ABSTRAK
OPTIMASI AMPLIFIKASI BAGIAN GEN gyrA DENGAN METODE PCR PADA ISOLAT Salmonella typhi DARI RUMAH SAKIT IMMANUEL
BANDUNG
Daniel Chandra, 2007 Pembimbing I : Ernawati Arifin Giri Rachman,Ph.D Pembimbing II : Johan Lucianus, dr., M.Si
Salmonella typhi, bakteri penyebab demam tifoid, sekarang ini telah dapat diobati dengan berbagai antibiotik-antibiotik, salah satunya adalah floroquinolone. Akan tetapi, karena penggunaan antibiotik tersebut yang terus menerus dan tidak sesuai dengan aturan maka timbul strain-strain yang resisten terhadap antibiotik ini. Resistensi Salmonella typhi terhadap antibiotik ini terjadi karena adanya mutasi-mutasi pada DNA Salmonella typhi yaitu DNA topoisomerase. Mutasi yang terjadi pada DNA topoisomerase terjadi pada DNA topisomeraseII dan DNA toposiomerase IV. DNA topoisomerase II (disebut juga dengan DNA gyrase) terdiri dari 2 macam protein (gyrA dan gyrB). Dari penelitian sebelumnya diketahui bahwa mutasi pada gen gyrA bisa single mutation ataupun double mutation, yaitu pada posisi kodon 83 atau posisi kodon 87. Strain-strain ini mungkin saja dapat ditemukan di Indonesia. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mencari kondisi PCR yang optimal untuk mengamplifikasi gen gyrA dengan menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV agar dapat diketahui pada posisi mana mutasi terjadi, sehingga dapat digunakan untuk penelitian yang lebih lanjut. Sampel DNA yang digunakan adalah DNA hasil isolasi kromosom dengan konsentrasi primer masing-masing 0.6mM. PCR dilakukan dalam 30 siklus, dengan denaturasi 940C selama 60 detik, annealing 400C selama 60 detik, dan elongasi 720C selama 60 detik. Analisis dengan elektroforesis gel agarosa 1% menunjukkan adanya pita antara 600 sampai 700 kb.
ABSTRACT
OPTIMATION OF PART gyrA GENE AMPLIFICATION OF Salmonella typhi FROM IMMANUEL HOSPITAL BANDUNG BY PCR METHOD
Daniel Chandra, 2007 First Tutor : Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph.D. Second tutor : Johan Lucianus, dr., M.Si
Salmonella typhi is an etiologic agent of typhoid fever. This disease now can be cured by antibiotics, one of them is floroquinolone. However, because of the used of these antibiotics are not follow by the rules, now there are strain of Salmonella typhi which is resistance to these antibiotics. Salmonella typhi resistancy to antibiotics is possible because there are mutations in Salmonella typhi DNA, which is DNA toposiomerase. Mutation in DNA toposiomerase occur in DNA topoisomerase II and DNA topoisomerase IV. DNA toposiomerase II ( a.k.a DNA gyrase ) divided in two protein (gyrA and gyrB). From the previous study, mutation in gyA gene can be single mutation or double mutation. This mutation occur in codon 83 and or codon 87. These strains maybe can be found in Indonesian. The main objective from this study is to find an optimal PCR condition for amplification gyA gene with gyrA-FWD primer and gyrA-REV primer so we can tell in which position the mutation occur, and can be use d for further study. DNA sample that used in this study are collected from extracted chromosom DNA, DNA amplification is extracted DNA with concentration is 0.5µL of each of the primer. PCR was performed for 30 cycles, denaturation for 60 second at 940C, annealing for 60 second at 400C, and elongation for 60 second at 720C. Analysis with 1% electrophoresis gel agarose showed at 600 to 700 bp fragment.
iii PRAKATA
Puji syukur kepada Than Yang Maha Esa atas berkat, rahmat dan
penyertaanNya sehingga Penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah ini yang
merupakan salah satu prasyarat kelulusan program studi S1 Sarjana Kedokteran (
S. Ked) Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha, sesuai dengan waktu
yang ditentukan.
Dalam melakukan penelitian dan penyusunan Karya Tulis Ilmiah ini, Penulis
banyak memperoleh dukungan dari berbagai pihak. Penulis mengucapkan terima
kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph.D. sebagai dosen pembimbing yang
telah memberikan kesempatan kepada Penulis untuk ikut ambil bagian
dalam penelitian ini. Ilmu dan pengalaman yang didapat oleh penulis
selama pengerjaan Kaya Tulis Ilmiah ini sanagt berharga dan kiranya akan
sangat bermanfaat unuk kehidupan penulis di masa yang akan datang.
