Metode Imunokimia untuk analisis senyawa aktif

Metode Imunokimia

untuk analisis senyawa aktif

Marlia Singgih Wibowo

School of Pharmacy Institut Teknologi Bandung

Analisis Imunokimia



Berdasarkan prinsip reaksi spesifik antara

Antigen-Antibodi



Penggunaan senyawa penanda (label) untuk

visualisasi reaksi

Prinsip Reaksi : meniru reaksi

imunologi dalam tubuh

Reaksi imunologi di dalam mamalia :

Ag Ab Reaksi primer Reaksi sekunder Reaksi tersier (degranulasi,opsonisasi) (Fiksasi komplemen, aglutinasi, presipitasi) memicu

Mengapa reaksi Antigen-Antibodi?

 Reaksi dan kekuatan

antibodi untuk “specific and reproducible protein binding”

 Prinsip reaksi :

Antigen-Antibody Interaction for

analysis

SUBSRATE PRODUCT (visualized) Complex Ag-Ab-Label

Metode analisis berbasis

imunokimia



Imunopresipitasi



Imunoaglutinasi



Imunokimia berlabel :

 EIA/ELISA (Enzyme ImmunoAssay)  RIA (Radio ImmunoAssay)

 IFA (ImmunoFluorescence Assay)  LIA (Luminescence Immuno Assay)  dll

Antigen

(antibody generator)

 Senyawa atau kompleks senyawa yang dapat menginduksi sistem imun mamalia

 Sifat : Imunogenik : induksi/stimulasi sistem imun mamalia

 Antigenik : bereaksi spesifik dengan antibodi

 Syarat antigen: High Molecular Weight (>5000), chemical structure → Complex

 Jika MW < 5000, supaya bersifat imunogenik dan antigenik dapat dikonjugasi dengan suatu protein untuk meningkatkan immunogenicity

Yang dapat menjadi antigen



Mikroba patogen dan atau toksin mikroba



Toksin tanaman, hewan



Protein spesifik atau senyawa lain yang

berstruktur spesifik



Senyawa obat (narkotik, psikotropik), tidak

imunogenik, tetapi dapat dikonjugasi dengan

suatu protein carrier (contoh : BSA)

Apakah Antibodi?



Antibodi adalah protein yang disekresi oleh

sel plasma limfosit B akibat stimulasi

molekul asing (antigen) pada reseptor

antigen limfosit B



Spesifik terhadap antigen yang memicunya



Antibodi adalah molekul-molekul

glikoprotein yang dikenal sebagai

SIFAT UMUM ANTIBODI

 Antibodi memiliki spesifisitas dan aktivitas biologi  Struktur Antibodi : Dua fragmen tempat

berikatannya antigen secara spesifik, disebut

sebagai fragmen Fab (fragment antigen binding) yang univalen, masing-masing memiliki satu situs pengikatan dan identik satu sama lain dalam segala hal

 Fragmen ketiga adalah Fc (Fragment crystallisable), fragmen yang dapat dikristalkan, tidak berikatan

dengan antigen, tetapi bertanggung jawab untuk fungsi biologik molekul antibodi setelah antigen berikatan dengan daerah Fab dari molekul utuh

Struktur Antibodi

 Terdiri dari dua rantai berat (heavy chain = H) dan dua

rantai ringan (light chain = L).

 Rantai H IgG () memiliki massa molekul sekitar 50 –

55 kDa, sementara rantai H IgM (μ) memiliki massa molekul sekitar 65 – 70 kDa.

 Rantai L (dengan massa molekul 20 – 25 kDa)

memiliki isotype kappa atau lambda dan ditemukan berikatan dengan seluruh kelas rantai H.

 Rantai peptida ini berikatan melalui ikatan non-kovalen

dan jembatan kovalen disulfida. Ikatan disulfida ini relatif terekspos dan oleh karena itu dapat mudah di reduksi atau oksidasi.



Domain konstan (Fc) IgG dan IgM dapat

berinteraksi dengan sel dan sistem efektor

dalam tubuh, dan domain variabel (Fab) nya

dapat berinteraksi dengan antigen.



Lokasi pada struktur antigen tempat berikatan

dengan antibodi disebut ‘epitope’ atau disebut

‘antigenic determinant’, sedangkan lokasi pada

struktur antibodi yang dapat berikatan dengan

antigen disebut ‘paratop’.

IgG and IgM

Specificity and Selectivity



Monoclonal Antibody



Polyclonal Antibody

KELEBIHAN ANTIBODI MONOKLONAL

DIBANDINGKAN POLIKLONAL

 Dapat menjamin keseragaman kandungan antibodi yang

dihasilkan karena berasal dari satu jenis klon saja yang diproduksi secara berulang dari suatu kumpulan sel hibrid yang telah

diseleksi sebelumnya.

