Karya Akhir
Perbandingan Hasil Identifikasi Metode
Analytical Profile Index
(API) dan
Tes Kepekaan Antibiotika Konvensional dengan Metode
Technical
Dedicated Reasonable
(TDR)-300B
Oleh:
I Gde Eka Sugiartha,dr. NIM. 011218156301
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS 1 PATOLOGI KLINIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA -RSUD DR.SOETOMO
SURABAYA 2016
Karya Akhir
Perbandingan Hasil Identifikasi Metode
Analytical Profile Index
(API) dan
Tes Kepekaan Antibiotika Konvensional dengan Metode
Technical
Dedicated Reasonable
(TDR)-300B
Oleh:
I Gde Eka Sugiartha,dr. Pembimbing:
I GAA Putri Sri Rejeki,dr., SpPK(K) Dr. Puspa Wardhani,dr., SpPK Bambang Pujo Semedi,dr.,SpAn.KIC
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS 1 PATOLOGI KLINIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA -RSUD DR.SOETOMO
SURABAYA 2016
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkah dan rahmat-Nya sehingga karya akhir dengan judul “Perbandingan Hasil Identifikasi Metode Analytical Profile Index (API) dan Tes Kepekaan Antibiotika Konvensional dengan Metode Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B” ini dapat diselesaikan. Terima kasih yang tulus saya sampaikan kepada IGAA Putri Sri Rejeki, dr.,SpPK(K), Dr. Puspa Wardhani,dr.,SpPK, Bambang Pujo Semedi, dr.,SpAn.KIC, dan Dr.Hari Basuki NH,dr.,MKes selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan, dorongan, petunjuk, arahan dan evaluasi sehingga karya akhir ini dapat diselesaikan.
Ucapan terima kasih juga saya ucapkan kepada:
Yetti Hernaningsih,dr.,SpPK sebagai Kepala Departemen Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga – RSUD Dr.Soetomo, Surabaya Dr. Puspa Wardhani,dr.,SpPK selaku Kepala Pendidikan Studi Patologi Klinik
Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga – RSUD Dr.Soetomo, Surabaya Prof.Dr.Aryati,dr.,MS.,SpPK(K) atas bantuannya selaku penanggung jawab
Mikrobiologi di Laboratorium Granostik dan Parahita dan selama menjabat Kepala Departemen Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga – RSUD Dr.Soetomo, Surabaya
Dr,Sidarti Soehita SFHS,dr.,SpPK(K) atas bantuanya selama menjabat Kepala Pendidikan Studi Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga – RSUD Dr.Soetomo, Surabaya
Juli Soemarsono,dr.,SpPK (alm) selaku dosen wali mahasiswa
Prof. Dr. Prihatini, dr., M.S., Sp.PK(K), Fery H. Soedewo, dr., M.S., Sp.PK(K) dan Leonita Anniwati,dr.,SpPK(K) yang telah bersedia menjadi penguji dan memberikan masukan sejak pengajuan proposal hingga penelitian ini selesai Seluruh staf pengajar Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas
Airlangga – RSUD Dr.Soetomo, Surabaya
Verna,dr,SpPK, Mayfani,dr, Ni Luh,dr, Wulan,dr yang telah membantu penelitian ini
Isteri tercinta Ni Luh Deliyani,SKM.,MKes, anakku sayang Ayu Putu Githa Maheswari, Kadek Agus Surya Udiyana atas pengorbanannya
Kedua orang tua tercinta I Made Alit Antara, Ni Ketut Nariani atas pengorbanan yang tak akan terbalas
Kedua mertua I Wayan Bagia,SS, Ni Nengah Mariani,SPd.,MPd atas semua bantuannya
Seluruh karyawan dan PPDS Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga – RSUD Dr.Soetomo, Surabaya
Akhir kata saya minta maaf jika ada kesalahan dalam upaya menyelesaikan penelitian ini.
Surabaya, Maret 2016 I Gde Eka Sugiartha,dr
v
ABSTRAK
Perbandingan Hasil Identifikasi Metode Analytical Profile Index (API) dan Tes Kepekaan Antibiotika Konvensional dengan Metode Technical
Dedicated Reasonable (TDR)-300B
IG Eka Sugiartha , IGAA Putri Sri Rejeki, Puspa Wardhani, Bambang Pujo Semedi
Pendahuluan. Angka kematian infeksi aliran darah cukup tinggi, berkisar 20 - 50%. Patogen penyebab dapat dibuktikan dengan pemeriksaan kultur darah yang dilanjutkan dengan tes kepekaan antibiotika. Metode pemeriksaan dapat dilakukan secara konvensional atau automatis baik semiautomatis ataupun automatis penuh. Metode konvensional relatif tidak memerlukan investasi biaya yang besar dibandingkan metode automatisasi.
Metode. Penelitian ini merupakan analisis observasional dengan rancangan cross sectional. Metode identifikasi konvensional memakai metode API dan tes kepekaan antibiotika konvensional menggunakan metode difusi cakram antibiotika Kirby Bauer. Kedua metode ini dibandingkan dengan metode semiautomatis TDR-300B. Metode automatis penuh VITEK 2 digunakan sebagai metode rujukan untuk menilai performa metode konvensional dan semiautomatis.
Hasil. Bakteri penyebab infeksi aliran darah didominasi Gram negatif kebanyakan Eschericia coli dan Klebsiella pneumonia. Akurasi metode identifikasi API terhadap VITEK 2 sebesar 87,87%, akurasi identifikasi metode TDR-300B terhadap metode VITEK 2 adalah 90,9%. Hasil akurasi tes kepekaan antibiotika metode konvensional difusi cakram antibiotika Kirby Bauer terhadap metode VITEK 2 adalah 84,64%. Akurasi tes kepekaan antibiotika metode TDR-300B terhadap metode VITEK 2 sebesar 82,5%. Akurasi metode API terhadap metode TDR-300B sebesar 84,84%.Akurasi tes kepekaan antibiotika metode konvensional terhadap metode TDR-300B sebesar 78,21%.
Pembahasan. Hasil metode identifikasi dan tes kepekaan antibiotika konvensional tidak berbeda bermakna secara statistik dengan metode semiautomatis TDR-300B. Metode identifikasi dan tes kepekaan antibiotika konvensional masih dapat dipercaya terutama untuk daerah dengan keterbatasan finansial atau pemeriksaan masih sedikit.
Kata kunci: Perbandingan, metode konvensional, API, difusi, TDR-300B
vi
ABSTRACT
Comparison of Analytical Profile Index (API) Identification Method Results and Conventional Antimicrobial Susceptibility Test with Technical
Dedicated Reasonable (TDR)-300B Method
IG Eka Sugiartha, IGAA Putri Sri Rejeki, Puspa Wardhani, Bambang Pujo Semedi
Background. The bloodstream infection death rate is quite high, ranging from 20% to 50%. Causable pathogens could be demonstrated by blood cultures followed by antimicrobial susceptibility tests. The test could be performed in a conventional, semiautomatic or fully automatic method. The conventional method does not require large investment costs compared to automatic methods.
Method. This was an observational cross sectional design study. Conventional identification method used API and conventional antimicrobial susceptibility tests used disc diffusion method of Kirby Bauer. Both of the methods were compared to semiautomatic TDR-300B method. A fully automatic VITEK 2 method was used as the reference method for assessing the performance of conventional and semiautomatic methods.
Results. Bacteria that cause bloodstream infections were mostly dominated by Gram-negative Escherichia coli and Klebsiella pneumonia. The accuracy of API identification method to the VITEK 2 was 87.87%, accuracy of TDR-300B identification method to VITEK 2 method was 90.9%. The accuracy results of conventional Kirby Bauer disc diffusion antimicrobial susceptibility tests method compared to VITEK 2 method was 84.64%. Accuracy of TDR-300B antimicrobial susceptibility tests method to VITEK 2 was 82.5%. The accuracy of API identification method to TDR-300B was 84.84%.The accuracy of conventional antimicrobial susceptibility test method to TDR-300B was 78.21%.
Conclusion. The results of conventional identification and antimicrobial sensitivity tests were not statistically significant different with semiautomatic TDR-300B method. Conventional identification and antimicrobial susceptibility test methods could be trusted, especially for financial limited region or small number of examination.