Selain itu untuk segala waktu dan tenaga yang diberikan dalam membantu,
membimbing, memberikan nasehat dan dukungan moril selama
dilakukannya penelitian dan penyusunan Karya Tulis Ilmiah ini.
2. Johan Lucianus, dr., M.Si., sebagai dosen pembimbing yang telah banyak
memberikan bantuan, bimbingan dan dukungan sehingga akhirnya Karya
Tulis Ilmiah ini dapat terselesaikan dengan baik.
3. Fanny Rahardja, dr., M.Si. dan Hartini, dr. sebagai dosen penguji yang
telah bersedia menyisihkan waktunya dan memberikan kritik dan saran
yang membangun untuk perbaikan Karya Tulis Ilmiah ini.
4. Pendanaan oleh Riset KK Biokimia FMIPA ITB 2007
5. Dra. Endang Srieatimah atas bantuannya dalam pembuatan templat dan
menyediakan bahan-bahan yang diperlukan selama pengerjaan penelitian
ini.
6. Karyawan Laboratorium Mikrobiologi FK UKM : Bpk. Riska, Ibu Yuli,
Bpk. Koma dan juga Bpk. Samuel atas bimbingan dan bantuan yang
7. Bapak Denny selaku analisis laboratorim LP2IKD FK UKM yang telah
memberikan banyak bantuan dalam pelaksaaan penelitian ini.
8. Seluruh staf bagian Mikrobiologi FK UKM atas bimbingan, dukungan,
dan kehangatan yang diberikan selama ini.
9. Seluruh dosen pengajar FK UKM atas ilmu dan bimbingan yang diberikan
kepada Penulis selama mengikuti perkuliahan di FK UKM.
10.Teman seperjuangan, Hadi Sumitro Joe, yang selalu menjadi teman
berbagi dalam suka dan duka.
11.Dan semua yang ikut membantu, yang tidak dapat Penulis sebutkan satu
persatu.
Semoga Tuhan membalas setiap kebaikan yang telah diberikan kepada penulis
Ucapan terima kasih tak terhingga Penlis sampaikan kepada kedua orang tua,
Bapak Thian Soen Kiong dan Ibu Meiliana Chandra, yang telah berusaha sangat
keras, sehingga akhirnya penulis dapat kuliah di Fakultas Kedokteran. Oleh
karena dukungan doa, moril, kasih sayang, pengertian dan dorongan semangat
dari mereka semualah akhirnya Penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah
ini dengan baik.
Akhirnya, Penulis sangat berharap agar Karya Tulis Ilmiah ini dapat
bermanfaat bagi para mahasiswa / mahasiswi Fakultas Kedokteran, masyarakat,
dan perkembangan ilmu kedokteran.
Bandung, Januari 2008
v
BAB III ALAT, BAHAN DAN METODE 3.1 Subjek Penelitian... 23
3.2 Metode Penelititan ... 23
3.3 Alat dan Bahan... 23
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Penanaman sampel pada Medium SS ... 26
4.2 Pembuatan templat DNA ... 27
4.3 PCR menggunakan primer Ca8 dan Ca9 ... 27
4.4 PCR menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV... 29
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan ... 33
5.2 Saran ... 34
DAFTAR PUSTAKA... 35
RIWAYAT HIDUP... 37
vii
DAFTAR GAMBAR
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Salmonella typhi ... ..5
2.2 Penyebaran Salmonella typhi di dunia... ..6
2.3 Patogenesis Salmonella typhi ... 10
2.4 DNA Topoisomerase ... 12
2.5 Proses PCR... 19
2.6 Elektroforesis ... 21
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Salmonella typhi (ST01) pada medium SS ... 26
4.2 Salmonella typhi (ST03) pada medium SS ... 27
4.3 Salmonella typhi (ST22) pada medium SS ... 27
4.4 Hasil PCR menggunakan primer Ca8 dan Ca9... 28
4.5 Hasil PCR (Mg2+ : 1.5mM dan 2mM) dengan menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV ... 30
4.6 Hasil PCR (Mg2+ : 1.5mM) dengan menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV ... 31
DAFTAR TABEL
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Point of Mutation dari
RIWAYAT HIDUP
Nama : Daniel Chandra
NRP : 0410132
Alamat : Jl. Mandalagiri No 65, Garut, Jawa Barat
Tempat / Tanggal Lahir : Bandung, 28 Oktober 1986
Riwayat Pendidikan :
1998, Lulus SD Daya Susila, Garut, Jawa Barat
2001, Lulus SLTP Daya Susila, Garut, Jawa Barat
2004, Lulus SLTA Aloysius, Bandung, Jawa Barat
2004, Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha,
BAB I Salmonella typhi merupakan patogen yang spesifik menyerang manusia. Pada pasien dengan demam tifoid, bakteri ini berada di dalam aliran darah dan saluran pencernaannya. Selain itu ada juga pasien yang disebut sebagai karier, yaitu pasien tesebut telah sembuh dari penyakitnya tetapi di dalam tubuhnya masih terdapat bakteri. Baik orang yang sakit ataupun yang menjadi karier dapat menularkan Salmonella typhi ini. Penyakit ini menular melalui makanan dan minuman yang telah tercemar oleh Salmonella typhi sehingga mudah menimbulkan wabah.
