PROPOSAL
PENELITIAN PROFESSORSHIP UNIVERSITAS LAMPUNG
STUDI KETAHANAN BEBERAPA VERIETAS JAGUNG
TERHADAP HAMA ULAT GRAYAK SPODOPTERA FRUGIPERDA MENGGUNAKAN ANALISIS
SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM GEN RGA
PROGRAM STUDI AGRONOMI
PROGRAM STUDI PROTEKSI TANAMAN FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS LAMPUNG
2021
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI ... 2
RINGKASAN ... 3
BAB 1. PENDAHULUAN ... 3
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Tujuan penelitian ... 2
1.3 Urgensi Penelitian ... 2
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ... 3
2.1 Ulat Grayak Jagung Spodoptera frugiperda dan Dampaknya ... 3
2.2 Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Gen Ketahanan Tanaman ... 4
2.3 Gen ketahanan Jagung terhadap hama Spodoptera frugiperda ... 5
2.4 Road map Penelitian ... 6
BAB III. BAHAN DAN METODE ... 6
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ... 6
3.2 Percobaan 1: Ketahanan/Toleransi terhadap Hama Spodoptera frugiperda dan Produktivitas Varietas ... 6
3.2.1 Pengamatan Intensitas Kerusakan Daun Jagung ... 7
3.2.2 Pengamatan Intensitas Kerusakan Tongkol Jagung ... 8
3.3 Percobaan 2: Analisis Single Nucleotide Polymorphism Gen RGA Varietas Jagung... 10
3.3.1 Ekstraksi DNA ... 10
3.3.2 Analisis Kemurnian dan Kuantifikasi DNA ... 10
3.3.3 Amplifikasi DNA menggunakan alat PCR Sensoquest Sensodirect ... 11
3.3.4 Elektroforesis Hasil PCR menggunakan QiaxCel Advanced ... 11
3.3.5 Sekuensing ... 11
3.3.6 Analisis Data ... 11
3.4 Diagram Alir Penelitian ... 11
3.5 Luaran dan Indikator Capaian ... 12
BAB IV. BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN ... 13
RINGKASAN
Penelitian ini merupakan salah satu respon terhadap masuknya spesies hama baru asal Amerika yang sangat merusak tanaman jagung di Indonesia, yaitu ulat grayak Spodoptera frugiperda. Hama yang masuk ke Indonesia pada tahun 2019 ini, menyebabkan kerusakan yang sangat luas. Provinsi Lampung sebagai salah satu sentra jagung di Indonesia tak luput dari invasi S. frugiperda. Pada enam bulan pertama sejak dilaporkan, S. frugiperda menyebabkan kerusakan areal jagung 14 kali lebih luas daripada ulat grayak Spodoptera litura yang telah lama menjadi hama penting jagung di Indonesia.
Penelitian ini bertujuan untuk memetakan pola single nucleotide polymorphism (SNP) gen RGA dari 8 varietas jagung yang banyak dibudidayakan di Indonesia dikaitkan dengan ketahanan/toleransinya terhadap serangan hama ulat grayak Spodoptera frugiperda. Informasi tentang pola SNP pada tanaman jagung ini sangat penting dalam pengembangan dan perakitan varietas jagung unggul, termasuk yang memiliki ketahanan atau toleransi terhadap hama invasif S. frugiperda. Informasi tersebut juga sangat bermanfaat dalam pemilihan varietas yang lebih tahan atau sekurang-kurangnya mempunyai toleransi yang baik terhadap hama grayak S.
frugiperda. Varietas-varietas yang terpilih selanjutnya dapat dikombinasikan dengan pengendalian secara kimiawi untuk memperoleh pengendalian yang lebih baik.
Penelitian ini terdiri atas dua bagian, yaitu Percobaan 1 (Uji Fenotipik Ketahanan/Toleransi terhadap Hama Spodoptera frugiperda dan Produktivitas Varietas) dan Percobaan 2 (Analisis Single Nucleotide Polymorphism Gen RGA Varietas Jagung). Kedua percobaan ini akan dilaksanakan secara serentak. Adapun varietas jagung yang akan diteliti adalah 8 varietas yang sangat banyak dibudidayakan oleh petani jagung di Indonesia dan di Lampung, yaitu varietas Perkasa Sumo 7328, Pertiwi 5, Pertiwi 6, Bisi 2, Bisi 18, Pioneer 32, Pioneer 36, dan varietas Bima. Tujuh varietas pertama merupakan jagung hibrida, sedangkan varietas terakhir (Bima) adalah jagung non-hibrida.
Uji fenotipik akan dilaksanakan di sentra jagung yang sudah terinvasi oleh hama S.
frugiperda dengan menggunakan rancangan acak kelompok dengan 5 sub-sampel dan 4 kelompok (ulangan) sehingga pada setiap ulangan terdapat 40 unit pengamatan (10 varietas x 5 sub-sampel). Analisis Single Nucleotide Polymorphism Gen RGA Varietas Jagung akan dilakukan dengan cara mengesktrak DNA masing2 varietas dengan menggunakan PCR dengan primer gen RGA. Hasil PCR selanjutnya disekuensing dengan metode Sanger Sequencing dan hasilnya dianalisis secara in silico (dianalisis dengan software Mega X). Hasil analisis SNP ini selanjutnya dibandingkan dan dianalisis berdasarkan fenotipe jagung dari Percobaan 1.
