STATUS METILASI GEN BRCA1 GEN BRCA2
EKSPRESI PROTEIN BRCA1 PROTEIN BRCA2
HUBUNGANNYA DENGAN TERJADINYA TUMOR EPITELIAL
OVARIUM DERAJAD DIFERENSIASI JENIS HISTOPATOLOGI
STADIUM DAN SURVIVAL PENDERITA KANKER
EPITELIAL OVARIUM
Heru Pradjatmo
NIM: 06/09-I/2716/PS
Program Pasca Sarjana
Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada
2012
R I N G K AS A N
Kanker ovarium tidak mempunyai gejala klinis awal yang jelas sehingga sulit dapat dideteksi secara dini. Dilain pihak kemampuan hidup lima tahun dapat mencapai lebih dari 90% jika penyakit masih stadium awal, sayangnya hanya 25% kanker ovarium dapat didiagnosis pada stadium awal. Adanya hubungan antara kemampuan hidup lima tahun dengan stadium penyakit saat didiagnosis, menunjukkan bahwa dengan deteksi awal akan meningkatkan kemampuan hidup penderita. Teknologi baru untuk deteksi stadium awal kanker ovarium sangat diperlukan. Aplikasi teknologi baru untuk deteksi kanker ovarium akan dapat besar pengaruhnya terhadap kesehatan masarakat, tetapi untuk mencapai tujuan ini diperlukan suatu penanda molekuler yang sensitif dan spesifik.
Kombinasi yang berbeda dari perubahan genetik didapatkan dalam genome pada lebih dari 100 macam tipe kanker pada manusia. Dengan demikian masing-masing kanker mungkin unik dan spektrum dari perubahan genetik yang mengawali terjadinya kanker mungkin sangat banyak sekali variasinya. Tidak ada satu aturanpun yang mendasari terjadinya semua kanker dan kanker adalah phenomenology dari kompleksitas yang tak terbatas. Hahn dan Weinberg (2002) membuat alternatif pandangan bahwa patogenesis kanker pada manusia diatur oleh sejumlah aturan-aturan genetik dan biokimia yang diterapkan pada kebanyakkan (mungkin semua) tipe kanker pada manusia.
Kanker berkembang melalui proses yang bertingkat (multistep) dimana genom dari sel-sel kanker baru terjadi mutasi pada beberapa kelompok gen tertentu seperti proto-oncogen, gen tumor supresor, dan gen-gen lain yang secara langsung maupun tidak langsung mengontrol proliferasi sel (Hahn dan Weinberg, 2002). Sel-sel kanker juga punya instabilitas genetik yang memungkinkan sel-sel mendapatkan perubahan lain sepanjang waktu. Satu dari ciri-ciri tumor ganas adalah heterogenitas mereka. Kanker timbul oleh akumulasi mutasi dari beberapa katagori gen, terutama onkogen, tumor suppressor gen, gen
DNA repair dan telomerase. Inisiasi dan progresi kanker dikontrol oleh peristiwa genetik dan
epigenetik..
Masalah penelitian: 1.
Bagaimana status metilasi gen-gen
BRCA1 dan gen
BRCA2
pada penderita kanker epitelial ovarium? 2. Apakah status metilasi gen BRCA1 dan
gen BRCA2 pada sel-sel jaringan kanker epitelial ovarium juga menunjukkan status
metilasi yang sama dengan gen
BRCA1 dan gen
BRCA2 dari DNA dalam serum
darah penderita? 3. Apakah proporsi status metilasi BRCA1 dan BRCA2 berhubungan
dengan stadium, derajad diferensiasi histopatologi jenis histopatologi kanker epielial
ovarium ? 4. Apakah status metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 dan ekspresi protein
BRCA1 dan potein BRCA2 berhubungan dengan kemampuan hidup penderita kanker
epitelial ovarium ?
Ekspresi protein BRCA1 ada dimana-mana pada manusia yang lokasinya di nukleus, sedangkan kadar tertinggi didapat dalam ovarium, testis dan thymus. Ini adalah tumor suppresor dan ekspresi berkurang dihubungkan dengan prosedur transformasi dan etiologi dari kanker payudara sporadik. Pengurangan ekspresi dikatakan diregulasi secara transkripsional implikasi dari metilasi promoter CpG dinukleotid maupun CREB binding
sites. Peran BRCA1 adalah dalam perbaikan DNA, BRCA1 tampaknya penting untuk
perannya dalam aktivasi checkpoint fase S. Fungsi BRCA2 implikasinya adalah menjaga integritas genom terhadap respon selluler kerusakan DNA. Protein BRCA2 berperan dalam pembentukan cekpoin spindel mitosis melalui modulasi pembentukan protein spindel cekpoin termasuk Aurora A dan Aurora B. Ekspresi BRCA2 proporsional dengan kecepatan proliferasi sel. Sel-sel yang tidak membelah tidak mengekspresikan BRCA2 sementara ekspressi yang jelas dari BRCA2 terlihat dalam jaringan yang aktif membelah, Ekspresi BRCA2 diregulasi selama siklus sel dengan ekspresi tertinggi pada fase S. Penemuan-penemuan ini telah menghantar kita pada hipotesis bahwa BRCA1 dan BRCA2 memainkan peranan pada perbaikan struktur abnormal DNA pada tempat sintesis DNA dan kerusakan DNA. Bukti keterlibatan BRCA2 dalam perbaikan DNA telah digambarkan bersamaan dengan BRCA1. Karena BRCA1 dan BRCA2 dibutuhkan untuk homologous DNA
recombination (HDR), tidak mengherankan bila sel-sel dengan defisiensi fungsi BRCA1 atau
BRCA2 menunjukkan tanda-tanda instabilitas genomik.
