakibatkan pencemaran kepada sistem saliran di mana akan meninggalkan kesan buruk kepada organisma bukan sasaran seperti ikan dan hidupan-hidupan lain (Yunus dan Lim, 1980). Justru itu langkah pengawasan perlu di ambil terhadap masalah pencemaran racun makhluk perosak di negara ini.
2 Antara kaedah-kaedah pengesanan sisa racun makhluk perosak yang biasa digunakan adalah berdasarkan kepada kaedah-kaedah konvensional seperti kromatografi gas, kromatografi cecair berpotensi tinggi dan kromatografi lapisan nipis. Walaupun teknik-teknik ini sensitif, tetapi ia memerlukan penelitian dan kos yang mahal. Jadi kaedah yang mudah dikendali, kos yang rendah dan sensitif diperlukan untuk mengesan kehadiran racun makhluk perosak di persekitaran.
Pendekatan yang digunakan dalarn kajian ini ialah menggunakan kaedah biosensor terutarnanya kaedah elektrod enzim dan enzim imunoasai untuk mengesan sisa racun makhluk perosak yang berada di persekitaran. Kaedah ini didapati lebih cekap, sensitif, spesifik, mudah dikendalikan pada jumlah sarnpel yang banyak dan tidak memerlukan kos yang tinggi.
Dalarn kajian ini alat pengesan racun makhluk perosak dibentuk berdasarkan kepada daIjah perencatan racun terhadap aktiviti enzim Asetilkolinesterase (AchE) yang disekatgerak bersama enzim Kolin Oksidase (ChO) pada membran dialisis dan diikat pada mikro-elektrod oksigen. AchE menghidrolisiskan substrat Asetilkolin Iodida (AcI) kepada asetat, kolin dan ion iodida, kemudian ChO mengoksidakan kolin kepada betain dan hidrogen peroksida. Penggunaan oksigen untuk pengoksidaan kolin diukur menggunakan elektrod oksigen yang disambung kepada alat pemonitoran oksigen. Kepekatan racun makhluk perosak dalam sarnpel adalah berkadar songsang dengan amaun oksigen yang digunakan dalarn tindakbalas enzim ChO. Dalarn kajian ini model racun yang digunakan adalah Paration, Karbofuran dan 2,4-Dwiklorofenoksi asid asetik (2,4-D). Racun kumpulan organofosfat dan karbamat atau racun lain yang bersifat
3
neurotoksik sahaja yang boleh merencat aktiviti enzim AchE. Oleh yang demikian elektrod enzim hanya boleh mengesan kehadiran racun-racun daripada kumpulan ini sahaja dan kesensitifannya adalah bergantung kepada amaun enzim dan kaedah sekatgerak enzim pada membran elektrod. Jadi kaedah enzim imunoasai dibentuk untuk menentukan jenis racun yang berbeza dengan lebih spesifik. Kaedah ini adalah berdasarkan kepada perlekatan yang spesifik di antara racun dengan antibodi terhadap racun tersebut. Antibodi dilabel dengan enzim alkalin fosfatase dan penambahan substrat p-nitro-fenilfosfat akan menghasilkan produk berwarna yang dicerap menggunakan spektrofotometer. Keamatan warna yang terbentuk adalah berkadar songsang dengan kepekatan racun dalam sampel. Walaupun kaedah ini memerlukan penghasilan antibodi untuk setiap jenis racun yang digunakan tetapi ia mempunyai beberapa keistimewaan iaitu kespesifikan antibodi yang tinggi terhadap sesuatu jenis racun boleh digunakan untuk membezakan terbitan-terbitan suatu jenis racun yang berada dalam sesuatu sampel. Di samping itu darjah kesensitifannya adalah sangat tinggi di mana ia dapat menentukan amaun racun yang sangat rendah dalam sesuatu sampel.
Jadi objektif kajian ini adalah untuk membentuk satu kaedah yang cepat dan spesifik untuk mengesan racun makhluk perosak yang berada di persekitaran. Di antara parameter yang dikaji adalah:
(a) Pengoptimuman kaedah elektrod enzim (b) Pengoptimuman kaedah ELISA
(c) Aplikasi kedua-dua kaedah untuk sampel racun piawai dan sampel racun yang berada di persekitaran.