Penelitian ini melengkapi dan mendukung penelitian-penelitian kerjasama antara Fakultas Pertanian Unila dan PT Provivi Indonesia yang diinisiasi oleh Prof. Hamim Sudarsono (Jurusan Proteksi Tanaman) dan telah berlangsung sejak awal 2020. Selain itu, melalui penelitian ini juga diharapkan untuk membantu percepatan kenaikan jenjang akademik menuju profesor bagi ketua tim dan anggotanya, yaitu Dr. Paul Timotiwu dan Dr. Agustiansyah (keduanya dari Jurusan Agronomi) Tak kalah pentingnya, diharapkan kedua orang calon profesor ini akan memiliki keahlian dalam bidang biomolekuler yang relevan untuk pengembangan dan perakitan varietas-varietas unggul jagung di masa mendatang. Penelitian juga akan melibatkan mahasiswa dari Jurusan Agronomi dan Hortikultura yaitu Erlinda Citra Dewi dan Dini Muslimah.
BAB 1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pada bulan Maret 2019 Tim Jurusan Proteksi Tanaman Fakultas Pertanian yang dikoordinir oleh Prof. Hamim Sudarsono berhasil mengidentifikasi dan mengkonfirmasi bahwa spesimen larva ulat grayak yang dikoleksi dari areal pertanaman jagung di Adiluwih, Kabupaten Pringsewu, Provinsi Lampung adalah spesies hama invasif Spodoptera frugiperda. Hasil identifikasi yang dilakukan secara morfologis dan molekuler tersebut juga sekaligus mengkonfirmasi kepastian bahwa hama yang berasal dari Amerika Serikat tersebut telah masuk ke wilayah Lampung (Sudarsono et al., 2019). Semenjak dilaporkan keberadaannya di Lampung dan di Indonesia, hama ulat grayak frugiperda telah menyebabkan kerusakan serius pada tanaman jagung. Kepastian hasil identifikasi ini selanjutnya juga dikonfirmasi melalui penelitian Lestari et al. (2020) yang menyatakan bahwa secara molekuler populasi ulat grayak S. frugiperda yang ditemukan di Lampung sama dengan populasi ulat grayak di negara-negara lain yang telah mengalami ledakan populasi hama tersebut.
Mengingat kerusakan yang ditimbulkan sangat parah, kehadiran ulat grayak frugiperda di Indonesia harus mendapat perhatian serius. Sebagai hama baru di Lampung, serangan S.
frugiperda pada bulan April 2019 pada hamparan pertanaman jagung yang disampling di Kecamatan Adiluwih, Pringsewu dilaporkan mencapai 72% (Sudarsono et al., 2019). Apabila dibandingkan dengan serangan hama grayak Spodoptera litura yang telah lama menjadi hama jagung di Indonesia, serangan grayak frugiperda terbukti jauh lebih berat. Data dari Balai Proteksi Tanaman Pangan Provinsi Lampung menunjukkan bahwa luas serangan ulat grayak frugiperda selama bulan Januari hingga Juni 2019 mencapai 1.337 ha, sementara luas serangan ulat grayak S. litura hanya 93 ha. Dengan kata lain, serangan hama invansif tersebut 14 kali lipat lebih luas daripada luas serangan hama ulat grayak konvensional Spodoptera litura (Sudarsono, 2019).
Salah satu upaya untuk mengatasi serangan hama invasif S. frugiperda pada pertanaman jagung adalah menggunakan varietas-varietas jagung yang mempunyai ketahanan atau menunjukkan toleransi yang baik terhadap serangan hama tersebut. Oleh karena itu, perlu dilakukan seleksi dari berbagai jenis varietas jagung yang ditanam di Indonesia untuk memperoleh varietas yang lebih tahan atau sekurang-kurangnya mempunyai toleransi yang baik terhadap hama grayak S. frugiperda. Meskipun tidak bersifat resisten atau tahan, tanaman jagung
yang toleran terhadap s. frugiperda diharapkan akan mampu berproduksi secara menguntungkan meskipun mengalami serangan. Varietas-varietas yang terpilih selanjutnya dapat dikombinasikan dengan pengendalian secara kimiawi untuk memperoleh pengendalian yang lebih baik.
Pada saat ini varietas jagung yang banyak dibudidayakan di Indonesia sekurang- kurangnya ada 7 varietas hibrida yang banyak ditanam petani, antara lain varietas Perkasa Sumo 7328 (produksi PT Sygenta), Pertiwi 5 dan Pertiwi 6 (produksi PT Benih Pertiwi), Bisi 2 dan Bisi 18 (produksi PT Bisi), P32 dan P36 (produksi PT Pioneer). Selain itu juga ada jagung varietas non-hibrida yang banyak dibudidayakan oleh petani, yaitu varietas Bima. Dengan mengganasnya hama ulat grayak S. frugiperda, ketahanan dan toleransi dari delapan varietas jagung yang banyak dibudidayakan tersebut perlu dievaluasi dan dibandingkan. Ketahanan dan toleransi tanaman terhadap hama secara umum dipengaruhi oleh ekspresi gen-gen ketahanan yang dimiliki oleh tanaman (Yulong et al., 2006). Salah satu gen ketahanan yang penting adalah resistance gen analogue (RGA) (Yaish et al., 2004) yang di dalamnya terdapat single nucleotide polymorphism atau SNP (polimorfisme nukleotida pada satu situs nukleotida tertentu). Dengan mempelajari dan membandingkan pola/urutan basa di dalam SNP gen RGA masing-masing varietas jagung maka dapat diketahui hubungan antara pola SNP dan ketahanannya terhadap serangan S. frugiperda.
Informasi tentang pola SNP dan kinerja ketahanan jagung terhadap serangan hama S.
frugiperda merupakan informasi yang penting dalam pengembangan dan perakitan varietas- varietas jagung yang tahan terhadap hama S. frugiperda.