Key words: Comparison, conventional, API, disc diffusion, TDR-300B
vii
RINGKASAN
Perbandingan Hasil Identifikasi Metode Analytical Profile Index (API) dan Tes Kepekaan Antibiotika Konvensional dengan Metode Technical
Dedicated Reasonable (TDR)-300B
IG Eka Sugiartha, IGAA Putri Sri Rejeki, Puspa Wardhani, Bambang Pujo Semedi Infeksi aliran darah mempunyai angka kematian yang cukup tinggi yang berkisar 20 - 50%. Infeksi ini dibuktikan dengan pemeriksaan kultur untuk menentukan mikroorganisme penyebab infeksi yang dilanjutkan dengan pemeriksaan kepekaan terhadap antibiotika. Metode pemeriksaan identifikasi dan kepekaan secara fenotipe lebih banyak dilakukan dibandingkan secara genotipe. Metode fenotipe ini dapat dilakukan secara konvensional atau automatisasi. Automatisasi dibedakan menjadi automatis penuh dan semiautomatis. Metode konvensional tentu akan lebih murah dibandingkan yang automatis, sedangkan metode semiautomatis relatif lebih murah dibandingkan metode automatis penuh. Penelitian ini mencoba membandingkan metode konvensional dengan metode semiautomatis yang relatif lebih murah dengan menggunakan metode automatis penuh sebagai metode rujukan. Metode konvensional dikerjakan melalui tes identifikasi Analytical Profile Index (API) dan tes kepekaan antibiotika difusi cakram antibiotika Kirby Bauer. Metode semiautomatis menggunakan metode Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B sedangkan yang automatis penuh memakai metode VITEK 2. Penelitian ini merupakan penelitian observasional dengan rancangan cross sectional yang menggunakan 33 sampel isolat bakteri dari penderita infeksi aliran darah. Sampel darah diambil dari berbagai ruangan di RSUD Dr.Soetomo Surabaya.
Akurasi metode identifikasi API terhadap metode VITEK 2 sebesar 87,87%, akurasi identifikasi metode TDR-300B terhadap metode VITEK 2 adalah 90,9%. Akurasi metode API terhadap metode TDR-300B sebesar 84,84%. Hasil akurasi tes kepekaan antibiotika metode konvensional difusi cakram antibiotika Kirby Bauer terhadap metode VITEK 2 adalah 84,64%. Akurasi tes kepekaan antibiotika metode TDR-300B terhadap metode VITEK 2 sebesar 82,5%. Akurasi tes kepekaan antibiotika metode konvensional terhadap metode TDR-300B sebesar 78,21%.
Perbandingan akurasi hasil identifikasi antara metode konvensional API dengan metode semiatomatis TDR-300B tidak berbeda secara statistik. Perbandingan akurasi tes kepekaan antibiotika metode konvensional difusi cakram antibiotika Kirby Bauer terhadap metode semiautomatis TDR-300B juga tidak berbeda secara statistik. Kemungkinan sumber kesalahan identifikasi disebabkan kesalahan pengamatan perubahan warna substrat pada metode API dan adanya polimikroba. Kemungkinan kesalahan tes kepekaan antibiotika diantaranya kesalahan membuat kekeruhan suspensi kuman pada metode konvensional, kesalahan pemipetan pada kedua metode, dan adanya polimikroba. Metode konvensional ternyata masih baik bila dibandingkan dengan metode semiautomatis tetapi metode konvensional sangat membutuhkan tenaga yang terlatih.
viii
SUMMARY
Comparison of Analytical Profile Index (API) Identification Method Results and Conventional Antimicrobial Susceptibility Test with Technical
Dedicated Reasonable (TDR)-300B Method
IG Eka Sugiartha, IGAA Putri Sri Rejeki, Puspa Wardhani, Bambang Pujo Semedi The mortality rate of bloodstream infection is high in the range 20% to 50%. The infection is proven by culture examination to determine the microorganisms causing the infection. It is followed by antimicrobial susceptibility test. Phenotype method of identification and antimicrobial susceptibility test are more common than genotype method. The method can be done conventionally or automatically. Automatic method can be done by fully automatic and semiautomatic. The conventional method is cheaper than the automatic, while the semiautomatic method is relatively cheaper than fully automatic method.
The study tried to compare the conventional method to semiautomatic method that was relatively inexpensive by using a full automatic method as a reference. The conventional method was done by Analytical Profile Index (API) identification tests and conventional antimicrobial susceptibility test used Kirby Bauer disc diffusion method. Semiautomatic method used Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B method while full automatic used VITEK 2. This study was an observational cross sectional design study, using 33 samples of bacterial isolates from bloodstream infection patients. Blood was taken from various wards in Dr.Soetomo Surabaya Hospital.
Accuracy of API identification method compare to VITEK 2 was 87.87%, the accuracy of TDR-300B identification method was 90.9%. The accuracy of API method to TDR-300B was 84.84%. The accuracy results of conventional Kirby Bauer disc diffusion antimicrobial susceptibility test to VITEK 2 was 84.64%. Accuracy of TDR-300B antimicrobial susceptibility test method to VITEK 2 was 82.5%. Accuracy of conventional antimicrobial susceptibility test method to TDR-300B method was 78.21%.
Comparison of identification accuracy results between the API conventional methods to TDR-300B semiautomatic methods were not statistically different. Comparison of antimicrobial susceptibility test accuracy result between conventional Kirby Bauer disc diffusion method to TDR-300B semiautomatic method was also not statistically different. Possible causes of error in API method were observation misidentification of substrate colour and the presence of polymicrobial. Sources of antimicrobial susceptibility test possible errors were mistakes in making suspension turbidity in conventional method, pipetting errors in both methods, and the presence of polymicrobial. The conventional method was still reliable compared to semiautomatic methods but urgently need skilled personnel.
ix
Bab 2. Tinjauan Pustaka………..7
2.1 Identifikasi Bakteri Dengan Metode API………..7
2.1.1 API Staph………...9
2.1.2 API Strep………..13
2.1.3 API 20E………20
2.1.4 API 20NE……….27
2.2 Tes Kepekaan Antibiotika Metode Konvensional………..29
2.3 Metode TDR-300B……….39
2.3.1 Identifikasi bakteri metode TDR-300B………42
2.3.2 Tes kepekaan antibiotika metode TDR-300B………..44
2.4 Metode VITEK 2………50
2.4.1 Identifikasi bakteri metode VITEK 2………...53
2.4.2 Tes kepekaan antibiotika metode VITEK 2……….57
Bab 3. Kerangka Konseptual Dan Hipotesis Penelitian………..60
3.1 Kerangka Konseptual………..60
3.2 Penjelasan Kerangka Konseptual………61
3.3 Hipotesis Penelitian………66
Bab 4. Metode Penelitian………67
4.1 Desain Penelitian………67
4.2 Populasi Dan Sampel………..67
4.3 Tempat Penelitian ………. ………68
4.4 Variabel Penelitian Dan Definisi Operasional ………....68
4.5 Alat Dan Bahan Penelitian………..69
4.6 Cara Kerja………...69
4.6.1 Identifikasi metode API………...69
4.6.2 Tes kepekaan antibiotika konvensional………75
4.6.3 Metode TDR-300B………..76
4.6.4 Metode VITEK 2……….77
4.7 Alur Penelitian………78
4.8 Analisis Statistik……….78
x
Bab 5. Hasil Penelitian
5.1 Hasil Penjaminan Mutu Penelitian………81
5.1.1 Hasil penjaminan mutu alat dan bahan……….81
5.1.2 Hasil penjaminan mutu melalui tes sterilitas……….83
5.1.3 Hasil penjaminan mutu melalui tes performa………83
5.2 Perbandingan Hasil Identifikasi………83
5.3 Perbandingan Hasil Tes Kepekaan Antibiotika………88
Bab 6. Pembahasan……….94
6.1 Perbandingan Hasil Identifikasi Bakteri………...95
6.2 Perbandingan Hasil Tes Kepekaan Antibiotika………...101
Bab 7. Simpulan dan Saran………..106
Daftar Pustaka……….108
Lampiran……… 112
xi
DAFTAR TABEL
2.1 Jenis pemeriksaan metode API………...8
2.2 Tes biokimia API Staph………15
2.3 Tes biokimia API Strep……….18
2.4 Tes biokimia API 20E………...21
2.5 Tes biokimia API 20NE………28
2.6 Tes biokimia TDR Staph 64………..44
2.7 Tes biokimia TDR STR 64………45
2.8 Tes biokimia TDR ONE 64………..46
2.9 Tes biokimia TDR NF 64……….47
2.10 Tes kepekaan antibiotika pada TDR Staph 64………..48
2.11 Tes kepekaan antibiotika pada TDR STR 64………49
2.12 Tes kepekaan antibiotika pada TDR NF 64………..49
2.13 Tes kepekaan antibiotika pada TDR ONE 64………50
2.14 Tes biokimia pada kartu GP VITEK 2………..55
2.15 Tes biokimia pada kartu GN VITEK 2……….56