 Mengurangi kemungkinan terjadinya reaksi silang atau reaksi

non-spesifik seperti yang dapat terjadi pada penggunaan antibodi poliklonal.

 Kekuatan atau afinitas kecepatan reaksi antigen-antibodi

monoklonal umumnya lebih kuat dibandingkan dengan ikatan antigen-antibodi poliklonal.

 Proses pemurnian lebih mudah karena relatif lebih sedikit jenis

kandungan antibodinya.

 Dapat digunakan untuk tujuan terapi yaitu antara lain untuk

perbaikan overdosis obat, mengurangi resiko transplantasi organ, deteksi tumor metastasis, dan sebagai obat target sitotoksik.

Teknik lain untuk produksi

antibodi monoklonal

 Teknologi Antibody Expression Libraries, yaitu konstruksi

cDNA dari mRNA yang diisolasi dari sel B manusia atau murine

 Gen IgG diamplifikasi dengan cara PCR, lalu rantai berat dan

ringan nya dikonstruksi dengan cara digesti dan insersi ke dalam bakteriofaga atau plasmid yang sesuai.

 Rekombinasi random terjadi , lalu diekspresi di dalam bakteri,

skrining dengan western blot

 Klon yang positif diisolasi dan diperbanyak untuk menghasilkan

antibodi Fab yang murni

 Mudah melakukan kimerisasi, perubahan afinitas,dan

Penggunaan Prinsip reaksi

Antigen-Antibodi di bidang

Farmasi



Clinical Diagnosis , misalnya Serodiagnosis

untuk Penyakit Infeksi



Drug Monitoring and Toxicology



Cancer Research

KINETIKA INTERAKSI

ANTIGEN-ANTIBODI

Prinsip ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay)

Antigen

Antibodi Kompleks Ag-Ab Konjugat enzim pada Ag-Ab Substrat Produk berwarna Reaksi enzimatik

Kinetika reaksi Antigen-Antibodi



Reaksi reversibel

Ag + Ab Ag-Ab

k1

k2

Laju pembentukan kompleks Ag-Ab :

d (Ag-Ab) dt

= k1(Ag) (Ab) – k2 (Ag-Ab)

k1/k2 = (AgAb)

(Ag) (Ab) = K (konstanta kesetimbangan)

Bila antibodi memiliki aviditas atau afinitas tinggi, maka K tinggi, demikian sebaliknya

B (terikat) B/F (rasio terikat dan bebas) 0 5.00 5.00

Bila F adalah antigen bebas, dan B adalah antigen yang terikat, Abx adalah konsentrasi awal Ab,maka pada kesetimbangan : K = k1/k2 = (Ag-Ab)/(Ag)(Ab) = B / F [(Abx)-B] Jadi B/F = K [(Abx)-B] Slope = -K, potongan dgn x adalah b, potongan dgn y adalah Kb

Reaksi pada permukaan bahan padat

dan cair



Kebanyakan metode imunokimia yang ada

dibuat dalam media/fase padat (solid phase)

untuk memudahkan proses pemisahan dalam

percobaan yang heterogen



Ketika antigen diimobilisasi pada fase padat,

ikatan antibodi tergantung pada laju difusi dan

ikatan pada konsentrasi diatas 1 pmol/cm2



Reaksi pada fase padat memiliki laju reaksi

intrinsik dan reaksi balik yang lebih kecil

dibandingkan reaksi di dalam larutan



Oleh karena itu reaksi Ag-Ab pada fase

padat-cair secara praktis merupakan reaksi

Parameter analisis



Sensitivitas



Spesifisitas



Selektivitas

Hal yang mempengaruhi parameter

:



Reaksi silang



Adanya senyawa yang mempengaruhi

Bagaimana menentukan jenis

analisis imunokimia berlabel?



Reaktan apa yang akan diberi label, antigen

(analit) atau antibodi?



Apakah antigen atau antibodi yang akan

ditentukan?



Apakah analisis kompetitif atau

non-kompetitif?



Apakah sistem analisis homogen atau

Pengelompokkan jenis analisis

imunokimia

1. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan

analit yang diberi label

2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan

antibodi yang diberi label

3. Analisis imunokimia yang tergantung pada deteksi

langsung kompleks imun

4. Analisis imunokimia dengan melibatkan label dan

reaksi khusus yang berlebih

5. Analisis imunokimia untuk mengukur antibodi

spesifik

6. Analisis imunokimia yang melibatkan pereaksi

berlabel dimana hasil reaksi Ag-Ab merupakan penguatan sinyal

1.