1.2 Tujuan penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk memetakan pola single nucleotide polymorphism (SNP) gen RGA delapan varietas jagung yang banyak dibudidayakan di Indonesia dikaitkan dengan ketahanan/toleransinya terhadap serangan hama ulat grayak Spodoptera frugiperda.
1.3 Urgensi Penelitian
Hingga pada saat ini belum tersedia informasi tentang bagaimana pola SNP varietas-varietas jagung di Indonesia. Sementara itu, pemilihan varietas-varietas unggul tanaman jagung, termasuk ketahanannya terhadap hama, pada umumnya dilakukan melalui pengamatan secara fenotipik/agronomis dengan membandingkan tingkat kerusakan tanaman. Meskipun dapat menentukan varietas-varietas yang tahan atau unggul, metode ini tidak memberikan informasi genetik yang berkaitan dengan sifat ketahanan/keunggulan varietas tersebut. Sebagaimana diketahui, pola single nucleotide polymorphism (SNP) dapat dimanfaatkan untuk rekayasa dan
perakitan varietas-varietas unggul tanaman jagung. Informasi pola SNP juga sangat penting dalam mempelajari ketahanan varietas tanaman jagung terhadap hama, termasuk hama S.
frugiperda.
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Ulat Grayak Jagung Spodoptera frugiperda dan Dampaknya
Ulat grayak Spodoptera frugiperda (dalam bahasa Inggris disebut fall army worm, disingkat FAW) berasal dari benua Amerika dan ditemukan di belahan barat benua dari Amerika Serikat hingga Argentina. Hama ini terdapat di hampir semua negara bagian di timur Pegunungan Rocky (Capinera, 2017). Ulat grayak S. frugiperda memakan lebih dari 80 spesies tanaman, termasuk jagung, padi, sorgum, dan tebu, tetapi juga memakan tanaman-tanaman sayuran dan kapas. Larva S. frugiperda memiliki nafsu makan yang rakus, serta dapat berkembang biak dan menyebar dengan cepat apabila berada dalam kondisi lingkungan yang tepat (Abrahams et al., 2017).
Karena kerusakan yang ditimbulkan sangat parah, selama bertahun-tahun berbagai negara mengawasi hama ini dengan ketat agar tidak menyebar. Hama S. frugiperda pertama kali dilaporkan keberadannya di Benua Afrika pada tahun 2016, yaitu di Nigeria, Sao Tomé, Benin dan Togo (IPPC, 2016). Pada tahun 2018 hama tersebut dikonfirmasi berada di lebih dari 30 negara Afrika (CABI, 2018). Selanjutnya, S. frugiperda dilaporkan di India dan Thailand.
Berbagai laporan yang diterbitkan pada tahun 2019 memastikan bahwa serangga tersebut juga ditemukan di Bangladesh, China, Myanmar, dan Sri Lanka.
Pada tahun 2019, Spodoptera frugiperda ditengarai sudah masuk ke Indonesia. Pada bulan Maret 2019, Tim Jurusan Proteksi Tanaman Fakultas Pertanian yang dikoordinir oleh Prof.
Hamim Sudarsono berhasil mengidentifikasi dan mengkonfirmasi bahwa spesimen larva ulat grayak yang dikoleksi dari areal pertanaman jagung di Kecamatan Adiluwih, Kabupaten Pringsewu, Provinsi Lampung adalah spesies hama ulat grayak invasif Spodoptera frugiperda.
Secara hampir bersamaan, keberadaan hama ulat grayak jagung dilaporkan di wilayah-wilayah lain di Indonesia (Sudarsono et al., 2019). Semenjak dilaporkan keberadaannya di Lampung dan di Indonesia, hama ulat grayak frugiperda telah menyebabkan kerusakan serius pada tanaman jagung. Kepastian hasil identifikasi ini selanjutnya juga dikonfirmasi melalui penelitian Lestari et al. (2020) yang menyatakan bahwa secara molekuler populasi ulat grayak S. frugiperda yang ditemukan di Lampung sama dengan populasi ulat grayak di negara-negara lain yang telah mengalami ledakan populasi hama tersebut.
2.2 Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Gen Ketahanan Tanaman
Single Nucleotide Polymorphism (SNP) adalah polimorfisme nukleotida pada satu situs nukleotida tertentu di dalam genom tanaman. Frekuensi penemuan SNP bervariasi, bergantung kepada tanamannya. Polimorfisme satu nukleotida ditemukan sangat banyak, sehingga berpotensi sebagai marka yang tersebar di semua bagian genom tanaman. Marka molekuler berbasis SNP telah digunakan untuk studi genotip, pembuatan peta tautan genetik beresolusi tinggi, identifikasi varietas, dan seleksi untuk karakter tertentu dalam proses pemuliaan tanaman (Gupta et. al. 2001). Pada tanaman jagung ditemukan 1 SNP per 31 pasang basa (pb) di bagian non-coding region dan 1 SNP per 124 pb di bagian coding region (Ching et al. 2002).
Metode identifikasi SNP yang masih sering digunakan untuk skala kecil ialah cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS), derived CAPS (dCAPS) dan allel specific-PCR (AS- PCR) atau single nucleotide amplified polymorphism (SNAP) (Drenkard et al. 2000, Liu et al.