4.1 Definisi operasional penelitian……….70
4.2 Alat dan bahan penelitian………..72
5.1 Penjaminan mutu alat dan bahan………...82
5.2 Perbandingan identifikasi metode API,TDR terhadap VITEK……….86
5.3 Perbandingan identifikasi API terhadap TDR………...87
5.4 Uji statistik kesesuaian hasil identifikasi………..87
5.5 Jenis antibiotika yang digunakan dan dianalisis………89
5.6 Perbandingan TKA konvensional,TDR terhadap VITEK……….91
5.7 Kesesuaian TKA konvensional terhadap VITEK……….92
5.8 Tipe kesalahan TKA konvensional dan TDR………93
5.9 Uji statistik kesesuaian TKA……….93
6.1 Perbedaan warna yang sulit diamati pada API………..97
xii
DAFTAR GAMBAR
2.1 Contoh strip plastic API..………..9
2.2 Cara membuka Ampule API medium . ……….10
2.3 Nampan, tutup nampan, penulisan identitas dan strip API………11
2.4 Tube, cupule dan posisi PSIpette………...11
2.5 Prosedur pemeriksaan API Staph………..14
2.6 Hasil tes kimia positif dan negatif API Staph………16
2.7 Contoh lembar hasil API Staph……….16
2.8 Prosedur pemeriksaan API 20E………24
2.9 Rujukan nilai positif dan negatif API 20E………25
2.10 Contoh lembar hasil 20E………...26
2.11 Hubungan zona inhibisi dengan MIC………30
2.12 Pengambilan isolat bakteri dari kultur………..32
2.13 Pembuatan suspensi bakteri………..32
2.14 Membandingkan suspensi bakteri dengan standar Mc Farland………33
2.15 Memasukkan suspensi bakteri ke media agar Mueller Hinton……….33
2.16 Streaking suspensi bakteri dengan swab………...34
2.17 Pemasangan cakram antibiotika di media agar Mueller Hinton………34
2.18 Pengukuran zona inhibisi dengan penggaris……….35
2.19 Pengukuran zona inhibisi dengan caliper………..…...35
2.20 Pengukuran zona inhibisi dengan template………...36
2.21 Contoh hasil quality control pada tes kepekaan antibiotika………..39
2.22 TDR X060 Automated Blood Culture System……….40
2.23 TDR Z 200 Microtube Turbidimetre………40
2.24 Kartu reagen TDR……….41
2.25 TDR J 100 Automated Dosing System………..41
2.26 TDR 300B Microorganism Analysis System………...42
2.27 Pemilihan panel identifikasi TDR……….43
2.28 Konsentrasi antibiotika pada tes kepekaan antibiotika dengan TDR…………48
2.29 VITEK 2 Analyzer………51
2.30 Contoh kartu GN VITEK 2………...51
2.31 Alur pemilihan kartu VITEK 2……….53
3.1 Kerangka konseptual………60
4.1 Alur kerja pemeriksaan TDR………...74
4.2 Alur penelitian………..79
5.1 Grafik persentase pertumbuhan bakteri………84
5.2 Grafik persentase bakteri berdasarkan Gram………84
5.3 Grafik persentase bakteri penyebab………..85
6.1 Lokasi udara pada pemipetan TDR………...98
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Informasi untuk disetujui subjek penelitian………112
Lampiran 2. Persetujuan menjadi subjek penelitian………115
Lampiran 3. Kelaikan etik………...116
Lampiran 4. Lembaran pengumpulan data penderita infeksi aliran darah…………..117
Lampiran 5. Pengumpulan data ………..118
Lampiran 6. Penjaminan mutu dengan tes performa………...120
Lampiran 7. Hasil tes identifikasi bakteri………129
Lampiran 8. Hasil tes kepekaan antibiotika………130
Lampiran 9. Analisis statistik………..135
xiv
DAFTAR SINGKATAN
API = Analytical Profile Index
AST = Antimicrobial Susceptibility Test ATCC = American Type Culture Collection
CLSI = Clinical and Laboratory Standards Institute DIC = Disseminated Intravascular Coagulation HPLC = High Performance Liquid Chromatography I = Intermediate
MIC = Minimal Inhibitory Concentration PCR = Polymerase Chain Reaction R = Resistant
S = Susceptible
TDR = Technical Dedicated Reasonable TKA = Tes Kepekaan Antibiotika
VP = Voges Proskauer
WHO = World Health Organization
1
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Darah normal bersifat steril dan adanya bakteri dalam darah dikenal sebagai bakteremia yang biasanya bersifat patologis. Masuknya bakteri ke aliran darah dapat berakibat serius termasuk renjatan, kegagalan organ, Disseminated Intravascular Coagulation (DIC), dan kematian. Data World Health Organization (WHO) menyatakan kematian mencapai 85% pada kasus infeksi di seluruh dunia pada tahun 2001 (WHO, 2001). Penyakit infeksi dinyatakan menjadi penyebab kematian sekitar dua juta orang di India setiap tahun (Duggal, 2012). Angka kematian pada infeksi aliran darah berkisar antara 20 – 50% (Forbes, 2007). Infeksi aliran darah di sebelas rumah sakit di Jakarta sekitar 26,4% (Kemenkes,2011). Kultur darah dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri atau mikroorganisme lain dalam darah yang dilanjutkan dengan tes kepekaan antibiotika sehingga dapat ditentukan antibiotika yang lebih tepat (Vanndepitte,2003).
2 menjadi semiautomatis seperti pada metode Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B dan metode automatis penuh seperti pada VITEK 2 (Biomerieux,2010; O’Hara,2005; Forbes,2007; Mindray,2013).
Metode identifikasi dan tes kepekaan antibiotika konvensional tidak memerlukan peralatan analisis yang harganya mencapai milyaran rupiah sehingga lebih memungkinkan dilakukan di daerah dengan sumber keuangan terbatas atau jumlah pemeriksaan yang masih sedikit. Metode ini mungkin memerlukan sumber daya manusia terlatih yang lebih banyak untuk pembuatan media, tetapi dapat dikurangi dengan menggunakan media konvensional komersial yang sudah jadi seperti API. Metode API dari Biomerieux merupakan salah satu metode konvensional komersial yang sudah luas dipakai dan sudah dipakai sejak lama yaitu dari tahun 1971. Metode API hanya terbatas untuk pemeriksaan identifikasi melalui 20 tes biokimia, sehingga untuk tes kepekaan antibiotika dilanjutkan dengan metode lain (Biomerieux,2010; O’Hara,2005). Akurasi metode konvensional API terhadap kuman kontrol, bervariasi dari berbagai studi sekitar 77% - 94,6% (Robinson,1995).
3 300B masih belum banyak. Metode automatis penuh seperti VITEK dari Biomerieux merupakan metode dengan prinsip kolorimetri untuk pemeriksaan identifikasi melalui tes biokimia dan tes kepekaan antibiotika yang sudah dipakai lebih lama dari TDR-300B. Akurasi VITEK terhadap kuman kontrol lebih baik, berkisar 97,8% (O’Hara,2005) sampai 98,02% (Duggal,2012). Sumber daya manusia terlatih yang dibutuhkan lebih sedikit, jumlah pemeriksaan yang dapat dilakukan juga akan lebih banyak, sayangnya metode ini relatif mahal apalagi untuk daerah dengan keterbatasan sumber daya (Biomerieux,2010; Mindray,2013).
4 media konvensional yang komersial seperti API. (Card,2013; O’Hara,2005; Pulidot,2013).
Perbandingan metode konvensional (API dan tes kepekaan antibiotika konvensional) dengan metode semiautomatis (TDR-300B) dan automatis (VITEK 2) bertujuan untuk mengetahui performa metode konvensional. Perbandingan ini diharapkan dapat memberi masukan jika mengunakan metode konvensional pada kondisi keterbatasan keuangan atau memulai pemeriksaan dengan jumlah pemeriksaan yang masih sedikit. Perbandingan kedua metode ini belum pernah diteliti sebelumnya. Metode automatis VITEK 2 yang memiliki akurasi lebih baik (berkisar 97,8% sampai 98,02%) dipakai sebagai metode rujukan untuk melihat performa metode konvensional dan semiautomatis pada penelitian ini (Duggal,2012; O’Hara,2005).
1.2 Rumusan Masalah
1) Bagaimana perbandingan akurasi identifikasi metode konvensional Analytical Profile Index (API) dengan metode semiautomatis Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B dalam mengidentifikasi bakteri dari isolat bakteri kultur darah dengan menggunakan VITEK 2 sebagai metode rujukan?
2) Bagaimana perbandingan akurasi tes kepekaan antibiotika konvensional metode difusi cakram antibiotika Kirby Bauer dengan metode semiautomatis Technical Dedicated Reasonable (TDR)-300B dalam menilai resistensi bakteri dari isolat bakteri kultur darah dengan menggunakan VITEK 2 sebagai metode rujukan?
5
1.3 Tujuan Penelitian
1.3.1 Tujuan Umum
1) Membandingkan akurasi metode konvensional Analytical Profile Index (API) dengan metode semiautomatis TDR-300B dalam mengidentifikasi isolat bakteri kultur darah dengan menggunakan VITEK 2 sebagai metode rujukan.
2) Membandingkan akurasi tes kepekaan antibiotika konvensional difusi cakram antibiotika Kirby Bauer dengan metode semiautomatis TDR-300B dalam menilai resistensi bakteri dari isolat bakteri kultur darah dengan menggunakan VITEK 2 sebagai metode rujukan.