Proses epigenetik yang banyak diketahui adalah metilasi DNA. Metilasi adalah menambah empat atom pada cytosine salah satu dari empat nukleotid DNA, atom tambahan ini memblok protein yang mentranskrip gen. Metilasi DNA adalah mekanisme epigenetik yang menjadi sangat jelas pada akhir-akhir ini bahwa ada sinergi antara perubahan genetik dan epigenetik. Esteller et al. (2001) meneliti metilasi beberapa gen supressor pada berbagai jenis kanker dan mendapatkan metilasi BRCA1 pada kanker ovarium sporadik sebanyak 19%
(11/58). Dhillon et al. (2004) mendapatkan metilasi pada BRCA2 sebanyak 4% (1/25) pada kasusnya kanker ovarium jenis Granulosa Cell. Catteau et al. (1999) melakukan penelitian metilasi BRCA1 pada kanker ovarium (seluruh jenis kanker ovarium) mendapatkan 5 % (2/43) pada seluruh kasusnya. Aberrant metilasi BRCA1 secara primer berhubungan dengan 13% (11/84) dan 19% (11/58) kanker sporadik payudara dan ovarium (Esteller et al., 2001). Baldwin et al (2000) melaporkan frekuensi metilasi BRCA1 pada kanker ovarium sebanyak 15%. Rathi et al. (2002) mendapatkan metilasi BRCA1 sebanyak 10% dari 49 penderita kanker ovarium yang diteliti, sedangkan dari kontrol jaringan ovarium wanita normal maupun yang high risk tidak didapatkan metilasi BRCA1. Nikbakht et al. (2011) mendapatkan metilasi BRCA1 sebanyak 8 (13%) dari 60 kasus kanker ovarium. Wang et al
(2004) mendapatkan metilasi BRCA1 tidak terdeteksi pada tumor jinak dan borderline ovarium tetapi didapat metilasi 31% pada karsinoma ovarii.
Sampel penelitian yang diperlukan pada penelitian ini dihitung dengan menggunakan paket program statistik untuk sample size estimation for proportion (PEPI) dari Abramson & Gahlinger (1999). Jika diasumsikan seperti hasil penelitian de Caceres et al. (2004) BRCA1 hipermetilasi positif dalam tumor 48% dan hipermetilasi positif BRCA1
dalam serum 36 %. maka jumlah sampel yang dibutuhkan n = 67 kasus.
Bukti-bukti menunjukkan bahwa pada sel kanker gen-gen tumor suppressor mengalami hipermetilasi pada daerah promoternya sehingga gen-gen tersebut ”switched off” dengan akibat kontrol proliferasi sel terganggu. Gen-gen yang diduga berperan dalam perkembangan kanker ovarium adalah BRCA1 dan BRCA2 baik karena mutasi genetik atau proses epigenetik. Sejauh ini penelitian metilasi gen BRCA1 dan BRCA2 pada kanker ovarium belum pernah dilakukan di Indonesia, khususnya BRCA2 belum pernah dilaporkan status metilasinya pada kanker ovarium jenis epitelial. Pemeriksaan gambaran metilasi
BRCA1 dan BRCA2 pada kanker ovarium sangat penting untuk memahami molekuler
patologi kanker ovarium, yang pada akhirnya akan sangat bermanfaat pada penatalaksanaan klinik. Selain itu akan diteliti status metilasi gen BRCA1 dan BRCA2 dari DNA dalam serum dibandingkan dengan status metilasi gen BRCA1 dan BRCA2 pada sel-sel jaringan tumor. Hasilnya akan sangat penting untuk upaya diagnosis dini, follow up terapi dan prognosis penderita kanker ovarium.