2012). Dalam aplikasinya marka CAPS dan dCAPS mempunyai keterbatasan yaitu memerlukan enzim nuclease, sehingga memerlukan biaya yang relatif tinggi, sedangkan marka AS-PCR atau SNAP hanya memerlukan pasangan primer dan teknik PCR dan elektroforesis gel agarose baku (Drenkard et al. 2000). Marka SNAP telah dikembangkan untuk marka yang berhubungan dengan karakter aroma dan supernodulasi pada tanaman kedelai (Kim et al. 2005, Juwattanasomran et al. 2011), sehingga proses seleksi yang berhubungan dengan kedua karakter tersebut bisa lebih cepat dan efisien. Penelitian Sutanto dkk (2013) telah berhasil mengembangkan penanda genetik yang berasal dari perbedaan 1 basa atau Single Nucleotide Polymorphism (SNP) dari fragmen RGA pisang berbasis PCR DNA genom. Selanjutnya, sepuluh pasang primer penanda SNP fragmen RGA yang ditemukannya berpotensi untuk digunakan sebagai marka ketahanan terhadap penyakit pada tanaman pisang secara umum.
Pasangan primer yang digunakan adalah SNP1_MNBS_Ref, SNP1_MNBS_Alt, SNP2_MNBS_Ref, SNP2_MNBS_Alt, SNP4_MNBS_Ref, SNP4_MNBS_Alt, SNP5_MNBS_Ref, SNP5_MNBS_Alt, SNP6_MNBS_Ref, dan SNP6_MNBS_Alt.
Sebagaimana telah diketahui bersama, kode genetik bersifat universal untuk semua organisme (Campbell dan Reece. 2010). Hal itu berarti bahwa kodon yang sama pada organisme yang berbeda umumya di terjemahkan ke dalam asam amino yang sama. Dengan kata lain, fragmen gen tertentu dari suatu organisme bisa ditemukan pada gen yang sama pada organisme yang berbeda. Semakin dekat kekerabatan/takson kedua organisme tersebut, semakin banyak kemiripan sekuen gennya.
2.3 Gen ketahanan Jagung terhadap hama Spodoptera frugiperda
Secara alami respon tanaman terhadap serangan hama maupun penyakit dikendalikan oleh kelompok gen ketahanan (Resistance gene atau R gen) dan gen respons pertahanan (Defense Response gene) (Yulong et al. 2006). Fragmen gen ketahanan (R gene) yang ada dalam genom suatu tanaman dapat diamplifikasi dan diisolasi menggunakan degenerate primer yang dirancang berdasarkan runutan DNA (DNA sequence) gen R asal tanaman lain, yang dikenal dengan istilah resistance gene analogue (RGA) (Yaish et al. 2004). Dewasa ini telah dikembangkan marka SNAP untuk melihat variasi genetik pada sekuen gen RGA (Sutanto dkk, 2013). Metode tersebut berhasil mengembangkan sepuluh pasang primer SNAP yang berpotensi untuk digunakan sebagai marka ketahanan tanaman.
Sejumlah gen yang tergolong ke dalam kelompok gen ketahanan (R gene) telah berhasil diisolasi dan dikarakterisasi dari berbagai tanaman, antara lain gen RPS2 asal Arabidopsis thaliana (Bent et al.1984) dan gen Xa1 asal padi (Yoshimura et al. 1998). Beberapa dari gen ketahanan tersebut telah dikloning dan dievaluasi fungsinya pada tanaman rentan untuk meningkatkan ketahanan terhadap penyakit tertentu (Agrios. 2005). Secara struktural, berbagai gen yang tergolong ke dalam kelompok R gene mempunyai ciri khusus, yaitu mempunyai domain polipeptida NBS-LRR (nucleic binding sites-leucine rich repeats) dan STK (serine threonine protein kinase) (McDowell & Woffenden 2003, Jones 2001). Dari contoh R gene yang berhasil diisolasi, sebanyak 71% mempunyai domain polipeptida NBS yang berperan dalam pengenalan produk gen Avr asal patogen (Dilbirligi et al. 2004). Hasil proses pengenalan produk gen Avr oleh gen R dapat memicu respons pertahanan dari tanaman (Meyers et al. 2003).
Fragmen gen ketahanan (R gene) yang ada dalam genom suatu tanaman dapat diamplifikasi dan diisolasi menggunakan degenerate primer yang didisain berdasarkan runutan DNA (DNA sequence) dari gen R asal tanaman lain, yang dikenal dengan istilah resistance gene analogue (RGA) (Yaish et al. 2004). Sun et al. (2009) berhasil mengisolasi lima fragmen RGA yang berasal dari pisang hibrida Gold Finger, sedangkan Pei et al. (2007) mengisolasi fragmen 12 RGA dari beberapa kultivar dan spesies pisang liar asal Cina. Sutanto dkk (2013) telah menggunakan fragmen RGA sebagai basis pengembangan marka molekuler untuk ketahanan penyakit pada pisang.
2.4 Road map Penelitian
BAB III. BAHAN DAN METODE
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan di sentra pertanaman jagung di Kecamatan Adiluwih, Kabupaten Pringsewu dan di Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi (LTSIT) Unila, dari bulan Mei sampai dengan Oktober 2021.`
3.2 Percobaan 1: Ketahanan/Toleransi terhadap Hama Spodoptera frugiperda dan Produktivitas Varietas
2019-2020
Identifikasi dan konfirmasi S.
frugiperda di Lampung Survei kerusakan jagung akibat S. Frugiperda
(Tim HPT/Prof. HS)
2021
Studi fenotipik ketahanan/toleran 8 varietas Jagung terhadap S.
frugiperda
Analisis kandidat gen ketahanan tanaman terhadap S.
frugiperda
Pengemba ngan dan Perakitan Varietas unggul Jagung baru
Pada bagian ini, 8 varietas jagung ditanam pada lahan jagung di Desa Tritunggal Mulya, Kecamatan Adiluwih. Lokasi ini dipilih karena sejak 2019 ditemukan populasi hama ulat grayak S. frugiperda dan semenjak itu menjadi lokasi penelitian jagung tim Fakultas Pertanian. Varietas jagung yang akan diuji adalah: Perkasa Sumo 7328, Pertiwi 5, Pertiwi 6, Bisi 18, Symental, P32, P36, Paragon dan Bisma. Delapan varietas jagung ini dipilih karena banyak dibudidayakan oleh petani di Lampung.