1.3.2 Tujuan Khusus
1) Menganalisis akurasi identifikasi isolat bakteri kultur darah metode konvensional API terhadap metode VITEK 2
2) Menganalisis akurasi identifikasi isolat bakteri kultur darah metode semiautomatis TDR-300B terhadap metode VITEK 2
3) Menganalisis akurasi kepekaan bakteri terhadap antibiotika dengan metode konvensional difusi cakram antibiotika Kirby Bauer terhadap VITEK 2 4) Menganalisis akurasi kepekaan bakteri terhadap antibiotika dengan metode
semiautomatis TDR-300B terhadap VITEK 2
5) Membandingkan akurasi metode konvensional API dengan metode semiautomatis TDR-300B dalam mengidentifikasi bakteri kultur darah dengan menggunakan VITEK 2 sebagai metode rujukan
6 6) Membandingkan akurasi tes kepekaan antibiotika metode konvensional difusi cakram antibiotika Kirby Bauer dengan metode semiautomatis TDR-300B dengan menggunakan VITEK 2 sebagai metode rujukan
1.4 Manfaat Penelitian
1.4.1 Manfaat keilmuan
Meningkatkan wawasan peneliti di bidang Patologi Klinik subdivisi penyakit infeksi tentang peran identifikasi bakteri dan uji kepekaan antibiotika
1.4.2 Manfaat terapan
1) Melalui uji kesesuaian identifikasi dan tes kepekaan antibiotika dapat membantu mencari penyebab infeksi aliran darah sehingga pemberian antibiotika lebih tepat
2) Menilai kesesuaian metode identifikasi konvensional API dan tes kepekaan antibiotika metode konvensional difusi cakram antibiotika Kirby Bauer dengan metode semiautomatis dan metode automatis sebagai pertimbangan untuk memilih metode yang lebih tepat berdasarkan sumber daya yang ada.
7
Bab 2
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri yang sering sebagai penyebab bakteremia antara lain Staphylococcus aureus, Escherechia coli, Coagulase Negative Staphylococcus, Enterococcus sp, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae, Enterobacter cloacae, Proteus sp dan beta hemolitic Streptococcus (Forbes, 2007; Vandepitte, 2003). Metode pemeriksaan identifikasi bakteri ini secara fenotipe, dapat dilakukan dengan berbagai metode baik konvensional ataupun automatis (O’Hara, 2005).
2.1 Identifikasi Bakteri Dengan Metode Analytical Profile Index (API)
Metode Analytical Profile Index (API) merupakan pemeriksaan identifikasi manual komersial yang mulai dipublikasi pada tahun 1971. Awalnya produk ini diproduksi oleh Analytab Product Division of American Home Product dan pada tahun 1986 dibeli oleh Biomerieux.Metode API terdiri dari strip plastik (gambar 2.1) yang tersusun dari tube dan cupules (gambar 2.4). Setiap microtube terisi oleh substrat yang terdehidrasi untuk tes yang berbeda. Awalnya metode ini diciptakan oleh Buissiere dan Nardon yang banyak menciptakan metode micromethode dan dimodifikasi oleh Hartman (Biomerieux, 2010; Smith et al 1972, Leboffe et al, 2011).Metode API dapat memeriksa berbagai bakteri untuk spesifikasi bakteri tertentu seperti Enterobacteriaceae, Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus, Listeria, Yeast, Camylobacter, Listeria, Bacillus dan Neiserria seperti tampak pada tabel 2.1 (Biomerieux, 2009).
8
Tabel 2.1. Jenis pemeriksaan metode API(Biomerieux, 2009) Jenis API Mikroorganisme Suspensi Mc
Farland Inkubasi Atmosfer API 20E Enterobacteriaceae,
Batang Gram negatif
Rapid 20E Enterobacteriaceae 5mL NaCL
0,85% 0,5 37
0C
4 jam Aerob API 20S Enterobacteriaceae,
Batang Gram negatif
API STAPH Staphylococcus,
Micrococcus API Staph medium 0,5 37 0C
24-48 jam Aerob API 20 STREP Streptococcus 2mL API 20
Strep medium 4 37 API Campy Campylobacter 3mL NaCL
0,85% 6 37
API 50 CHL Lactobacillus API CHL
medium 2 37
0C
48 jam Aerob
9
Gambar 2.1. Strip plastik API (Leboffe, 2011)
2.1.1 API Staph
API Staph merupakan metode identifikasi bakteri genus Staphylococcus, Micrococcus dan Kocuria dengan memakai tes biokimia dalam microtube dan database yang dimodifikasi. Daftar lengkap bakteri yang dapat diidentifikasi oleh metode ini, dapat dilihat pada lembar rujukan API. API Staph terdiri dari 20 microtube yang mengandung dehydrated substrat yang akan diinokulasi dengan suspensi bakteri. Setiap API Staph kit terdiri dari 25 strip API Staph, 25 API Staph medium dan 25 lembar hasil. Alat dan bahan yang diperlukan untuk identifikasi bakteri dengan metode ini antara lain strip API Staph, media API Staph, mineral oil, reagen VP 1 + VP 2, reagen NIT 1 + NIT 2, reagen ZYM A + ZYM B, standar Mc Farland, pipet atau PSIpettes, rak ampul, dan pelindung ampul (Biomerieux,2010).
Sebelum digunakan untuk pemeriksaan, sebaiknya diperiksa terlebih dahulu tanggal kedaluwarsa reagen dan strip, keutuhan kemasan dan komponen, kerusakan cupule dan desicant. Strip dan media disimpan pada suhu 2-80C sampai tanggal
10 kedaluwarsa. Ampul dibuka dengan mengikuti prosedur sebagai berikut (gambar 2.2):
Gambar 2.2. Dua bentuk ampul dan cara membuka ampule API medium, tekan horizontal dilanjutkan tekan ke bawah (Biomerieux,2010)
1) ampul diletakkan pada ampule protector
2) ampul dipegang dengan satu tangan, dengan posisi vertikal dimana plastic cap berada di atas
3) tekan cap ke bawah sejauh mungkin, kemudian cap ditutup dengan bagian atas ibu jari
4) tekankan ibu jari ke secara horizontal setelah ditekan ke bawah 5) ampul dikeluarkan dari protector
6) cap dikeluarkan secara hati-hati (Biomerieux,2010).
Langkah pemeriksaan identifikasi dengan API Staph meliputi persiapan strip, persiapan inokulum, inokulasi strip, pembacaan dan interpretasi hasil. Persiapan strip dilakukan dengan menyiapkan kotak inkubasi yang terdiri dari nampan dan tutup nampan (gambar 2.3). Tutup nampan dibuka, air suling atau demineralized water (air tanpa zat aditif atau kimia yang dapat melepaskan gas seperti Cl2, CO2) dimasukkan ke dalam honey comb well nampan untuk menciptakan suasana lembab. Galur acuan atau identitas dicatat pada nampan,
11 jangan mencatat pada tutup nampan karena dapat tertukar selama pemeriksaan. Strip diletakkan pada kotak inkubasi (Biomerieux,2010).
Gambar 2.3. Nampan (A), tutup nampan (B), penulisan identitas (C) dan Strip API (D) (dimodifikasi dari Darbandi,2010)
Gambar 2.4. Satu microtube, Tube (A), Cupule (B), dan PSIpette (C) ( dimodifikasi dari Biomerieux, 2010)
12 Isolat bakteri yang dipakai merupakan subkultur bakteri pada media Columbia Blood Agar yang berumur 18-24 jam yang diinkubasi pada suhu 360C ± 20C. Isolat bakteri diperiksa secara morfologi, kemurnian isolat, pengecatan Gram, dan uji katalase untuk menentukan apakah termasuk Micrococcaeae. Isolat bakteri yang murni diambil dan dibuat suspensi bakteri 0,5 Mc Farland dengan melarutkan isolat ke media API Staph. Pembuatan suspensi bakteri ini harus menggunakan kultur yang berumur 18-24 jam. Suspensi bakteri digunakan segera setelah dibuat (Biomerieux,2010).
Suspensi bakteri yang telah dibuat tersebut, diinokulasikan ke strip API Staph dengan menggunakan pipette atau PSIpette. Microtube diisi tetapi cupule jangan sampai terisi suspensi bakteri (gambar 2.4). Usahakan jangan sampai terbentuk gelembung udara pada tube dengan cara strip dimiringkan sedikit ke depan dan ujung tip pipette diletakkan pada sisi cupule. Tes untuk ADH dan URE ditambahkan mineral oil untuk membuat suasana anaerob sampai terbentuk convex meniscus. Tes kimia pada API Staph dapat dilihat pada tabel 2.2. Nampan dengan ditutup dengan tutup nampan dan diinkubasi pada suhu 360C ± 20C selama 18-24 jam (Biomerieux,2010).
Pembacaan strip dilakukan setelah inkubasi selama 18-24 jam tersebut. Beberapa tes kimia memerlukan penambahan satu tetes reagen sebagai berilut: Tes VP : ditambahkan reagen VP 1 dan VP2, ditunggu 10 menit, reaksi positif memperlihatkan warna violet – merah muda. Reaksi yang memperlihatkan warna merah muda pucat atau merah muda terang setelah 10 menit dianggap negatif
Tes NIT : ditambahkan reagen NIT 1 dan NIT 2, ditunggu selama 10 menit,
13 warna merah menunjukkan reaksi positif
Tes PAL : ditambahkan reagen ZYM A dan ZYM B, ditunggu selama 10 menit. Warna violet menunjukkan reaksi positif.