Tujuan penelitian: 1. Mengetahui status metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 pada penderita kanker epitelial.ovarium. 2.Mengetahui status metilasi tumor suppresor gen BRCA1
dan gen BRCA2 pada sel-sel jaringan kanker epitelial ovarium dibandingkan dengan status metilasi tumor suppresor gen BRCA1 dan gen BRCA2 dari DNA dalam serum darah penderita. 3.Mengetahui apakah status metilasi BRCA1 dan BRCA2 berhubungan dengan stadium, derajad diferensiasi maupun jenis histopatologi kanker epitelial. Ovarium. 4. Mengetahui apakah metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 serta ekspresi protein BRCA1 dan protein BRCA2 berhubungan dengan kemampuan hidup penderita kanker epitelial ovarium.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan menjadi salah satu alternatif untuk mendapatkan teknologi untuk diagnosis dini, sebagai dasar menentukan penggunaan therapi dengan inhibitor metilasi dan evaluasi prognosis kanker ovarium, khususnya jenis epithelial dengan memberikan khasanah pilihan gen-gen apa yang seharusnya diperiksa untuk jenis-jenis kanker ovarium tertentu. Diharapkan hasil penelitian ini dapat memberikan andil atau dapat digunakan sebagai salah satu informasi dalam proyek penyusunan “human epigenetic project”.
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini: 1. Pada penderita kanker epitelial ovarium status metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 tidak lebih dari 50 %. 2. Proporsi status metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 pada sel-sel jaringan kanker epitelial ovarium tidak berbeda dengan proporsi status metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 dari DNA dalam serum penderita. 3. Status metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 terdapat hubungan dengan derajad diferensiasi maupun jenis histopatologi kanker epitelial ovarium. 4. Metilasi gen BRCA1 dan
gen BRCA2 serta ekspresi protein BRCA1 dan protein BRCA2 merupakan faktor prognosis
terhadap kemampuan hidup penderita kanker epitelial ovarium
Desain penelitian: adalah prospektif cohort. Penelitian dilakukan di RS Sardjito, penderita tumor ovarium bila hasil potong beku menunjukkan tumor neoplasma, maka sebagian tumor diambil untuk penelitian dan disimpan pada suhu -70 0 C, sementara jaringan tumor yang lain dilakukan pemeriksaan Patologi Anatomi untuk menentukan jenis histopatologi dan derajad diferensiasinya. Jika hasil pemeriksaan patologi anatomi menunjukkan tumor epitelial ganas maupun jinak, maka jaringan digunakan sebagai sampel penelitian. Jaringan yang diperoleh, kemudian akan diekstraksi DNAnya. Selain jaringan, serum penderita diambil dan disimpan sampai dilakukan ekstraksi DNAnya. Modifikasi
bisulfit akan dilakukan pada sampel DNA serum dan jaringan untuk selanjutnya diperiksa status metilasinya dengan metode methylation specific PCR (MSP) pada gen BRCA1 dan
BRCA2 dengan mengunakan primer dengan panjang yaitu untuk BRCA1_M panjang 75 bp,
BRCA1_U 76 bp, BRCA2_M 250 bp dan BRCA2_U 337 bp, dengan urutan basa nukleotid
sebagai berikut: BRCA1_MF: 5’-TCG TGG TAA CGG AAA AGC GC-3’, BRCA1_MR : 5’-AAA TCT CAA CGA ACT CAC GCC G-3’, BRCA1_UF : 5’-TTG GTT TTT GTG GTA ATG GAA AAG TGT-3’, BRCA1_UR : 5’-AAA AAA TCT CAA CAA ACT CAC ACC A-3’, Sedangkan primer BRCA2 (Dhillon et al., 2004) BRCA2_MF :5’-GAC GGT TGG GAT GTT TGA TAA GG-3’, BRCA2_MR :5’ AAT CTA TCC CCT CAC GCT CC-3’,
BRCA2_UF :5’-AGG GTG GTT TGG GAT TTT TAA GG-3’, BRCA2_UR ;5’-TCA CAC TTC TCC CAA CAA CAA CC-3’. Hasil metilasi DNA serum dan DNA jaringan dari kedua gen tersebut akan dibandingkan dan dianalisis. Sedangkan survival penderitanya diikuti sampai akhir penelitian Desember 2011.
Hasil penelitian: Sebanyak 132 kasus tumor ovarium telah dikumpulkan sejak tahun 2007 sampai tahun 2010, dari hasil operasi dan pemeriksaan frozen section. Sebelum operasi pada semua kasus diambil darah dan serumnya yang selanjutnya disimpan pada deep freezer
setelah diregistrasikan pada data base penelitian ini. Selanjutnya dilakukan seleksi, tumor non epitelial dan Nonneoplastik dikeluarkan, sehingga tinggal 104 kasus tumor ovarium epitelial. Dari sebanyak 104 tumor ovarium epithelial setelah dilakukan pengecatan IHC sebanyak 5 kasus blok parafinnya tidak diketemukan sehingga tinggal 99 kasus, terdiri atas 30 kasus tumor ovarium epitelial jinak dan 69 kasus tumor ovarium epitelial ganas, yang selanjutnya digunakan untuk penelitian dissertasi ini. Kemampuan hidup penderita diikuti sampai akhir Desember 2011 Kemampuan hidup penderita diikuti sampai akhir Desember 2011. Follow up penderita terpanjang selama 54 bulan dan terpendek selama 12 bulan.