Untuk memberikan kesempatan yang sama dalam memperoleh serangan dari hama ulat grayak S. frugiperda, seluruh varietas yang diuji akan ditanam pada lahan berukuran 2100 m2 (ukuran 70 x 30 m). Tanaman jagung ditanam dengan jarak tanam 70 cm x 30 dengan jarak antarbaris 70 cm. Setiap varietas ditanam dalam satu baris yang sama sehingga barisan tanaman dalam hamparan percobaan akan berselang-seling terdiri atas 8 varietas yang diuji. Penempatan baris tanaman pada hamparan dilakukan secara acak. Selanjutnya dari setiap varietas akan diambil sampel sebanyak 5 tanaman yang berada dalam masing-masing baris varietas. Dari sampel ini akan diamati: (1) intensitas kerusakan tanaman jagung dan (2) variable-variabel produksi tanaman yang terdiri atas: (a) tinggi tanaman, (b) bobot kering dan basah brankasan tanaman, (c) produksi pipilan kering basah dan kering.
3.2.1 Pengamatan Intensitas Kerusakan Daun Jagung
Pengamatan intensitas kerusakan jagung akibat serangan hama ngulat grayak S.
frugiperda akan dilakukan terhadap daun dan tongkol buah jagung. Kerusakan daun diamati dengan menggunakan skala Davis et al. (1992) yang terdiri atas 9 skala (Tabel 1; Gambar 1).
Tabel 1. Skor penilaian kerusakan daun akibat serangan FAW pada jagung
No Gejala/deskripsi kerusakan Respons
1 Tidak terlihat kerusakan pada daun Sangat tahan
2 Beberapa lubang kecil 1-2 pada daun yang lebih tua Tahan 3 Beberapa kerusakan lubang kecil pada daun (<5) Tahan 4 Beberapa kerusakan pada daun (6-8) lubang kecil, lesi melingkar
kecil, dan beberapa lesi kecil memanjang (berbentuk persegi panjang) dengan panjang 1,3 cm pada daun yang menggulung.
Agak Tahan
5 Lesi memanjang (> 2,5 cm) pada daun (8-10), beberapa berukuran kecil hingga menengah berbentuk tidak teratur yang dimakan dari daun yang menggulung.
Agak Tahan
6 Beberapa lesi memanjang besar pada beberapa helai daun dan beberapa besar berbentuk tidak teratur yang dimakan dari helai daun yang menggulung
Rentan
7 Banyak lesi memanjang dari semua ukuran terdapat pada beberapa helai dan beberapa besar berbentuk tidak teratur
Rentan 8 Banyak lesi memanjang dari semua ukuran terdapat pada sebagian
besar daun kelopak dan berukuran sedang hingga besar berbentuk tidak teratur, lubang muncul dari daun menggulung yang dimakan
Sangat rentan
9 Batang dan daun hampir hancur total dan sekarat akibat kerusakan daun yang luas
Sangat rentan
Gambar 1. Skor tanaman jagung berdasarkan kerusakan daun oleh FAW.
3.2.2 Pengamatan Intensitas Kerusakan Tongkol Jagung
Kerusakan tongkol jagung dilakukan dengan menentukan skor kerusakan kernel
berdasarkan prosedur CIMMYT (2018) menggunakan 9 skala sebagai berikut:
Gambar 2. Skor tanaman jagung berdasarkan kerusakan kernel oleh S. frugiperda.
Tabel 2. Skor penilaian kerusakan kernel akibat serangan S. frugiperda pada jagung
No Gejala/deskripsi kerusakan Respons
1 Tidak terlihat kerusakan pada kernel Sangat tahan
2 Kerusakan pada beberapa kernel (<5) atau kurang dari 5%
kerusakan pada kernel
Tahan 3 Kerusakan pada beberapa kernel (6-15) atau kurang dari 10% Tahan 4 Kerusakan pada kernel 16-30 kernel atau kurang dari 15% Agak Tahan 5 Kerusakan pada kernel 31-50 atau kurang dari 25% Agak Tahan 6 Kerusakan pada 51-75 kernel atau lebih. dari 35% tetapi kurang
dari 50%
Rentan 7 Kerusakan pada kernel 76-100 atau lebih dari 50% tetapi
kerusakan kurang dari 60%
Rentan 8 Kerusakan pada kernel > 100 atau lebih dari 60% tetapi kurang
dari 100 %
Sangat rentan
9 Hampir 100% kerusakan pada kernel Sangat rentan
Sumber: CIMMYT (2018).
3.2.3 Rancangan dan Analisis Data
Uji fenotipik akan dilaksanakan dengan menggunakan rancangan acak kelompok dengan 5 sub- sampel dan 4 kelompok (ulangan) sehingga pada setiap ulangan terdapat 40 unit pengamatan (10 varietas x 5 sub-sampel). Setiap kelompok berada dalam lahan berukuran 70 x 30 m. Data hasil pengamatan akan dianalisis dan divisualisasikan dengan menggunakan aplikasi R- Statistics.