Tes resistensi terhadap Lysostaphin dikerjakan untuk mengisi hasil tes ke-21 jika diperlukan. Inokulasi permukaan P agar dengan suspensi bakteri, dibiarkan kering pada suhu 360C±20C selama 10 – 20 menit. Kemudian ditambahkan dengan satu tetes larutan Lysostaphin (200 μg/mL) dan diinkubasi pada suhu 350C-370C selama 18-24 jam. Sussceptible menunjukkan adanya lisis parsial. Hasil tes positif dan negatif dapat dilihat pada gambar 2.6. Prosedur kerja dilihat pada gambar 2.5 (Biomerieux,2010).
Identifikasi bakteri diperoleh melalui profil angka. Lembar hasil tes terdiri dari tiga kelompok microtube yang berisi angka 1,2 dan 4. Hasil positif dijumlahkan sehingga diperoleh tujuh digit angka (pada gambar 2.7 tujuh digit angka tersebut adalah 6706113). Tujuh digit angka tersebut kemudian dicocokkan dengan tabel profil atau dapat dimasukkan hasil positif dan negatif ke apiwebTM. Program pemantapan mutu internal untuk metode API Staph dianjurkan dengan menilai performa metode API Staph dalam mengidentifikasi kuman kontrol. Kuman kontrol yang direkomendasikan untuk metode API Staph adalah Staphylococcus xylosus ATCC (American Type Culture Collection) 700404, Staphylococcus lentus ATCC 700403, Staphylococcus capitis ATCC 35661 (Biomerieux, 2006, Biomerieux,2010)
2.1.2 API 20 Strep
14 Strip API 20 Strep terdiri dari miniotube yang berisi dehydrated substrate untuk memperlihatkan aktivitas enzim atau fermentasi gula. Reaksi enzimatik memerlukan suspensi bakteri dengan tingkat kekeruhan yang pekat dan berasal dari koloni yang murni.
Gambar 2.5. Ringkasan pemeriksaan dengan API Staph (Biomerieux,2010) Kultur pada blood agar
Kokus Gram +, katalase +
Tes resistensi
terhadap Lysostaphin
15
Tabel 2.2. Tes biokimia pada API Staph (Biomerieux,2010)
Test Komposisi Reaksi Hasil
Negatif Positif
0 Tanpa substrat Kontrol negatif Merah -
GLU D-glukosa Kontrol positif Merah Kuning
FRU D-Fruktosa Fermentasi
fruktosa Merah Kuning
MNE D-Manosa Fermentasi
mannosa Merah Kuning
MAL D-Maltosa Fermentasi maltosa Merah Kuning
LAC D-laktosa Fermentasi laktosa Merah Kuning
TRE D-trehalosa Fermentasi
trehalosa Merah Kuning
MAN D-manitol Fermentasi manitol Merah Kuning
XLT Xylitol Fermentasi xylitol Merah Kuning
MEL D-melibiose Fermentasi
melibiose Merah Kuning NIT Potassium nitrate Reduksi nitrat
menjadi nitrit Pucat-merah muda pucat Merah
PAL ß Naphthyl
phosphate phosphatase Alkaline Kuning Violet VP Sodium pyruvate Produksi Acetyl
methyl carbinol
RAF D-rafinose Fermentasi
raffinosa Merah Kuning
XYL D-xylose Fermentasi xylosa Merah Kuning
SAC D-saccharose Fermentasi
saccharosa Merah Kuning
MDG Methyl
αD-glucopyranoside Fermentasi methyl αD-glucopyranoside
Merah Kuning
NAG N acethyl
glucosamine Fermentasi N acethyl glucosamine
Merah Kuning
ADH L-Arginine Arginine
dihydrolase Kuning Oranye-merah
URE Urea Urease Kuning Merah-violet
16
Gambar 2.6. Hasil tes kimia positif (bawah) dan negatif (atas) pada API Staph (Biomerieux,2002).
Gambar 2.7. Lembar hasil API Staph (Biomerieux,2010)
Proses metabolisme selama inkubasi akan memerlukan suspensi bakteri dengan tingkat kekeruhan yang pekat dan berasal dari koloni yang murni. Proses metabolisme selama inkubasi akan menghasilkan perubahan warna pada substrat baik terjadi secara spontan ataupun setelah penambahan reagen tambahan. Tes fermentasi substrat gula menggunakan rehydrated sugar substrate, dimana reaksi dinilai berdasarkan perubahan pH. Hasil dibaca berdasarkan reading table dan hasil identifikasi ditentukan berdasarkan profile index atau melalui software (Biomerieux, 2006, Biomerieux, 2007).
17 Setiap API 20 Strep kit berisi masing-masing 25 strip API Strep, kotak inkubasi, dan lembar hasil. Reagen dan peralatan lain yang dibutuhkan tetapi tidak termasuk dalam kit adalah reagen VP1,VP2, ZYM A, ZYM B, NIN, mineral oil, standar 4 Mc Farland, API profile index atau apiweb identification software. Peralatan yang digunakan pada metode ini antara lain swab, pipette, ampule rack, ampule protector, anaerobic jar, dan peralatan laboratorium mikrobiologi lainnya. Sebelum digunakan untuk pemeriksaan, sebaiknya diperiksa terlebih dahulu tanggal kedaluwarsa reagen dan strip, keutuhan kemasan dan komponen, kerusakan cupule dan desicant. Strip dan media disimpan pada suhu 2-80C sampai tanggal kedaluwarsa. Ampul dibuka dengan mengikuti prosedur seperti gambar 2.2 (Biomerieux, 2006, Biomerieux, 2007).
Strip API Strep disiapkan sama seperti pada strip API Staph, tutup nampan dibuka dan dipisahkan dari nampan. Air suling atau demineralized water (air tanpa zat aditif atau zat kimia yang dapat melepaskan gas seperti Cl2, CO2) dimasukkan ke dalam honey comb well nampan untuk menciptakan suasana lembab. Referensi strain atau identitas dicatat pada nampan, jangan mencatat pada tutup nampan karena dapat tertukar selama pemeriksaan (gambar 2.3 dan gambar 2.4). Strip API Strep kemudian diletakkan pada kotak inkubasi. (Biomerieux,2006; Biomerieux, 2007).
Isolat bakteri yang dipakai merupakan subkultur bakteri pada media Columbia Blood Agar yang berumur 18-24 jam yang diinkubasi pada suhu 360C ± 20C (ß haemolytic Streptococcus dan Enterococci) atau 48 jam untuk Streptococcus
sp lainnya dalam suasana anaerob.
18
Tabel 2.3 Tes biokimia pada API 20 Strep (Biomerieux, 2006, Biomerieux, 2007)
Test Komposisi Reaksi/Enzim Hasil
Negatif Positif
VP Sodium
pyruvate Produksi acetoin Tak berwarna Merah muda-merah
HIP Hippuric acid Hidrolisis
(Hippuric acid) pucat kebiruan/ Tak berwarna, kehijauan
Biru gelap/ Ungu
ESC Esculin ferric
citrate ß-glucosidase hydrolysis 4 jam 24 jam 4 jam 24 jam
arylamidase Tak berwarna, pucat Oranye
αGAL
6-bromo-2-naphtyl αDgalactopyran
oside
α
Galactosidase Tak berwarna Oranye
ßGUR
NaphtholASBI-glucoronic ßGlucoronidase Tak berwarna Biru
ßGAL 2-napthyl ßD
galactopyrano side
ß
Galactosidase Tak berwarna, pucat Ungu
PAL 2 napthyl
phosphate phosphatase Alkaline Tak berwarna, pucat Ungu
LAP L leucine
ßnapthylamide aminopeptidase Leucine Tak berwarna Oranye
ADH L arginine Arginine
dihydolase Kuning Merah
4 jam 24 jam 4 jam 24 jam
RIB D ribose acidificaation Merah Oranye
-merah Oranye/ kuning Kuning
ARA L arabinose acidification Merah Oranye
-merah Oranye/ kuning Kuning
MAN D manitol acidification Merah Oranye
-merah Oranye/ kuning Kuning SOR D sorbitol acidification Merah Oranye-
merah Oranye/ kuning Kuning
19
Lanjutan tabel 2.3
Test Komposisi Reaksi/Enzim Hasil
Negatif Positif
4 jam 24 jam 4 jam 24 jam
LAC D lactose acidification Merah Oranye-
merah Oranye/ kuning Kuning TRE D trehalose acidification Merah Oranye-
merah Oranye/ kuning Kuning
INU Inulin acidification Merah Oranye-
merah Oranye/ kuning Kuning
RAF D raffinose acidification Merah Oranye-
merah Oranye/ kuning Kuning
AMD Starch acidification Merah Oranye-
merah Oranye/ kuning Kuning
GLYG Glycogen acidification Merah Oranye-
merah Oranye/ kuning Kuning
Bakteri fastidious dikultur pada Schaedler broth pada 360C ± 20C selama 5 jam kemudian seluruh koloni digenangkan di Columbia Blood Agar dan diinkubasi lagi selama 18-24 jam. Isolat bakteri yang murni diambil dan dibuat suspensi bakteri dengan kekeruhan lebih dari 4 Mc Farland dengan melarutkan isolat ke media API Strep (volume 2 mL). Suspensi bakteri digunakan segera setelah dibuat (Biomerieux, 2006, Biomerieux, 2007).