Beberapa faktor demografi dan faktor klinis sering dikaitkan dengan faktor risiko dan prognosis tumor ovarium antara lain umur penderita, umur saat
menars
, paritas, umur menopause, status gizi, residual operasi, stadium, jenis histopatologi, derajad diferensiasi dicatat dan dianalis.Hasil penelitian didapat rata-rata umur penderita tumor ganas ovarium 45,36 tahun, sedang tumor jinak 39,63 tahun Rata-rata umur penderita tumor ganas lebih tinggi dibanding dengan penderita tumor jinak dan secara statistik berbeda bermakna (p = 0.040). distribusi
umur penderita tumor ovarium ganas paling banyak pada dekade kelima dan keenam sebanyak 60,7%, sedangkan tumor jinak ovarium distribusi paling banyak pada dekade keempat dan kelima sebanyak 50,3%. Umur
menars
dikatakan merupakan faktor risiko terjadinya tumor ovarium, makin awal terjadinyamenars
makin tinggi risiko terjadinya tumor ovarium. Dikatakan bahwa lamanya masa reproduksi merupakan faktor risiko terjadinya tumor ovarium dimana makin lama periode reproduksi atau makin banyak terjadinya ovulasi makin tinggi risiko terjadinya tumor ovarium dengan demikianmenars
yang awal dan menopause yang lanjut menjadi faktor risiko terjadinya tumor ovarium Pada penelitian ini juga didapatkan rata-rata umurmenars
penderita tumor jinak lebih tinggi yaitu 14,43 tahun sedang penderita tumor ganas rata-rata umur 13,75 tahun, walaupun secara statistik tidak berdeda bermakna dengan p = 0,139. Rata-rata paritas penderita tumor epitelial ovarium jinak lebih rendah (1,67) dibanding penderita tumor ganas epitelial ovarium (1,74) akan tetapi secara statistik tidak berbeda bermakna p = 0, 845. Distribusi paritas penderita tumor ovarium jinak 70% dengan paritas 0 sampai dengan 2, juga paritas penderita tumor ovarium ganas 69,6% juga dengan paritas 0 sampai dengan 2. Secara epidemiologi tumor ovarium lebih banyak terjadi pada wanita-wanita dengan paritas rendah, karena tejadinya kehamilan merupakan faktor protektif untuk timbulnya tumor ovarium. Jika dibandingkan nulligravida, wanita dengan primigravida mempunyai risiko relatif 0,6 sampai 0,8, dan dengan penambahan satu kehamilan sampai aterm akan menurunkan risiko kurang lebih 10-15% (Booth et al, 1989; Risch et al., 1994a). Holschneider and Berek (2000) menyebutkan beberapa faktor reproduksi menjadi faktor risiko kanker ovarium antara lainmenars
awal dengan peningkatan risiko relatif 1 – 1,5 kali, menopause yang lambat dengan perkiraan risiko relatif 1,5 – 2 kali, nuliparitas 2 – 3 kali, infertilitas 2 – 5 kali.Status gizi penderita tumor ovarium yang digambarkan dengan body mass index
(BMI) rata-rata pada penderita tumor jinak dan tumor ganas tidak berbeda bermakna dengan
p = 0,373. Distribusi status BMI penderita tumor ovarium 75 % lebih berada pada kelompok normal dan rendah, hal ini kemungkinan karena pada penderita tumor ovarium gejala-gejala umum yang dirasakan adalah abdominal discomfort atau perut sebah atau “mbeseseg” dengan demikian adanya gejala ini akan menyebabkan penderita anoreksia atau nafsu makan akan menurun sehingga umumnya terjadi penurunan berat badan. Demikian juga pada umumnya penyakit kanker ganas didiagnosis sudah stadium lanjut dan status gizi penderita sudah turun.
Dikatakan bahwa wanita dengan obese mempuyai risiko lebih tinggi untuk terjadinya tumor ovarium, Riordan et al. (2005) mendapatkan bahwa wanita Hispanic dengan status BMI
moderately overweight sampai obese (BMI ≥ 25 kg/m2 ) mempunyai kenaikan RR = 2,5.
Risiko juga meningkat pada wanita Non Hispanic tetapi RR nya lebih rendah dan tidak berbeda bermakna dibanding dengan wanita yang BMI lebih rendah.