3.3 Percobaan 2: Analisis Single Nucleotide Polymorphism Gen RGA Varietas Jagung Percobaan 2 akan dilaksanakan di UPT Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi (LTSIT) Universitas Lampung. Alat yang digunakan adalah Dneasy Plan Mini Kit (50) (Qiagen, Cat#69104), Nanophotometer P 360 (Implen), QIAxcel Advanced, mortar, tabung berbagai ukuran, vortex, heating block suhu 650C, microsentrifuge, life taouch 1.7 ml microcentrifuge tube, mikro pipet berbagai ukuran, Bioclean Aeroosol Resistent Barier Tip, shaker, disposable free powder gloves.
3.3.1 Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA genom sampel berasal dari jaringan daun muda beberapa varietas jagung dilakukan menggunakan Dneasy Plan Mini Kit (50) (Qiagen, Cat#69104). Sampel daun beberapa varietas jagung segar sebanyak 100 mg diberi 400 µL AP1, 4 µL Rnase A stock solution 100 mg/mL, kemudian digerus dengan mortar dan penumbuk steril sampai halus.
Campuran dipindahkan ke dalam microtube 1,5 mL untuk selanjutnya diinkubasi dalam heating block 65oC selama 10 menit. Tabung dibolak-balik 2-3 kali selama inkubasi. Ditambahkan 130 µL Buffer P3 dan diinkubasikan selama 5 menit di atas es. Lisat disentrifugasikan selama 5 menit pada 20.000 x g. Lisat dipindahkan ke dalam kolom QIAshredder yang ditempatkan dalam tabung koleksi 2 ml. Disentrifugasikan selama 2 menit pada 20.000 x g. Cairan dipindahkan ke dalam tabung baru tanpa mengganggu pelet. Ditambahkan 1,5 volume Buffer AW1, dihomogenkankan dengan pemipetan. Sebanyak 650 µL campuran dipindahkan ke spin kolom DNeasy Mini yang ditempatkan dalam tabung koleksi 2 ml. Disentrifugasikan selama 1 menit pada 6000 x g. Cairan dibuang. Spin kolom ditaruh ke tabung koleksi 2 ml yang baru.
Ditambahkan 500 µL Buffer AW2, disentrifugasikan selama 1 menit pada 6000 x g. Cairan dibuang. Ditambahkan 500 µL Buffer AW2. Disentrifugasikan selama 2 menit pada 20.000 x g.
Spin kolom dipindahkan ke tabung 1,5 ml atau 2 ml yang baru. Ditambahkan 100 µL Buffer AE untuk elusi. Diinkubasikan selama 5 menit pada suhu ruang. Disentrifugasikan selama 1 menit pada 6000 x g. Ekstrak DNA disimpan di freezer dengan suhu -20oC.
3.3.2 Analisis Kemurnian dan Kuantifikasi DNA
Analisis dilakukan menggunakan alat Nanophotometer P360 buatan Implen, Jerman.
Sebelum diukur, sampel dihomogenkan dengan vortex. Sampel diambil dengan pipet dan diteteskan ditengah jendella cell pengukur. Submicroliter cell yang berisi sampel ditutup dengan rapat. Tombol Ok ditekan untuk mengaktifkan mesin dan tombol blank ditekan untuk referensi pengukuran. Tombol ! ditekan untuk mengukur sampel. Jika satu sampel telah selesai maka untuk pengukuran sampel berikutnya lid dan submicroliter dibersihkan terlebih dahulu dengan tisu yang dibasahi akuades.
3.3.3 Amplifikasi DNA menggunakan alat PCR Sensoquest Sensodirect
Terlebih dahulu dibuat campuran pereaksi PCR. Reaksi PCR dilakukan dengan volume total 25 µL menggunakan KAPA2GTM PCR Kit. Komposisinya yaitu 5,0 µL 5 X buffer PCR; 0,5 µL 25 mM MgCl2; 0,5 µL 10 mM dNTPs; 1,0 µL 10µM masing-masing primer (primer forward dan reverse); 2,5 µL DNA genom (± 30 ng/ µL); 0,1 µL Taq DNA polimerase (5 U/ µL) dan 15,4 µL ddH2O. Pengaturan alat PCR dilaksanakan sesuai Sutanto et al (2013). Denaturasi awal dilakukan pada suhu 95°C selama 3 menit yang kemudian diikuti dengan 35 kali siklus 95°C selama 10 detik, 60–62°C selama 10 detik, dan 72°C selama 3 detik. Setelah siklus selesai, diakhiri dengan 1 siklus 72°C selama 10 menit.
3.3.4 Elektroforesis Hasil PCR menggunakan QiaxCel Advanced
Semua sampel hasil PCR dielektoforesis dengan alat elektroforesis digital QiaxCel Advanced dari Qiagen, Jerman menggunakan DNA HIGH RESOLUTION KIT. Prosedurnya mengikuti manual QiaxCel Advanced dari Qiagen, Jerman.
3.3.5 Sekuensing
Hasil PCR kemudian dilakukan sekuensing dengan metode Sanger menggunakan jasa sekuensing dari PT. Bioneer Indonesia.
3.3.6 Analisis Data
Data hasil sekuensing dianalisis kesejajarannya dengan sekuen RGA pisang yang telah terdeposit di Genebank (kode akses KF034945 s.d. KF034953) menggunakan perangkat lunak Bioedit. Diamati perbedaan basa nitrogen di tiap – tiap SNP.
3.4 Diagram Alir Penelitian
Penelitian ini akan dilakukan oleh kelompok dengan bidang keahlian yang mendukung yaitu bidang keahlian Hama Tanaman, Fisiologi dan Teknologi Benih dan Biologi Molekuler sebagai keahlian utama sesuai dengan judul penelitian ini. Kegiatan penelitian lapangan (untuk evaluasi fenotipik 8 varietas jagung) dan penelitian biomolekuler di laboratorium akan dilaksanakan secara simultan (bersamaan). Dari penelitian ini diharapkan akan diperoleh data komprehensif berupa informasi fenotipik ketahanan 8 varietas jagung terhadap hama S.
frugiperda beserta informasi biomolekulernya (pola SNP) yang sangat penting dalam pengembangan dan perakitan varietas unggul tanaman jagung.