20 suspensi. Tes yang ditandai dengan tanda garis bawah “ “ ( ADH sampai GLYG) diberi mineral oil sampai terbentuk meniskus yang konveks. Nampan kemudian ditutup dan diinkubasi pada suhu 360C ± 20C selama 4 – 4,5 jam dalam suasana aerob. Strip kemudian dibaca, jika bakteria belum teridentifikasi maka dilanjutkan dengan inkubasi kedua selama 24 jam ± 2 jam untuk pembacaan kedua (Biomerieux, 2006, Biomerieux, 2007).
Setelah inkubasi 4 jam, maka ditambahkan 1 tetes reagen VP1 dan VP2 untuk tes VP, 2 tetes reagen NIN untuk tes HIP, serta masing-masing satu tetes reagen ZYM A dan ZYM B untuk tes PYRA, αGAL, ßGUR, ßGAL, PAL, dan LAP. Hasil dibaca dengan memasukkan data ke apiweb. Inkubasi ulang dikerjakan jika hasil bacaan apiweb pada inkubasi pertama “low discrimination”, “unacceptable“, “doubtful” atau “not valid”. Inkubasi kedua ini untuk membaca tes ESC, ADH, RIB, ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU, RAF, AMD dan GLYG. Reaksi enzimatik tidak boleh dibaca ulang. Program pemantapan mutu metode ini direkomendasikan menggunakan kuman kontrol Streptococcus equi spp zooepidemicus ATCC 700400 atau Streptococcus uberis ATCC 700407 (Biomerieux,2006; Biomerieux, 2007).
2.1.3 API 20 E
API 20 E merupakan metode pemeriksaan bakteri untuk batang Gram negatif golongan Enterobacteriaceae dan non fastidius lainnya. Strip API 20 E terdiri dari 20 compartment microtube untuk tes biokimia. Bahan kimia yang dipakai untuk tes biokimia pada microtube API 20 E tampak seperti tabel 2.4 (O’Hara,2005; Biomeriux,2008;2009;2010;Darbandi,2010).
21
Tabel 2.4. Tes biokimia dan reaksi substrat pada API 20E (Biomeriux,2010)
Test Komposisi Reaksi Hasil
Negatif Positif ONPG 2 Nitrophenyl ßD
Galactopyranoside Ortho Nitrophenyl ßD Galactopyranosidase berwarna Tidak Kuning ADH L-Arginine Arginine Dihydrolase Kuning Merah-orange
LDC L-Lysin Lysine Decarboxilase Kuning Merah-Orange
ODC L-Ornithin Ornithine decarboxilase Kuning Merah-Orange [CIT] Trinatriumcitrat Citrate utilization Hijau-kuning
pucat Hijau kebiruan-biru H2S Natriumthiosulfat Produksi H2S Tidak
berwarna-kehijauan
Deposit hitam
URE Urea Urease Kuning Merah-orange
TDA L-Tryptophane Trypthophane deaminase Kuning Cokelat kemerahan
IND L-Tryptophane Produksi indol Tidak
berwarna-hijau pucat- kuning
pucat
Merah muda
[VP] Natriumpyruvat Produksi acetoin Tidak
berwarna-difusi Pigmen hitam Glu D-glukosa Fermentasi-oksidasi Biru-biru
kehijauan Kuning – kuning kehijauan Man D-manitol Fermentasi-oksidasi Biru-biru
kehijauan Kuning INO Inositol Fermentasi-oksidasi Biru-biru
kehijauan Kuning SOR D-sorbitol Fermentasi-oksidasi Biru-biru
kehijauan Kuning RHA L-Rhamnosa Fermentasi-oksidasi Biru-biru
kehijauan Kuning SAC D-sakarosa Fermentasi-oksidasi Biru-biru
kehijauan Kuning MEL D-melibiosa Fermentasi-oksidasi Biru-biru
kehijauan Kuning AMY Amygdalin Fermentasi-oksidasi Biru-biru
kehijauan Kuning ARA L-arabinosa Fermentasi-oksidasi Biru-biru
kehijauan Kuning OX Tes oksidase
(tidak termasuk dalam paket)
Cytochrome-oksidase
22 Metode ini memerlukan beberapa reagen dan material lain yang tidak termasuk dalam paket seperti medium API NaCl 0.85 %, API Suspension Medium, API 20 E reagent kit, JAMES, VP 1 + VP 2, NIT 1 + NIT 2, reagen Zn , oksidase, mineral oil, dan API Web identification software (Biomerieux,2010)
Sebelum melakukan pemeriksaan, sebaiknya diperiksa tanggal kedaluwarsa, perubahan bentuk cupule, keutuhan kemasan dan kemasan desiccant. Pemakaian strip yang mengalami kerusakan akan mempengaruhi hasil analisis. Prosedur pemeriksaan harus diikuti dan interpretasi dibuat dengan memperhatikan riwayat penderita, jenis spesimen dan pemeriksaan mikroskopik morfologi isolat. Strip dikemas dalam kemasan clip seal aluminium dengan desiccant sachet, strip disimpan pada suhu 2-80C dan tahan sampai 10 bulan setelah kemasan aluminium dibuka. API 20 E tidak dapat digunakan untuk memeriksa spesimen secara langsung. Bakteri yang akan diidentifikasi harus diisolasi dahulu di media kultur. Prosedur identifikasi bakteri dengan API 20 E dapat dilihat pada gambar 2.3 (Biomerieux,2010).
Sebelum membuat suspensi bakteri, terlebih dahulu dilakukan tes oksidase. Hasil tes oksidase akan dimasukkan ke lembar hasil akhir. Secara garis besar langkah pemeriksaan meliputi persiapan strip tes API, persiapan inokulum dan inokulasi strip API. Setiap strip API terdiri dari nampan inkubasi (tray) dan tutupnya (lid). Honey combed dalam nampan diisi dengan 5 mL distilled water atau demineralized water untuk membuat suasana lembab. Identitas penderita ditulis di nampan dan sebaiknya jangan menulis identitas pada tutup nampan karena dapat tertukar. Nampan (tray) dan tutup nampan (lid) serta penulisan identitas dapat dilihat pada gambar 2.3 (Biomerieux,2010).
23 Inokulum disiapkan dengan membuka ampul media API (NaCl 0,85% 5 mL) atau dapat juga menggunakan 5 mL saline atau distiled water steril dalam tabung steril. Isolat bakteri tunggal yang terisolasi dengan baik kemudian diemulsikan ke dalam tabung tersebut dengan menggunakan PSIpette atau ose steril. Isolat bakteri diemulsikan secara hati-hati sehingga diperoleh suspensi bakteri yang homogen. Isolat bakteri yang dipakai adalah isolat yang berumur 18-24 jam. Suspensi bakteri ini segera diinokulasikan ke strip API 20 E dengan menggunakan pipette. Diusahakan agar tidak terbentuk gelembung udara pada microtube, nampan dimiringkan dan microtube diisi dengan menempatkan ujung pipette pada sisi cupule. Tes ADH, LDC, ODC, H2S dan URE diisi inokulum bakteri hanya pada
tube kemudian bagian cupule diisi mineral oil untuk menciptakan suasana anaerob. Tes [CIT], [VP] dan [GEL] diisi suspensi bakteri pada tube dan cupule. Tes yang lain diisi inokulum bakteri hanya pada tube (Biomerieux,2010; Smith,1972; Darbandi,2010).
Setelah semua microtube pada strip diinokulasi dengan suspensi bakteri, nampan ditutup dan diinkubasi pada suhu 360C ± 2 selama 18-24 jam. Strip dibaca dengan merujuk pada warna rujukan API 20 E (gambar 2.9). Jika tiga atau lebih tes hasilnya positif, catat hasil spontan pada lembar hasil (gambar 2.10) dan lanjutkan tes yang memerlukan reagen tambahan seperti pada tes:
Tes TDA : tambahkan 1 tetes reagen PDA, hasil positif berwarna cokelat
kemerahan
Tes IND : tambahkan 1 tetes reagen James, reaksi positif menunjukkan warna
merah muda. Tes indol harus dikerjakan paling akhir karena dapat memproduksi gas yang dapat mengganggu tes lainnya.
24
Gambar 2.8. Prosedur pemeriksaan dengan API 20 E (Biomerieux,2002)
Satu koloni
Tes positif kurang
dari 3
25
Gambar 2.9. Rujukan nilai positif dan negatif API 20 E (Biomerieux,2002).
Tes VP : tambahkan masing-masing 1 tetes reagen VP 1 dan VP 2 , ditunggu selama 10 menit. Reaksi positif menunjukkan warna merah muda
atau merah. Warna merah muda yang pucat setelah 10 menit memungkinkan reaksi yang negatif.