Analisis kompetitif untuk antigen/hapten

dengan analit yang diberi label

: Analisis ini

mirip dengan analisis radiokimia klasik, melibatkan penggunaan sejumlah terbatas antibodi. Analit dapat dilabel dengan senyawa radioaktif, fluoresensi,

luminesensi atau enzim.

2.

Analisis kompetitif untuk antigen/hapten

dengan antibodi yang diberi label

: analisis

ini berguna ketika antigen atau hapten yg dilabel

memiliki sifat yang kurang menguntungkan, misalnya kelarutan yang rendah dalam medium reaksi. Dalam reaksi digunakan analit imobilisasi dengan jumlah tetap dan terbatas. Sensitivitas reaksi tergantung pada afinitas antibodi berlabel

3.

Analisis imunokimia yang tergantung

pada deteksi langsung kompleks imun

:

analisis yang dilihat langsung yaitu presipitasi, turbidimetri, aglutinasi, perhitungan partikel

4.

Analisis imunokimia dengan melibatkan

label dan reaksi khusus yang berlebih

:

analisis sandwich seperti 2-site immunometric assay, dan ELISA. Analit diinkubasi dengan

antibodi berlabel dalam jumlah berlebih, antibodi yang tidak berikatan akan dibuang

1.

Analisis imunokimia untuk mengukur

antibodi spesifik

:

analisis ini melibatkan

antigen amobil berlebih pada fase padat untuk menangkap antibodi spesifik di dalam sampel.

2.

Analisis imunokimia yang melibatkan

pereaksi berlabel dimana hasil reaksi

Ag-Ab merupakan penguatan sinyal

:

analisis

ini termasuk imunokimia homogen untuk

memberikan efek 100% modulasi sinyal dari label yang digunakan

Reaksi Imunokimia dengan jumlah

antibodi berlebih (tipe I)

 Analit + antibodi → kompleks Ag-Ab → sisa antibodi  Sensitivitas maksimum dicapai pada jumlah antibodi

yang tidak terhingga

 Sensitivitas adalah 1 molekul analit (teoritis)

 Antigen yang dapat bereaksi silang berpotensi reaksi seimbang dengan sistem antibodi berlebih  Reaksi antigen-antibodi hanya sedikit dipengaruhi

oleh senyawa seperti garam atau urea

2-site immunometric sandwich assay

(non-kompetitif untuk Ag polivalen)

Ukur aktivitas labelnya

Ab1 Ag pencucian Ab2 berlabel ditambahkan berlebih inkubasi Pencucian dan inkubasi

 Analit + antibodi → kompleks Ag-Ab → sisa antigen  Sensitivitas maksimum dicapai ketika konsentrasi

antibodi mendekati 0

 Penjenuhan ini diatur oleh konstanta kesetimbangan  Sensitivitas tergantung pada konstanta afinitas

antibodi

 Sensitivitas maksimum 10-14 mol/liter (teoritis)  Antigen yang dapat bereaksi silang akan

menunjukkan kekuatan relatifnya tergantung pada laju konstanta kesetimbangan antara analit dan antigen cross-reactant tersebut

 Reaksi dalam percobaan lambat karena kesetimbangan harus tercapai

Reaksi Imunokimia dengan jumlah

antigen berlebih (tipe II)

Imunokimia kompetitif dengan

analit berlabel

+ + Ag Ag-berlabel Ab +

Analit berlabel berkompetisi dengan antigen tidak berlabel untuk berikatan dengan antibodi.Aktivitas spesifik dari fraksi analit berlabel yang terikat dgn antibodi berbanding terbalik dengan konsentrasi analit bebas

Sensitivitas metode



Kesalahan eksperimen paling besar kira-kira

17%



Konstanta kesetimbangan antibodi kira-kira

10

-11

_liter/mol



Sensitivitas tertinggi (limit deteksi) kira-kira

ANALISIS

IMUNOKIMIA

DENGAN LABEL

NON-RADIOAKTIF

Karakteristik suatu label untuk

analisis imunokimia



Memiliki aktivitas spesifik



Mudah dideteksi

Aktivitas spesifik label

berhubungan dengan :



Fraksi pada label yang akan digunakan untuk

deteksi



Derajat amplifikasi



Efisiensi deteksi

Syarat Enzim yang ideal

sebagai label

 Memiliki aktivitas tinggi pada konsentrasi (Km rendah)

 Stabil pada kondisi reaksi (biasanya pH netral)  Mudah dikonjugasi ke molekul lain untuk reaksi

lanjutan atau dalam penyimpanan

 Tersedia dalam keadaan murni (high purity)  Harga murah

 Mudah dideteksi dengan cara yang sederhana

 Tidak terdapat di dalam cairan sampel biologi yang akan diuji

Contoh enzim sebagai label

Enzim dan sumber pH optimum Aktiv.spes (U/mg, 37 C) BM Alkalinfosfatase (usus sapi) 8-10 1000 100.000 -galaktosidase (E.coli) 6-8 600 540.000 HRP (lobak) 5-7 4500 40.000

Enzim lain : amilase, katalase, urease, xantin-oksidase, heksokinase, adenosin deaminase, invertase, -laktamase, dll.