B AB II
SO RO TAN LITERATUR
Raeun ma khluk perosak
Racun makhIuk perosak merupakan bahan kimia yang digunakan untuk mengawal at au membunuh makhluk perosak seperti serangga, roden, nematod, kulat, herba, hamma, bakteria dan sebagainya. Selain itu, terdapat juga sebatian kimia yang tergolong dalam racun mahluk perosak seperti bahan pengontang, peluruh daun, pengatur tumbesaran, bahan pengusir, bahan pemandul, bahan penarik dan bahan penyahjangkitan. Kebanyakan racun makhluk perosak adalah toksik terhadap haiwan dan manusia (Fan, 1 993). Racun mahluk perosak yang digunakan dalam penyelidikan ini ialah racun rumpai iaitu asid 2,4-Dwiklorofenoksi asetik (2,4-D) dan racun serangga iaitu Paration dan Karbofuran.
Raeun rumpa i 2,4-D
Racun rumpai ini tergolong dalam kumpulan asid fenoksi berklorin. 2,4-D merupakan racun yang mula-mula diperkenalkan dalam tahun 1944. 2,4-D merupakan sebatian kimia yang bersifat hormon dan boleh didapati dalam bentuk garam atau ester. Ia bersifat sistemik dan digunakan dengan meluas untuk mengawal rumpai berdaun lebar
5
dalam tanaman bijirin. Kadar yang digunakan ialah 0.28 hingga 2.3 kilogram per hektar
(Thompson et ai., 1984)
Penumpukan racun berlaku di bahagian meristem pucuk dan akar (Thompson et ai., 1984). Racun ini menyebabkan pertumbuhan pokok yang tidak normal di samping mempengaruhi pernafasan, simpanan makanan dan pembahagian sel. Dalam tanah yang lembab dan panas racun ini kekal antara satu hingga empat minggu (Thompson et ai., 1984). 2,4-D bersifat neurotoksik pada manusia. Kesan teratogenik mungkin berlaku pada individu yang terdedah kepada semburan 2,4-D (Hoar et ai., 1986).
/CL
CL
---<IT>--
0 -CH 2 -caOHRajah 1 : Struktur kimia 2,4-D
Paration
Paration adalah racun serangga dari kumpulan organofosforus. Sebatian organofosforus merupakan sejenis ester daripada asid fosforus dan alkohol. Paration bertindak terhadap sistem saraf Cara tindakan adalah merencat fungsi enzim asetilkolinesterase di bahagian sinap. Corak tindakan racun ini telah dilaporkan oleh O'Brien (1971) dan Corbett (1974). Semasa utusan melewati bahagian sinap, sel-sel saraf
akan merembeskan asetilkolin. Bahan ini bertindak sebagai pembawa utusan kepada sel saraf yang berikutnya. Apabila tiada lagi maklumat, sejenis enzim iaitu asetilkolinesterase akan bertindak ke atas asetilkolin ini. Tindakbalas yang berlaku adalah seperti berikut:
EH + AcCH ---
,
---EH.ACCH ---r
--EAC ---·_EH + AcOHCh H20
6
Pada mulanya enzim (EH) bercantum dengan asetilkolin (AcCH) membentuk komplek yang boleh bertindakbalas secara suapbalik. Komplek ini akan membebaskan kolin (Ch). Jika air ditambah, komplek EAc akan membebaskan enzim bebas dan asid asetik (AcOH). Ikatan P=O pada racun Paration mempunyai tarikan yang kuat terhadap kumpulan OH pada enzim. Tindakan ini menyebabkan enzim tidak boleh bertindak dengan asetilkolin. Ini menyebabkan asetilkolin berkumpul di bahagian sinap. Apabila keadaan ini berlaku, corak biasa penghantaran maklumat akan terganggu. Bagi serangga keadaan demikian boleh menyebabkan serangga tersebut hiperaktif, mengeletar, lumpuh dan akan mati. Racun ini boleh menyebabkan kecacatan pada anak-anak ayam jika disuntik ke dalam kandul yolka (Kurh & Dorough, 1977).
Terdapat beberapa simptom keracunan pada mamalia seperti kekejangan otot, menggelepar dan pengecutan anak mata. Pekerja-pekerja yang sering terdedah kepada racun ini akan mengalami kekurangan tenaga, lesu dan insommia (Kuhr & Dorough,
1977)
S
II
(C2H50h-P-O
�
N02
7
Karbofuran
Karbofuran (2,3-dihidro-2,2-dimetil-7-benzofuranil N-metilkarbarnat) adalah racun serangga yang bersifat sistemik dari kumpulan karbarnat. Ia digunakan sebagai racun hamma dan nematod, mempunyai kelarutan yang sangat tinggi dalam air iaitu 700 mg per liter air pada suhu 25°C, ini memudahkan ia memasuki sistem tumbuhan.