Data hasil pemeriksaan klinis dan laboratorium penderita tumor ovarium. Kadar CA 125 serum pada penderita tumor ovarium jinak dan tumor ovarium ganas jauh berbeda bermakna dengan p = 0,005, dimana rata-rata kadar CA 125 pada penderita tumor jinak 311,87 mIU/ml dan pada tumor ganas epitelial ovarium 1609,25 mIU/ml (Tabel 7). Dikatakan bahwa kadar CA 125 darah yang tinggi merupakan tanda bahwa tumor ovarium adalah ganas. Meskipun CA 125 adalah penanda tumor yang bermanfaat untuk memonitor perjalanan penyakit kanker ovarium akan tetapi CA 125 saja tidak bermanfaat untuk tes skrining kanker ovarium. Tes ini tidak cukup sensitif mendiagnosis stadium awal penyakit. Karena lebih dari 85% wanita dengan penyakit stadium lanjut terjadi kenaikan kadar CA 125 ( >35 mlU/ml), hanya 50% wanita dengan kanker ovarium stadium awal terdapat kenaikan kadar CA 125. Hampir 6% wanita tanpa kanker ovarium didapat kadar CA 125 lebih dari 35 mlU/ml (Urban, 2003). (Bast, et al., 1983). Review terhadap 15 penelitian dan menunjukkan bahwa kadar CA-125 meningkat pada 50% pasien dengan stadium I penyakit, 90% pada stadium II, 92 % pada stadium III, 94% pada stadium IV penyakit Jacobs & Bast (1989). Dilaporkan juga adanya korelasi positif antara adanya kenaikan kadar serum CA 125 dengan tingkat ekspresi CA 125 dalam jaringan kanker ovarium epitelial. Pada kanker ovarium epitelial tipe serosa ekpresinya positif lebih banyak secara bermakna dibanding tipe lain kanker ovarium epitelial. Juga didapatkan survival yang lebih pendek bermakna pada penderita kanker ovarium stadium III dan IV tanpa ekspresi CA 125 dibanding penderita kanker ovarium stadium III dan IV dengan ekspresi CA 125 dalam tumornya (Høgdall et al., 2007).
Hasil isolasi DNA didapat rata-rata konsentrasi DNA jaringan baik pada tumor ganas maupun tumor jinak tidak terdapat perbedaan bermakna (p = 0,408), demikian juga rata-rata konsentasi DNA serum baik pada penderita tumor jinak dan tumor ganas ovarium tidak berbeda bermakana (p = 0,288), menunjukkan bahwa proses isolasi, preservasi material jaringan dan serum serta kualitas maupun teknis pemeriksaan juga tidak berbeda. Hasil
isolasi DNA dari jaringan dan serum rata-rata konsentrasi jelas tampak bahwa konsentrasi DNA dalam serum jauh lebih kecil dibanding konsentrasi DNA jaringan, sesuai dimana jaringan tersusun banyak sel, sedang dalam serum hanya merupakan fragmen-fragmen DNA hasil degradasi sel karena nekrosis sel maupun apoptosis sel-sel tumor yang masuk sirkulasi.
Hasil metilasi gen BRCA1 pada jaringan tumor ganas epithelial ovarium yang sel-sel tumor terdapat metilasi sebanyak 62/69 kasus (89,9%) yang tidak termetilasi sebanyak 7/69 kasus (10,1%) dan pada tumor jinak sebanyak 26/30 kasus (86,7%). Pada tumor ganas epitelial ovarium gen BRCA2 yang termetilasi sebanyak 68/69 kasus (98,6%) dan pada tumor jinak sebanyak 29/30 kasus (96,7%). Menunjukkan bahwa sebagian besar kasus (89, 9%) kanker ovarium epithelial di Rumah Sakit Sardjito Yogyakarta didapat gen BRCA1 nya
silent atau inaktif karena proses metilasi. Beberapa laporan mendapatkan tingkat metilasi
BRCA1 pada tumor ganas ovarium sebagai berikut berkisar 8 – 65% (Baldwin et al. (2000); Chan et al. (2002); Wang et al (2004); Esteller et al. (2001); Rathi et al. (2002); Nikbakht et al. (2011)). Pada penelitian ini antara tumor ovarium ganas maupun tumor jinak ovarium status metilasinya tidak bermakna (p = 0,643) dimana pada tumor ovarium ganas metilasi BRCA1 sebanyak 89,9% dan pada tumor jinak sebanyak 86,7 %. Para peneliti diatas menyebutkan bahwa prognosis penderita karsinoma ovarii tidak berhubungan dengan ekspresi BRCA1 atau status genetik.
Metilasi gen BRCA2 justru didapat lebih tinggi berbeda dengan penelitian lain. Belum banyak laporan tentang metilasi gen BRCA2 pada tumor ovarium. Peneliti lain mengatakan bahwa gen BRCA2 disebut sebagai salah satu gen yang mengalami sedikit atau tidak mengalami metilasi pada berbagai macam tumor (Collins et al., 1997;Chan et al., 2002: Shames et al., 2007). Sedangkan Dhillon et al. (2004) mendapatkan metilasi pada BRCA2
sebanyak 4 % (1/25) pada kasusnya kanker ovarium jenis granulosa cell tumors.