3.5 Luaran dan Indikator Capaian Studi Fenotipik 8 Varietas
Jagung
(Ketahanan/Toleransi 8 Vareitas Jagung terhadap
Hama S. frugiperda
Studi Analisis SNP Gen RGA 8 Varietas Jagung
Analisa data, penulisan laporan, draft naskah jurnal terindeks SCOPUS
Survei dan pemetaan sentra produksi Jagung di Provinsi Lampung dan Serangan S. frugiperda
(2019 oleh Tim HPT)
Pengamatan intensitas serangan hama S. frugiperda dan
Analisis SNP gen RGA,
Luaran dan indicator capaian hasil penelitian ini tercantum pada table di bawah ini
BAB IV. BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN
4.1 Rencana Anggaran Biaya
No .
Spesifikasi Volume Satuan Juml
ah (Volu
me x Satua n)
Biaya per
Volume (Rp.)
Jumlah Biaya (Jumlah x Biaya per Volume) (Rp.)
1 Silika gel biru 1 Kg 1 Rp100.000,00 Rp100.000,00
2 Alkohol 70% teknis 2 Liter 2 Rp75.000,00 Rp150.000,00
3 Nitrogen cair tabung 20 liter 1 Tabung 1 Rp300.000,00 Rp300.000,00 4 Dneasy Plan Mini Kit (50)
(Qiagen, Cat#69104)
1 Paket 1 Rp6.500.000,00 Rp6.500.000,00
5 10 pasangan primer 10 pasangan
primer
10 Rp500.000,00 Rp5.000.000,00
6 DNAse-free RNAse-free Microtube 1,5 ml (500 tubes) Cat No. AM12400
1 Pak 1 Rp1.000.000,00 Rp1.000.000,00
7 DNAse-free RNAse-free Microtube 0,2 ml (1000 tubes)
1 Pak 1 Rp1.500.000,00 Rp1.500.000,00
8 Mikrotip 1000 µL 500 tip 1 Pak 1 Rp150.000,00 Rp150.000,00 9 Mikrotip 200 µL 1000 tip 1 Pak 1 Rp150.000,00 Rp150.000,00 10 Mikrotip 10 µL 1000 tip 1 Pak 1 Rp1.200.000,00 Rp1.200.000,00 11 QX DNA Alignment Marker
15 bp/3 kb 1,5 mL
1 Paket 1 Rp5.000.000,00 Rp5.000.000,00
12 QX DNA Size Marker 100bp - 2.5kb 50 µl Cat. No. 929559
1 Paket 1 Rp4.000.000,00 Rp4.000.000,00
13 Sekuensing hasil PCR 10 Paket 10 Rp500.000,00 Rp5.000.000,00
14 Benih jagung hibrida 7 kg 7 Rp100.000,00 Rp700.000,00
15 Benih Jagung Manis 2 kg 2 Rp200.000,00 Rp400.000,00
16 Benih jagung non hibrida 2 kg 2 Rp50.000,00 Rp100.000,00
17 Insektisida 5 jenis 5 Rp100.000,00 Rp500.000,00
18 Sewa lahan 1 paket 1 Rp2.000.000,00 Rp2.000.000,00
19 Pengolahan lahan 1 paket 1 Rp1.000.000,00 Rp1.000.000,00 20 Pemeliharaan tanaman 3 bulan 3 Rp750.000,00 Rp2.250.000,00 21 Transportasi 10 perjalnan 10 Rp750.000,00 Rp7.500.000,00
22 Alat tulis kantor 1 paket 1 Rp500.000,00 Rp500.000,00
23 Publikasi 1 jur 1 Rp5.000.000,00 Rp5.000.000,00
Total Rp50.000.000
4.2 Jadwal Kegiatan
No
Nama Kegiatan Bulan Ke
I II III IV V
Minggu ke 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 Peninjauan lokasi x x
2 Pengolahan lahan dan ploting penelitian
x x
3 Penanaman dan aplikasi benih di lapang
x
4 Pengamatan x x x x x x x
5 Pemeliharaan x x x x x x x x
6 Pengamatan Hama x x x x x x x x x x x x x x x x 7 Analisa Biomolekuler x x x x x x x x x x x x x x x x
8 Pembuatan Laporan x x x x
DAFTAR PUSTAKA
Abrahams P, Beale T, Cock M, Corniani N, Day R, Godwin J, Murphy S, Richards G, Vos J.
2017. Fall Armyworm Status Impacts and Control Options in Africa: Preliminary Evidence Note (April 2017).
Agrios, G. N. 2005. Plant Pathology. Fifth Edition. USA : Elsevier Academic Press. 922 p.
Bent, A., Kunkel, B., Dahlbeck, D., Brown, K., Schmidt, R., Giraudat, J., Staskawicz, B. 1994.
RPS2 of Arabidopsis thaliana: A Leucine-Rich Repeat Class of Plant Disease Resistance Genes. Science, 265(5180), 1856-1860.
CABI. 2018. CABI Invasive Species Compendium: Spodoptera frugiperda (fall armyworm).
Spodoptera frugiperda
Campbell, N. A. & J. B. Reece. (2010). 3. Biologi, Edisi Kedelapan Jilid 1. Terjemahan:
Damaring Tyas Wulandari. Jakarta: Erlangga.