Interpretasi hasil identifikasi dilakukan dengan memasukkan hasil tes positif atau negatif ke lembar hasil (gambar 2.10). Lembar hasil terdiri dari kelompok tes yang setiap kelompok berisi tiga jenis tes. Setiap tes mempunyai nilai 1, 2 atau 4. Nilai pada kelompok yang terdiri dari tiga tes tadi dijumlahkan, sehingga diperoleh tujuh digit angka yang menunjukkan profile bakteri (gambar 2.10 angka itu 5315173). Identifikasi bakteri profile tersebut dicocokkan dengan tabel profile atau dapat disesuaikan dengan apiweb software. tujuh digit angka tersebut tidak cukup untuk identifikasi bakteri pada beberapa kasus, sehingga diperlukan tes tambahan seperti reduksi nitrat, adanya gas N2, motility (MOB), growth on Mc
26 Conkey (McC), oksidasi glukosa (OF-O), fermentasi glukosa (OF-F) (Biomerieux,2010).
Tes reduksi nitrat menjadi nitrit (NO2) dan produksi gas N2 dilakukan dengan menambahkan reagen NIT 1 dan NIT 2 ke cupule glukosa kemudian ditunggu 2-5 menit. Warna merah menunjukkan reaksi nitrit positif sedangkan warna kuning menunjukkan reaksi negatif. Reduksi menjadi gas N2 diperiksa dengan menambahkan 2-3 mg reagen Zn ke cupule glukosa, setelah 5 menit dan warna tetap kuning menunjukkan reaksi N2 positif. Warna jingga-merah menunjukkan reaksi N2 negatif, nitrat masih ada di cupule setelah direduksi oleh Zn (Biomerieux,2010). Tes motility dikerjakan dengan inokulasi bakteri pada media API M, pertumbuhan di media Mc Conkey, media OF-O dan OF-F juga dikerjakan sehingga diperoleh sembilan digit angka (Biomerieux,2010).
Gambar 2.10. Contohkertas hasil tes API 20 E (Biomerieux,2010)
Program pemantapan mutu metode ini dilakukan dengan menilai performa metode terhadap kuman kontrol yang dilakukan sesuai dengan instruksi. Beberapa kuman kontrol yang direkomendasikan antara lain Proteus mirabilis ATCC 35659, Stenotrophomonas malthophilia ATCC 51331, Enterobacter cloacae ATCC 13047, Eschericia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumonia ssp pneumoniae ATCC 35657 (Biomerieux,2010).
27 2.1.4 API 20NE
Strip API 20NE merupakan sistem identifikasi batang Gram negatif non enterik dan non fastidious seperti Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas dan lain sebagainya. Strip terdiri dari 20 buah microtube yang mengandung dehydrated substrate untuk tes biokimia. Substrat ini diinokulasi dengan suspensi bakteri dalam larutan salin sehingga proses metabolisme akan menghasilkan perubahan warna yang terjadi secara spontan ataupun setelah ditambahi dengan reagen tambahan. Setiap kit API 20NE terdiri dari masing-masing 25 buah strip API 20NE, kotak inkubasi, API AUX medium, dan lembar hasil. Reagen tambahan yang tidak termasuk dalam kit antara lain API medium, reagen James, reagen NIT 1 + NIT2, dan reagen Zn. Tes biokimia yang digunakan pada API 20NE dapat dilihat di tabel 2.5 (Biomerieux,2009; Biomerieux,2010).
Pemeriksaan dengan API 20E, didahului dengan tes oksidase. Hasil tes oksidase ini akan dimasukkan ke lembar hasil akhir. Secara garis besar langkah pemeriksaan meliputi persiapan strip tes API, persiapan inokulum, inokulasi strip API dan interpretasi hasil. Honey comb dalam nampan diisi dengan 5 mL distilled water atau demineralized water untuk membuat suasana lembab. Identitas penderita ditulis di nampan dan sebaiknya jangan menulis identitas di tutup nampan karena dapat tertukar. Persiapan inokulum juga sama dengan API 20E, dimana dibuat suspensi bakteri dengan memasukkan isolat ke API medium. Kekeruhan suspensi bakteri dibuat 0,5 Mc Farland. (Biomerieux,2009;Biomerieux,2010).
Inokulasi suspensi bakteri dilakukan secara hati-hati dan diusahakan agar tidak terbentuk gelembung udara. Inokulasi tes NO3 sampai PNPG dilakukan dulu.
28
Tabel 2.5. Tes biokimia pada API 20NE (Biomerieux,2010)
Test Komposisi Reaksi Hasil
Negatif Positif
NO3 Potassium nitrate Reduksi nitrat
menjadi nitrit berwarna Tak Merah muda- merah
Reduksi nitrat
menjadi nitrogen Merah muda Tak berwarna
TRP L trypthophan Produksi indol Tak
berwarna, pucat kehijauan/ kekuningan
Merah muda
GLU D glucose fermentasi Biru-hijau Kuning
ADH L arginine Arginine dihydrolase Kuning Oranye/merah muda/merah
URE Urea Urease Kuning Oranye/merah
muda/merah ESC Esculine ferric
citrate Hidrolisis esculine Kuning cokelat/ hitam Abu-abu/
GEL Gelatin Hidrolisis gelatin Tanpa
pigmen Pigmen hitam
PNPG 4-nitrophenyl ßD
galactopyranoside ß galactosidase berwarna Tak Kuning
[GLU] D glucose asimilasi Transparan Opaq
[ARA] Larabinose asimilasi Transparan Opaq
[MNE] D mannose asimilasi Transparan Opaq
[MAN] D mannitol asimilasi Transparan Opaq
[NAG] N acethyl
glucosamine asimilasi Transparan Opaq
[MAL] D maltose asimilasi Transparan Opaq
[GNT] Potassium
gluconate asimilasi Transparan Opaq
[CAP] Capric acid asimilasi Transparan Opaq
[ADI] Adiptic acid asimilasi Transparan Opaq
[MLT] Malic acid asimilasi Transparan Opaq
[CIT] Trisodium citrate asimilasi Transparan Opaq
[PAC] Phenylacetic acid asimilasi Transparan Opaq
29 Sisa 200 μL suspensi bakteri kemudian dimasukkan ke API AUX Medium dan dihomogenkan. Suspensi yang baru dibuat ini kemudian diinokulasikan ke tes [GLU] sampai [PAC]. Tes ini diisi sampai cupule sampai sedikit konveks dan tidak boleh konkaf. Tambahkan mineral oil sampai cupule pada tes GLU, ADH, dan URE. Strip diinkubasi pada 290C ± 20C selama 24 jam (Biomerieux,2010).
2.2 Tes Kepekaan Antibiotika Konvensional
Tes kepekaan antibiotika dilakukan untuk menilai kemampuan antibiotika untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme secara in vitro. Kemampuan ini dinilai melalui metode dilusi dan difusi. Metode dilusi menilai kemampuan antibiotika secara kuantitatif dengan melakukan pengenceran terhadap antibiotika dalam media broth atau agar. Konsentrasi minimal antibiotika yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme setelah diinkubasi selama satu malam dikenal sebagai Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Nilai MIC ini kemudian dibandingkan dengan konsentrasi obat tersebut dalam serum untuk menilai respon klinis (Forbes,2007;Vandepitte,2003). Metode yang akan dipakai dalam penelitian ini adalah metode konvensional dengan tes difusi cakram antibiotika .
2.2.1 Tes difusi cakram antibiotika Kirby Bauer
30 antibiotika yang diujikan. Hubungan nilai zona hambatan (metode difusi) dengan MIC (metode dilusi) dalam menentukan respon klinis sebagai sensitif, intermediate dan resisten dapat dilihat pada gambar 2.11 (Forbes,2007;Vandepitte,2003) .
Gambar 2.11. Contoh hubungan interpretasi Minimal Inhibitory Concentration/MIC (sumbu X) dengan diameter zona hambatan (sumbu Y), semakin besar zona hambatan (S >27mm) pada sumbu Y, berbanding terbalik dengan semakin kecilnya MIC (S<0,25μG/mL) pada sumbu X, serta
sebaliknya (Vandepitte,2003)
Pemilihan cakram antibiotika yang digunakan dan nilai zona hambatan yang diinterpretasi sensitif, intermediate dan resisten pada pemeriksaan tes metode difusi disesuaikan dengan pedoman yang tercantum dalam Clinical And Laboratory Standards Institute (CLSI). Antibiotika yang dipakai terdiri dari antibiotika grup A, B, C dan U. Antibiotika grup A merupakan antibiotika yang rutin digunakan pada pemeriksaan tes kepekaan antibiotika dan dilaporkan secara rutin. Antibiotika grup B merupakan antimikroba primer yang dilaporkan secara selektif seperti mikroba resisten terhadap antimikroba dalam kelas yang sama. Indikasi pelaporan grup B lainnya antara lain sumber spesimen yang spesifik (misalnya generasi 3 Chepalosporin pada cairan serebrospinal atau Trimethoprim Sulfamethoxazole untuk urine), infeksi polimikrobial, infeksi multiple site, kasus alergi, intoleran atau gagal berespon dengan grup A. Grup C merupakan antimikroba alternatif atau
31 tambahan yang khusus di suatu tempat karena adanya endemik atau epidemik strain yang resisten terhadap beberapa obat primer, terapi penderita yang alergi, terapi organisme yang tidak biasanya seperti Salmonella pada infeksi ekstraintestinal. Grup U (Urine) merupakan antimikroba yang khusus atau primer digunakan untuk pengobatan infeksi saluran kencing seperti Nitrofurantoin dan Quinolone. Antimikroba ini seharusnya tidak dilaporkan rutin untuk infeksi selain infeksi saluran kencing (Forbes,2007;Vandepitte,2003,Patel,2015).