Temuan dari penelitian ini menimbulkan pertanyaan apakah memang sedemikian tinggi metilasi gen BRCA1 dan BRCA2 pada penderita kanker ovarium epitelial di Rumah Sakit Sardjito ? Kalau semua sel-sel tumor mengalami metilasi pada gen BRCA1 maka tentunya sel-sel tumor tidak akan terekpresi protein BRCA1 akan tetapi pada pemeriksaan didapat 53/99 kasus (53,5%) masih menunjukkan adanya ekspresi protein BRCA1 dan hanya 46 (46,5 %) kasus tidak menunjukkan ekspresi BRCA1. Ekspresi protein BRCA2 positif
44/99 (44,4 %) dan negatif 55/99 (55,6%). Berarti tidak semua sel tumor ovarium pada seorang penderita yang pada pemeriksaan status metilasinya positif tidak semua sel-selnya mengalami metilasi. Hal ini diperkuat pada pemeriksaan elektroforesis juga setiap sampel walaupun didapat band yang menunjukkan metilasi gen positif tetapi disisi lain juga terdapat
band yang menunjukkan adanya gen yang tidak termetilasi. Demikian juga tidak semua sel-sel kankernya pada pemeriksaan menunjukkan ekspresi protein BRCA1 dan BRCA2 negatif walaupun hasil pemeriksaan metilasinya gen BRCA1 dan BRCA2 positif. Ini menunjukkan bahwa silent atau tidak aktifnya gen BRCA1 dan BRCA2 pada perkembangan tumor tidak hanya karena proses epigenetik atau proses genetik (mutasi gen) saja, akan tetapi berbagai mekanisme lain dapat terjadi bersama-sama, seperti peran mikro RNA (miRNA) dimana
miRNA adalah RNA dengan rantai nukleotid pendek yang panjangnya kurang dari 22 basa
nukleotid dan akan menghetikan proses translasi mRNA jika protein hasil dari translasi gen sudah tidak diperlukan lagi dengan cara berikatan dengan mRNA sehingga mRNA akan
silent atau mengalami degradasi.
Ekspresi protein BRCA1 dan BRCA2 diatur oleh berbagai perangkat molekular didalam sel. Pengaturan di level transkripsi, tranlasi dan post translasi. Pada hasil penelitian terkini, dilaporkan bahwa penyebab dan kejadian awal kanker ovarium epithelial diatur oleh sekelompok gena termasuk gen micro RNA, yang dapat dimodulasi pada 4 level yaitu pada level genomik, pengaturan transkripsional, modifikasi postranslasi dan proses regulasi dari miRNA (Feng, 2011). Posisi gen miRNA sudah dipetakan tersebar pada kromosom 1 sampai dengan 22, dan kromosom seks X dan Y. Ternyata, serkitar 16% miRNA diatur pada level post-translasional. Perubahan pasangan basa A -T menjadi A- I (Inosin yang berperan pada editing RNA) menyebabkan konversi biogenesis miRNA, perubahan produk miRNA dan perubahan targeting spesifik miRNA (Kawahara dan Nishikura, 2009). Juga telah dilaporkan bahwa lin28, suatu represor let7 miRNA apabila terjadi perubahan pasangan basa tersebut, menyebabkan enzim Dicer tidak berfungsi dan pre-miRNA degradasi akibatnya protein target mRNA overekspresi (Heo et al, 2008). Hal ini, mungkin dapat menjelaskan mengapa terjadi perbedaan gambaran ekspresi BRCA1 dan BRCA2 dengan gen BRCA1 dan BRCA2 terdapat metilasi, namun ekspresi protein di jaringan juga tetap tinggi.
Seperti disebutkan Hilton et al. (2002) bahwa inaktivasi universal BRCA1 dan
BRCA2 ada multipel mekanisme tidak hanya karena mutasi dan hipermetilasi tetapi masih
ada faktor atau mekanisme lain. Mekanisme-mekanisme ini antara lain termasuk; pertama mutasi promoter BRCA2, sehingga gagal mengidentifikasi pulau CpG yang benar dari promoter BRCA2, kedua hilangnya fungsi produk gen yang diperlukan untuk transkripsi
BRCA2, serta tidak adanya loss of heterozygisity (LOH) sebagai penyebab ketiga, karena 7 kasus dari 11 kasus yang tidak menunjukkan ekspresi mRNA BRCA2 tidak menunjukkan adanya LOH (Hilton et al., 2002).