Enzim dan sumbernya

 B-galaktosidase  Peroksidase  Glukosa oksidase  A-amilase  G6PDH  MDH  Heksokinase  Propionil-CoA-karboksilase  Lisozim Escherichia coli Lobak Aspergillus sp. Bacillus subtilis Leoconostoc mesenteroides Lactobacillus arabinosus Saccharomyces sp. Saccharomyces sp. Egg-white

Senyawa berfluoresensi

sebagai label

 Pada saat molekul fluoresensi dieksitasi oleh sinar terpolarisasi, polarisasi sinar yang teremisi

tergantung pada rotasi acak yang terjadi selama proses eksitasi

 Semakin kecil molekul, makin cepat rotasi yg terjadi dan sinyal semakin kecil

 Pada IFA, senyawa fluoresensi sebagai label yang terkonjugasi dengan Ag atau Ab, akan tereksitasi, lalu setelah ikatan Ag-Ab, rotasi diperlambat, dan polarisasi meningkat

 Oleh karena itu, untuk label ukuran dan rotasi label bebas menjadi hal yang penting, karena akan

Syarat ideal Senyawa

Fluoresensi sebagai label



Memiliki intensitas fluoresensi yang tinggi

(absorptivitas molar tinggi)



Stoke shift > 50 nm untuk mengurangi

pengaruh “latar belakang” (background)

akibat scattering



Larut dalam air



Mudah dikonjugasi dengan molekul lain



Harga murah

Contoh label fluoresensi

Fluorofor Quantum yield Lifetime (ns) Emisi/eksita si (nm) Absorptivitas (liter/mol) Dansil klorida 0,3 14,0 480-520/340 3,4x10 3 Fluoresein isotiosianat 0,85 4,5 520/492 7x10 4 Rhodamin B isotiosianat 0,7 3,0 585/550 1,2x10 4



Senyawa kelat dari logam lantanida saat ini

banyak digunakan untuk label fluoresensi



Europium, terbium, samarium, memiliki emisi

fluoresensi yang panjang (mikrodetik sampai

milidetik)

Reaksi silang (cross-reaction)



Ketepatan suatu analisis tergantung pada

spesifisitas nya



Reaksi Antigen-Antibodi bersifat spesifik,

namun dapat pula terjadi reaksi silang, yaitu

reaksi dengan sebagian atau seluruh struktur

kimia dari analit lain



Reaksi silang dievaluasi dengan cara

membandingkan kemampuan masing-masing

analit terhadap ikatan dengan label

B (%) Cross-reactant Std x1 x2 100 50 Log konsentrasi

Perkembangan metode

Imunokimia

 Penggunaan sintetik peptida untuk epitop spesifik pada Ag virus

 Metode Scintillation Proximity : Radioimunokimia

menggunakan fluomicrosphere yang dilapisi dengan Ab atau reseptor. Fluomicrosphere ini akan

menghasilkan sinyal bila Ab atau molekul reseptor berikatan dengan ligand yang dilabel dengan

radioaktif (3_{H atau} 125_I)

 Metode Idiometrik (Idiometric assay) : non-kompetitif untuk pengukuran senyawa molekuler yang kecil

Metode Scintillation Proximity

FI A + L* FI A L*

sinar Radiasi

Suatu Ligand radioaktif berikatan dengan molekul akseptor (A) yang terikat pada molekul fluomikrosfer, yang setelah diradiasi akan memancarkan sinar

Metode Idiometrik

 Pada metode ini digunakan tambahan dua jenis

antibodi “anti-idiotipik” (anti-idiotypic antibody) selain antibodi utama

 Antibodi anti-idiotipik alfa dan beta

 Alfa akan mengenali epitop dalam daerah variabel Ab utama, dan tidak sensitif terhadap ada atau

tidaknya analit pada situs ikatannya

 Beta akan berkompetisi dengan analit pada bagian paratop (daerah ikatan Ag pada Ab)

 Biasanya digunakan untuk antigen kecil , misalnya estradiol

Ultrasensitive two-site enzyme

immunoassay



Untuk mengukur kadar antigen yang sangat

kecil :

 Chorionic gonadotropin dalam serum atau plasma (pada kasus tumor)

 Thyrotropin dalam serum darah

 Luteinizing hormon dalam serum darah anak-anak