Selain cakram antibiotika, metode ini juga membutuhkan beberapa peralatan dan bahan lain seperti standar kekeruhan Mc Farland, cotton swab steril dan media agar Mueller Hinton. Standar kekeruhan dapat dibeli atau dibuat dengan menuangkan 0,6 mL larutan Barium klorida dihidrat 1% ke dalam graduated cylinder dan ditambahkan dengan asam sulfat 1% sampai volume menjadi 100 mL. Standar ini dituangkan ke tabung seperti tabung untuk broth agar dan disimpan dalam kondisi tertutup di tempat gelap di suhu ruang. Standar ini dapat bertahan selama 6 bulan. Cotton swab steril diperlukan untuk melakukan pulasan bakteri yang diuji ke media lempeng agar Mueller Hinton. Media Mueller Hinton plate agar dibuat dari dehydrated based sesuai dengan instruksi pabrik. Ketebalan media sekitar 4 mm, dengan volume media kurang lebih 25-30 mL pada plate dengan diameter 10 cm. Performa media plate ini dinilai dengan menanamkan kuman kontrol (Patel,2015).
Inokulum disiapkan dari kultur plate primer di mana isolat bakteri yang diuji diambil dengan sengkelit (gambar 2.12). Sengkelit disterilkan dengan dibakar terlebih dahulu. Koloni yang diambil adalah koloni yang tampak serupa supaya isolat yang didapatkan murni. Isolat kemudian dipindahkan ke tabung yang berisi
32 salin (gambar 2.13). Sengkelit yang berisi bakteri disuspensikan secara merata di tabung salin.
Gambar 2.12. Pengambilan isolat bakteri dari kultur plate primer (http://www.123rf.com/stock-photo/bacteria_culture.html)
Suspensi bakteri yang telah dibuat, diperiksa kekeruhannya dengan membandingkan dengan standar turbidity yang telah dibuat (gambar 2.14). Sesuaikan kekeruhan suspensi bakteri dengan menambahkan isolat bakteri atau menambahkan salin steril. Kekeruhan inokulum dapat mempengaruhi hasil tes (Vandepitte,2003).
Gambar 2.13. Pembuatan suspensi bakteri dengan sengkelit (dimodifikasi dari Vandepitte,2003)
33
Gambar 2.14. Membandingkan kekeruhan suspensi bakteri dengan standar Mc Farland dengan latar belakang warna hitam (Vandepitte,2003)
Gambar 2.15. Memindahkan suspensi bakteri ke plate dengan cotton swab (dimodifikasi dari Vandepitte,2003)
34
Gambar 2.16. Streaking dengan cotton swab (http://old.lf3.cuni.cz/mikrobiologie/engl/pract1.htm)
Gambar 2.17. Pemasangan cakram antibiotika pada plate (dimodifikasi dari Vandepitte,2003)
Lempeng agar Mueller Hinton diinokulasi bakteri dengan cara mencelupkan swab steril ke tabung suspensi bakteri. Kelebihan inokulum dikurangi dengan cara menekankan dan memutar swab di sisi tabung (gambar 2.15). Ulasan dilakukan secara merata di permukaan media Mueller Hinton sebanyak tiga kali, putar plate 600 setiap habis aplikasi. Terakhir usapkan swab pada pinggir plate (gambar 2.16).
35
Gambar 2.18. Pengukuranzona hambatan dengan penggaris (dimodifikasi dari Vandepitte,2003)
Gambar 2.19. Pengukuranzona hambatan dengan calipers (dimodifikasi dari Vandepitte,2003)
36
Gambar 2.20. Pengukuranzona hambatan dengan template (atas) dan interpretasi template (bawah) (Vandepitte,2003)
Cakram antibiotika ditempelkan di permukaan agar, inokulasi dengan menggunakan forceps steril (gambar 2.17). Jumlah cakram antibiotika yang digunakan pada tes kepekaan antibiotika disesuaikan dengan pedoman CLSI yaitu maksimal 12 cakram pada plate dengan diameter 150 mm atau 6 cakram pada plate dengan diameter 100 mm.Plate yang sudah berisi cakram antibiotika yang diuji ini ditempatkan dalam inkubator selama 16-20 jam pada suhu 350C. Diameter zona hambatan diukur setelah inkubasi dengan menggunakan penggaris atau calipers atau template (gambar 2.18 ;2.19; dan 2.20). Nilai yang didapat disesuaikan dengan pedoman dari CLSI (Forbes,2007; (Vandepitte,2003;Patel,2015).
37 Interpretasi hasil tes kepekaan antibiotika dikategorikan menjadi sensitif, intermediate dan resisten. Sensitif menunjukkan suatu mikroorganisme penyebab infeksi yang masih berespon terhadap terapi antibiotika dalam dosis yang dianjurkan. Intermediate di mana respon isolat dengan antibiotika pada konsentrasi Minimal Inhibitory Concentration (MIC) yang biasanya mencapai darah atau jaringan, mempunyai respon lebih buruk dibandingkan isolat yang sensitif. Efektivitas klinis tercapai di bagian tubuh di mana obat terkonsentrasi secara fisiologi (misalnya Quinolone atau Beta lactam pada urine) atau dengan memberikan dosis yang lebih besar sampai dosis maksimal. Resisten di mana mikroorganisme tidak dihambat oleh antibiotika dosis normal dan atau dosis MIC, diameter zona hambatan tidak masuk dalam rentang yang diakibatkan oleh mekanisme resistensi yang spesifik terhadap antibiotika tersebut (Patel,2015). Faktor yang mempengaruhi diameter zona hambatan di metode difusi cakram antara lain kekeruhan inokulum, keterlambatan pemasangan cakram antibiotika, suhu inkubasi, lama inkubasi, ukuran plate, ketebalan media agar, jarak antara cakram antibiotika di plate, potensi cakram antibiotika dan komposisi media. Kekeruhan inokulum yang rendah dapat menyebabkan zona hambatan yang lebih besar sehingga strain akan relatif lebih sensitif. Begitu juga, jika densitas inokulum lebih pekat dapat menyebabkan strain nampak lebih resisten. Keterlambatan pemasangan cakram antibiotika dapat menyebabkan inokulum bakteri memperbanyak diri sehingga zona hambatan menjadi lebih kecil dan strain akan relatif lebih resisten. Suhu yang lebih rendah dari 350C akan menyebabkan waktu yang diperlukan untuk pertumbuhan bakteri akan lebih lama sehingga zona
38 hambatan dapat lebih besar. Dampak dari hal ini akan menyebabkan strain nampak lebih sensitif (Forbes,2007;Vandepitte,2003).
Waktu inkubasi yang kurang dari 16 jam akan mempengaruhi pertumbuhan efektif bakteri sehingga tidak direkomendasikan untuk dilakukan. Diameter plate yang digunakan juga akan berpengaruh terhadap jumlah maksimal cakram antibiotika yang dapat dipasang. Jika cakram yang dipasang melebihi kapasitas plate maka akan mempengaruhi zona hambatan yang terbentuk. Ketebalan media agar juga dapat berpengaruh terhadap difusi cakram antibiotika. Media yang terlalu tebal akan menghambat difusi antibiotika sehingga zona yang terbentuk dapat lebih kecil dan strain nampak relatif lebih resisten. Sedangkan media yang tipis dapat menyebabkan zona hambatan lebih besar sehingga strain nampak lebih sensitif. Jarak antara cakram antibiotika dapat mempengaruhi zona hambatan yang terbentuk sehingga dapat mempengaruhi pembacaan. Potensi cakram antibiotika sangat penting untuk pembentukan zona hambatan. Penyimpanan yang lama atau tidak benar dapat membuat zona hambatan lebih kecil sehingga strain nampak relatif lebih resisten. Komposisi medium juga akan berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri sehingga kerusakan terhadap komposisi media dapat menyebabakan zona yang lebih besar (Forbes,2007;Vandepitte,2003).
Program pemantapan mutu pada tes kepekaan antibiotika metode konvensional secara difusi cakram dengan memperhatikan faktor yang mempengaruhi hasil tes seperti disebutkan sebelumnya. Beberapa faktor mungkin dapat diawasi lebih mudah seperti densitas inokulum, suhu inkubasi, lamanya pemasangan cakram dan waktu inkubasi. Faktor yang sulit dievaluasi adalah komposisi media, variasi kualitas media dan potensi cakram antibiotika. Kontrol