Dari data hasil penelitian ini didapatkan tingkat metilasi gen-gen BRCA1 dan
BRCA2 tidak berbeda dalam tumor ganas dan tumor jinak berturu-turut p = 0,643 dan p = 0,540. Hasil ini sangat berbeda dengan hasil penelitian ditempat lain. Dipikirkan apakah ada kemungkinan kesalahan teknis pemeriksaan dan untuk membuktikan tidak adanya kesalahan
(error) dalam pemeriksaan pada penelitian ini telah dilakukan validasi internal dengan
kontrol positif dan negatif dengan cara penggunaan kontrol positif dan kontrol negatip pada setiap running pemeriksan elektroforesis Juga kita lakukan validasi eksternal dengan cara melakukan pemeriksaan ulang secara acak sampel penelitian. Dilakukan juga pemeriksaan terhadap beberapa sampel dari sel-sel normal lain yaitu sel leukosit orang normal.
Jadi dengan pemeriksaan untuk validasi diatas kemungkinan kesalahan teknik pemeriksaan dapat dikesampingkan atau hasil pemeriksaan dalam penelitian valid. Hasil penelitian ini kemungkinan memang menunjukkan karakteristik dari penderita kanker ovarium di Indonesia khususnya didaerah Yogyakarta dan Jawa Tengah Selatan. Seperti diketahui bahwa proses karsinogenesis disebabkan oleh berbagai faktor (multi faktor) seperti diuraikan dalam tinjauan pustaka. Demikian juga metilasi promoter suatu gen supresor dapat disebabkan oleh berbagai faktor antara lain; lingkungan, gizi, bahan-bahan kimia, infeksi dan sebagainya. Dimana untuk orang Indonesia faktor-faktor tersebut memang berbeda dengan orang-orang dinegara barat maupun negara maju lainnya. Sehingga akan sangat berpengaruh terhadap status metilasi dari gen-gen pada individu-individu di populasi kita. Dengan didapatkannya fakta proporsi metilasi promoter gen BRCA1 dan gen BRCA2 yang cukup tinggi tersebut, pada populasi penderita kanker ovarium epitelial di Indonesia khususnya di Jawa Tengah ini akan dapat digunakan sebagai dasar pemikiran adanya indikasi kuat
pemakaian gene targeted therapy dengan inhibitor metilasi DNA seperti DMT inhibitor (azacitidine) dan HDAC inhibitor dalam terapi kanker ovarium di Indonesia, jika penggunaan terapi ini sudah di approved oleh lembaga yang berwenang untuk digunakan pada kanker ovarium. Seperti diketahui penggunaan Azacitidine (AZA) suatu inhibitor metilasi DNA telah di setujui (approved) oleh FDA sejak Mei 2004, untuk terapi myelodysplasticsindrome
(MDS) suatu kondisi prakanker dari acute myeloid leukemia. Ini merupakan satu contoh pioner obat yang targetnya adalah “epigenetic gene silencing” suatu mekanisme yang terjadi pada sel kanker untuk menghambat ekspresi gen-gen yang efeknya menghambat penotif keganasan (Issa et al., 2005). Terlebih kanker ovarium adalah kanker yang sangat heterogen dimana banyak sekali jenis histopatologinya dan juga tingkat keganasannya yang sangat bervariasi dengan progresifitas yang lambat sampai progresifitas yang sangat cepat sehingga pendertia sangat cepat meninggal. Dengan demikian menggunakan profil molekuler kanker ovarium untuk mengurangi heterogenitasnya yang kemudian akan sangat penting untuk seleksi pasien dalam menentukan terapinya. Seperti halnya pada MDS (Myelo dysplastic syndrome) suatu kelompok penyakit yang heterogen dimana luarannya sangat berbeda-beda tergantung dari gambaran klinoko-patologinya dari kronis dan lambat sampai agresif dengan
survival yang pendek. Hasil data penelitian ini mendapatkan frekuensi metilasi gen BRCA1
dan BRCA2 yang demikian tinggi, merupakan fakta baru untuk kita di Indonesia.
Hipermetilasi pada gen BRCA1 dan gen BRCA2 pada kanker ovarium epitelial tingkat variasinya besar dan sangat mungkin berbeda-beda pada tiap negara oleh karena perbedaan faktor lingkungan, gizi, dan paparan-paparan bahan kimia, faktor polusi yang berbeda, karena ini sangat berpengaruh terhadap kejadiaan metilasi promoter gen suppresor maupun gen-gen lain.