Demam tifoid merupakan penyakit endemik yang dapat mengakibatkan kematian, yang biasanya terdapat pada negara-negara berkembang, khususnya di Asia dan Afrika, dimana sekitar 21.5 juta orang per tahunnya terkena penyakit ini. Di Amerika Serikat sendiri, walaupun sudah termasuk negara maju, masih terjadi sekitar 400 kasus demam tifoid per tahunnya, dan sekitar 75% dari kasus tersebut didapatkan saat mereka sedang melakukan perjalanan internasional. (www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/typhoidfever_g.htm)
2
Universitas Kristen Maranatha tersebut, yang disebut dengan Multi Drug Resistance Salmonella typhi (MDR-ST). Untuk mengatasi masalah tersebut maka telah dilakukan beberapa penelitian. Dan dari penelitian tersebut diketahui bahwa fluoroquinolone sangat efektif untuk mengatasi MDR-ST, dimana demam yang terjadi dapat turun dalam waktu kurang dari 4 hari dengan tingkat keberhasilan mencapai 96%, sehingga fluoroqinolone digunakan sebagai fist line drugs untuk pengobatan demam tifoid. ( Article from BMC Infectious Diseases ).
Akan tetapi setelah beberapa dekade, dengan alasan yang sama, yaitu dengan terjadinya mutasi, timbul strain Salmonella typhi yang resisten terhadap fluoroqinolone. Dan hal ini dibuktikan dengan adanya laporan-laporan yang
menyatakan adanya kegagalan dalam pengobatan demam tifoid dengan menggunakan ciprofloxacin di India dan negara-negara lain (http://jmm.sgmjournals.org). Dari semua penelitian tentang hal ini, diketahui bahwa timbulnya resistensi terhadap fluoroquinolone disebabkan karena adanya mutasi yang terjadi pada DNA topoisomerase, yaitu DNA topoisomerase II (DNA gyrase) dan DNA topoisomerase IV, selain itu diketahui juga bahwa posisi mutasi
DNA topoisomerase yang terjadi pada Salmonella typhi dari tiap-tiap negara berbeda-beda (http://www.pubmedcentral.nih.gov). Dengan kenyataan ini, mungkin saja pada Salmonella typhi galur Indonesia dapat ditemukan strain yang resisten terhadap fluoroquinolone dan posisi mutasi yang terjadi berbeda dengan negara-negara lain, sehingga perlu dilakukan penelitian pada Salmonella typhi galur Indonesia untuk mengetahui hal tersebut.
Pada penelitian ini, hanya dilakukan penelitian awal untuk mengetahui tentang mutasi DNA topoisomerase ini, yaitu mencari kondisi PCR yang paling optimal untuk mengamplifikasi gen gyrA dengan cara modifikasi dan optimalisasi kondisi PCR yang sudah ada sebelumnya.
3
1.2. Identifikasi Masalah
Bagaimana kondisi PCR yang optimal untuk mengamplifikasi bagian gen gyrA menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV
1.3.Maksud dan Tujuan
Maksud dari penelitian ini adalah untuk mengetahui adakah hubungan antara gen gyrA dengan timbulnya resistensi Salmonella typhi terhadap fluoroquinolone. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mencari kondisi PCR yang optimal untuk bagian gen gyrA dengan menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV.
1.4. Manfaat Penelitian
Karya tulis ini diharapkan dapat dijadikan penelitian pendahuluan bagi para peneliti selanjutnya agar dapat mengembangkan ilmu kedokteran khususnya dalam meningkatkan cara pengobatan terhadap infeksi kuman Salmonella typhi sehingga lebih spesifik.