Racun ini boleh digunakan pada daun dan pada tanah. Karbofuran kekal hanya beberapa minggu dalarn tanah. Sebatian racun dalarn tanah boleh diserap oleh akar dan akan mengawal perosak di bahagian daun. Masa separuh hayat dalarn tanah bergantung kepada jenis tanah iaitu 30 hari dalarn pasir dan mencapai 80 hari dalam tanah yang kaya dengan organik. Manakala dalarn tumbuhan, racun ini lebih bersifat persisten. Karbofuran bertindak pada sistem saraf Corak tindakan adalah sarna seperti Paration.
(
"o.co ·N H
0 CIi;,
lO
c�Rajah 3: Struktur kimia Karbofuran
Kesan racun makhluk perosak
Sisa racun berkumpul dalam badan haiwan dan manusia melalui sistem rantaian makanan. Kebanyakkan racun makhluk perosak berkumpul dalam tisu lemak haiwan dan
8
kekal agak lama. Banyak penyakit yang bersifat kronik senng dikaitkan dengan kewujudan sisa racun dalam tubuh (Ames, 1992). Jadual l menunjukkan racun makhluk perosak yang berpotensi menyebabkan barah berdasarkan kepada data eksperimen terhadap haiwan percubaan dan kes keracunan.
Pemonitora n ala m sekita r
Kualiti alam sekitar bergantung kepada pengawalan pencemaran yang berpunca daripada bahan buangan kilang perindustrian, sisa bahan pertanian dan kenderaan bermotor. Racun makhluk perosak merupakan sisa bahan pertanian yang menunjukkan kegigihan yang rendah dalam alam sekitar tetapi bersifat toksik akut yang tinggi dalam badan haiwan dan manusia (Moore & Moore, 1983).
Racun makhluk perosak biasanya dimonitor dengan menggunakan kaedah konvenslonal seperti kaedah kromatografi gas, kromatografi cecair berpotensi tinggi dan kromatografi lapisan nipis. Kaedah ini memerlukan masa analisa yang lama dan sampel perlu diekstrak dan dipekatkan terlebih dahulu untuk mendapatkan nilai kepekatan racun yang tepat. Kaedah pengesan BOD (Biological Oxygen Demand) digunakan juga dalam pengawalan alam sekitar. Kaedah ini didapati memerlukan masa pengeraman sampel selama 5 hari. Ekoran dari itu, kita memerlukan satu kaedah yang mampu mengesan dan menentukan kuantiti bahan racun makhluk perosak yang berada di persekitaran dengan cepat, mudah dan lebih spesifik. Biosensor menjadi fokus utama dalam kajian ini.
9
ladual 1 Kesan barah oleh racun makhluk perosak terhadap haiwan percubaan dan manusia (Fan, 1993)
Raeun Makhluk perosak Alaklor ASld arsemk Atrazm Benonul KalsJUrn arsemt Kaftafol Kaptan Kordlrnefon Klorobenzllat Klorotaloml Kuprum arsemt Klpennetrm Klromazm Dammozlde Dlalatte Dlklofop-mehl Etaflunn Etll oblde Lmdane Lmuron Mankozeb Maneb Metomil MetJrarn Metolaktor Onzahn Oxadlazon Parakuat Paratlon PCNB O-femlfenon Pronamld Tetraklovmfos TJOdlkab Terbutnn TJOfanate-metJI Toxapane Tnflunn Zmeb
A Karsmogen pada manUSla
Aplikasi pada tanama n hrnau
Jagong kapas tebu
peach, pome fruit Llffiau, padl Jambu batu kacang soya epal, almond kapas hrnau
buah, sayur, kekacang sayuran kapas ternakan epal kacang soya hmau, kapas epal,orkId avokado bawang, kentang buahan, blJlfln keclI kapas buahan, blJlfln keell buahan, blJlfln keeil Jagong, kacang soya kacang soya vmeyards padl
padl, kacang soya kapas, kekacang Ilffiau, orkld lettuce plr anggur kapas
kapas, kacang soya buahan,kacang sayuran
B 1 Karsmogen pada manusla tetapl kaJlan tJdak mendalarn
B2 Karsmogen pada halwan percubaan
C Kemungkman berslfat karsmogemk pada manUSla
Kesan bara h C A C C C C B2 B l C B2 Bl C BI BI C BI BI B2 B2/C C B2 B2 C B2 C C C C C B2 B2 C C C C C B2 C B2