Capinera JL. 2017. Fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith). University of Florida - Institute of Food and Agricultural Sciences
Ching, A., Caldwell, K. S., Jung, M., Dolan, M., Smith, O. S., Tingey, S., Morgante, M., &
Rafalski, A. 2002. SNP frequency, haplotype structure and linkage disequilibrium in elite maize inbred lines.BMC genetics, 3, 19. https://doi.org/10.1186/1471-2156-3-19.
Dilbirligi, M., Erayman, M., Sandhu, D., Sidhu, D., and Gill, K.S. 2004. Identification of wheat chromosomal regions containing expressed resistance genes. Genetics, 166: 461–
481.
Drenkard, E., Richter, B. G., Rozen, S., Stutius, L. M., Angell, N. A., Mindrinos, M., Cho, R. J., Oefner, J., Davis, R. W., & Ausubel, F. M. (2000). A simple procedure for the analysis of single nucleotide polymorphisms facilitates map-based cloning in Arabidopsis. Plant physiology, 124(4), 1483–1492.
Gupta, PK, Roy, JK & Prasad, M 2001, ‘Single nucleotide polymorphisms: a new paradigm for molecular marker technology and DNA polymorphism detection with emphasis on their use in plants, Current Sci., vol. 80, pp. 524-35.
IPPC. 2016. Les dégâts causés par spodoptera frugiperda. (The damage caused by Spodoptera frugiperda.) IPPC Official Pest Report. Rome, Italy: FAO. https://www.ippc.int/.
Jones J. D. (2001). Putting knowledge of plant disease resistance genes to work. Current opinion in plant biology, 4(4), 281–287. https://doi.org/10.1016/s1369-5266(00)00174-6.
Juwattanasomran, R., Somta, P., Chankaew, S., Shimizu, T., Wongpornchai, S., Kaga, A., &
Srinives, P. . A SNP in GmBADH2 gene associates with fragrance in vegetable soybean variety "Kaori" and SNAP marker development for the fragrance. TAG. Theoretical and applied genetics. Theoretische und Angewandte Genetik, 122(3), 533–541.
Keller, B., Feuiller, C., Messmer, M. 2000. Genetic of disease resistance: basic concept and application in resistance breeding. in Slusarenko, A., Fraser, R.S.S., van-Loon, L.C.
(eds.).
Kim, M.Y., Van, K., Lestari, P. et al. 2005. SNP identification and SNAP marker development for a GmNARK gene controlling supernodulation in soybean. Theor Appl Genet 110, 1003–1010.
Liu, J., Huang, S., Sun, M., Liu, S., Liu, Y., Wang, W., Zhang, X., Wang, H., & Hua, W. (2012).
An improved allele-specific PCR primer design method for SNP marker analysis and its application. Plant methods, 8(1), 34. Mechanism of resistance to plant disease. Kluwer Academic Publisher. Netherland. pp. 101-60.
Lestari P, Budiarti A, Fitriana Y, Susilo F, Swibawa IG, Sudarsono H, Suharjo R, Hariri AM, Purnomo, Nuryasin, Solikhin, Wibowo L, Jumari, Hartaman M. 2020. Identification and genetic diversity of spodoptera frugiperda in Lampung province, Indonesia. Biodiversitas 21: 1670–1677. DOI: 10.13057/biodiv/d210448
Sudarsono H. 2019. Ulat Grayak Spodoptera frugiperda: Kondisi Terkini dan Analisis Dampaknya. Diskusi Roundtale CIPS Indonesia, 17 Juli 2019. Bandar Lampung
Sudarsono H, Susilo FX, Lestari P, Suharjo R, Swibawa IG, Hariri AM. 2019. Identification of Spodoptera Specimens Collected on Corn Field in Pringsewu District, Lampung Province.
Laporan Kerjsama dengan PT Syngenta. Bandar Lampung
McDowell JM, Woffenden BJ (2003). Plant disease resistance genes: recent insights and potential applications. Trends Biotech 21:178–183.
Meyers BC, Kozik A, Griego A, Kuang H, Michelmore RW (2003) Genome-wide analysis of NBS-LRR-encoding genes in Arabidopsis. Plant Cell 15:809–834.
Pei, X. Shengjun Li, Ying Jiang, Yongqiang Zhang, Zhixing Wang, Shirong Jia. 2007. Isolation, characterization and phylogenetic analysis of the resistance gene analogues (RGAs) in banana (Musa spp.). Plant Science. Vol. 172 (6): 1166-1174.
Sun et al., 2009, Cloning and Analysis of Fusarium Wilt Resistance Gene Analogs in Goldfinger’
Banana, Molecular Plant Breeding, 7(6): 1215-1222.
Sutanto, A, Hermanto, C. Sukma, D., Sudarsono. 2013. Pengembangan marka SNAP berbasis resistance gene analogue pada tanaman pisang (Musa spp.). J. Hort. 23(4):300-309.
Yoshimura, S., Yamanouchi, U., Katayose, Y., Toki, S., Wang, Z. X., Kono, I., Kurata, N., Yano, M., Iwata, N., & Sasaki, T. 1998. Expression of Xa1, a bacterial blight-resistance gene in rice, is induced by bacterial inoculation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95(4), 1663–1668.
Yaish, M. W. F., Sáenz De Miera, L. E., & Pérez De La Vega, M. 2004. Isolation of a family of resistance gene analogue sequences of the nucleotide binding site (NBS) type from Lens species. Genome, 47(4), 650-659.
Yulong, G., Wangchen, G., Lei, W., Tanchen, Z. 2006. Isolation and characterization of resistance and defense gene analogs in cotton (Gossypium barbadense L.)Sci. China Ser.
C; Life.Sci. (49) 6:530-542.