1.5. Metode Penelitian
4
Universitas Kristen Maranatha 1.6. Waktu dan Lokasi Penelitian
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Penelitian ini bertujuan untuk mencari kondisi PCR yang optimal untuk bagian
gen gyrA dengan menggunakan primer gyrA-FWD dan gyrA-REV. Primer
gyrA-FWD dan gyrA-REV dirancang dengan mengoptimalisasi primer yang sudah ada
sebelumnya. Rancangan primer baru ini dapat digunakan untuk amplifikasi
dengan kondisi sebagai berikut :
• Formula PCR untuk satu kali reaksi (25µL) menggunakan primer
gyrA-FWD dan gyrA-REV adalah :
o Deion
o Buffer 1X
o dNTPs 200µM
o gyrA-FWD 0.6mM
o gyrA-REV 0.6mM
o
Mg2+ 1.5mM
o Taq polymerase 1 U
o Templat 0.5µL
• Kondisi PCR untuk mengamplifikasi gen gyrA adalah :
o Jumlah siklus : 30
o Denaturasi : 940C 1 menit
o Annealing : 400C 1 menit
34
Universitas Kristen Maranatha
5.2 Saran
• Penelitian hendaknya menggunakan lebih banyak sampel kuman yang
sebelumnya telah dideteksi sifat resistensinya terhadap fluoroquinolone
dengan menggunakan kertas cakram sehingga hasil yang diperoleh dapat
lebih baik
• Penelitian ini dapat digunakan untuk sequencing DNA Salmonella typhi
galur Indonesia sehingga kemudian dapat dilakukan penelitian lebih lanjut
untuk mengetahui hubungan antara mutasi gen gyrA dengan timbulnya
resistensi terhadap fluoroquinolone.
DAFTAR PUSTAKA
Anonymous. Cell Biology Research: Salmonella typhi
http://www.wfu.edu/~urdaaj4/Cell/index.html, 10 September 2007.
Anonymous. Typhoid Fever.
www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/typhoidfever_g.htm,5Desember 2007
Anonymous. Typhoid Fever Not Always Typhoid, Not Always Fever
http://www.expator.id/medical/typhoid.html, 16 Oktober 2007
Barnard, Faye M., Maxwell, Anthony,Department of Biochemistry, University of Leicester LE1 7RH, United Kingdom. Interaction between DNA Gyrase and Quinolones: Effects of Alanine Mutations at GyrA Subunit Residues Ser83 and Asp87
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?&artid=90591, 26 November 2007
Brown, T. A. 1995. Gene Cloning, an introduction, 3rd ed. Chapman & Hall. p. 228-238.
Kariuki, S. et al.2004. Characterization of Multidrug-Resistant Typhoid Outbreak in Kenya.
Lesser, C.F., Miller, S. I. 2005. Salmonellosis. In : Kasper, D.L., Fauci, A. S., Longo, D.L., Braunwald, E., Hauser, S.L., Jameson, J. L. eds. Harrison’s Principles of Internal Medicine. 16th ed. Volume 1. New York: The MacGrawHill Companies, Inc. p. 897-898.
Lengeler, J.W., Drews, G., Schelgel, H.G. 1999. Biology of The Prokaryotes. Carlton: Black Well Science Pty Ltd. P. 343-356, 431-432.
London Research Institute, Clare Hall Laboratories. DNA topoisomerases
http://sci.cancerresearchuk.org/labs/wigley/projects/topoisomerase/topoisome rase.html. 15 Oktober 2007.
36
Universitas Kristen Maranatha Mathews, C.K., et al.1999.Biochemistry 3rd ed.San Fransisco: Adison Wesley
Longman
Parry, Christopher M. Epidemiological and clinical aspects of human typhoid fever.
Renuka, K., Sood, S., Das, B.K., Kapil, A. High Level Ciprofloxacin Resistance
in Salmonella enterica serotyphe Typhi in India.
http://jcm.asm.org/cgi/content/full/36/6/1595, 8 Oktober 2007.
Salyers, A.A., Whitt, D.D.2002. Bacterial Pathogenesis A Molecular Approach 2nd ed.Washington D.C.: ASM Press p.383-385
Todar, K. 2005. Salmonella and Salmonellosis. Todar’s Online Textbook of Bacteriology. University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology.
http://textbookofbacteriology.net/salmonella.html, 15 September 2007.
Turner, Arthur K., Nair, Satheesh., Wain, John. The Acquisition of Full Fluroquinolone Resistance In Salmonella typhi by Accumulationof Point Mutation In The Toposiomerase Target.
http://jac.oxfordjournals.org/cgi/content/full/58/4/733, 15November 2007
Weill, F., et.al. Multidrug Resistance in Salmonella enterica Serotype
Typhimurium from Humans in France (1993 to 2003)