Hasil Analisis Kappa statistic: Gen BRCA1 dan gen BRCA2 serum yang berhasil diisolasi dari penderita kanker ovarium dan dilakukan pemeriksaan metilasi proporsi metilasinya tidak berbeda bermakna dengan gen BRCA1 dan BRCA2 jaringan berturut-turut p = 0,528 dan p = 0,626. Akan tetapi untuk uji kesepakatan (agreement) dengan Kappa
statistic hasil pemeriksaan metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 pada DNA jaringan dan
serum ternyata nilai Kappa berturut-turut – 0,035 dan – 0,062. Analisis ini menunjukkan bahwa metilasi gen BRCA1 dan BRCA2 dari DNA serum tidak dapat mendeteksi adanya perubahan gen dari tumor epitelial ovarium. Dengan uji statistik Kappa untuk menguji
kesepakatan antara adanya metilasi dan ekspresi BRCA1 dan BRCA2 didapat berturut-turut nilai kappanya adalah -0,048 (4,8 %) dan –0,003 (- 0,3 %). Jadi antara adanya metilasi gen dan ekspresi gen memang tidak ada kesepakatan atau kesepakatan sangat rendah. Ini juga nenunjukkan bahwa switch on atau switch off gen supresor BRCA1 dan BRCA2 pada tumor epitelial ovarium tidak hanya oleh karena adanya hipermetilasi atau metilasi pada promoternya. akan tetapi ada mekanisme lain yang berperan.
Dikatakan bahwa ekspresi protein BRCA1 ada dimana-mana pada manusia yang lokasinya di nukleus, sedangkan kadar tertinggi didapat dalam ovarium, testis dan thymus. Jadi dengan tidak terekspresinya protein BRCA1 dalam tumor ovarium menunjukkan adanya disfungsi gen BRCA1 baik karena perubahan genetik maupun epigenetik yang dapat mengakibatkan terjadinya transformasi sel-sel menjadi kanker. BRCA1 adalah tumor suppresor yang ekspresi berkurang dihubungkan dengan proses transformasi dan etiologi dari kanker payudara dan kanker ovarium sporadik. Berkurangnya ekspresi BRCA1 sangat mungkin berhubungan dengan adanya metilasi gen. Hasil pemeriksaan metilasi gen BRCA1 didapatkan sebanyak 89,9 %. Dengan demikian 43,5 % tumor ovarium epitelial yang protein BRCA1 tidak terekspresi sangat mungkin karena melilasi sedangkan yang 56,5% sisanya terekspresi dengan tingkat positif yang berbeda-beda dimana hanya 15,5 % yang ekspresinya lebih dari 50% atau positif 3 dan 4 (Tabel 5). Sehingga memang sangat mungkin kurangnya ekspresi protein BRCA1 karena adanya down regulasi karena proses metilasi. Memang dikatakan bahwa kanker ovarium yang disebabkan oleh germline mutation frekuensinya 10-15%. Sedangkan sisanya yang sporadik sangat mungkin karena peran gen BRCA1 yang hilang karena adanya metilasi pada promoternya sehingga inaktif.
Thrall et al. (2006) mendapatkan 84% kasus tumor ganas ovarium epitelial masih terekspresi positif. Secara statistik didapat hubungan bermakna (p < 0,001) antara ekspresi BRCA1 dalam jaringan tumor dengan stadium tumor, dimana ekspresi tampak pada semua stadium I dan stadium II, sama sekali negatif pada 16% tumor stadium III, atau 65% tumor stadium III terdapat ekspresi minimal sampai sama sekali negatif (0 - < 10%) dibanding dengan 22% pada stadium I dan 14% pada stadium II. Jadi secara keseluruhan terdapat penurunan yang signifikan ekspresi protein BRCA1 dengan stadium yang makin meningkat pada kanker ovarium epitelial.
Analisis Bivariabel Uji bivariabel disini bertujuan untuk mengetahui hubungan antara variabel bebas (status metilasi BRCA1 dan BRCA2) dengan variabel tergantung (terjadinya tumor jinak/ganas epitelial ovarium) dan variabel luar (umur penderita, umur
menars
, paritas, BMI, kadar CA 125, IHC BRCA1, IHC BRCA2, stadium penyakit, jenis histopatologi dan derajad diferensiasi). Serta mencari variabel potensial confounderhubungan antara variable bebas dengan variabel tergantung, dalam analisis multivariabel dengan analisis regresi logistik.dan untuk mencari model dan melihat prediksi kontribusi variabel confounding terhadap terjadinya outcome. Diperoleh variabel yang potensial sebagai
confounder antara lain akan digunakan untuk mengontrol dalam mencari hubungan variable
bebas dengan variabel tergantung terjadinya tumor epitelial ovarium ganas atau jinak, yaitu; umur, BMI, kadar CA 125 dan asal daerah penderita ditambah variable of interest lain yaitu IHC protein BRCA1 dan IHC BRCA2.
Analisis multivariabel: Dalam analisis multivariabel dengan uji regresi logistik akan diuji hubungan variabel bebas dengan variabel tergantung dengan mengendalikan variabel confounding potensial dan dicari model terbaik untuk hubungan tersebut. Dari model 1 dengan variabel interent (metilasi BRCA1, metilasi BRCA2, IHC_BRCA1 dan IHC_BRCA2) diperoleh nilai R2 0,030 berarti model ini di prediksi menyumbang 3% terhadap terjadinya outcome (tumor ganas/jinak epitelial ovarium) sedangkan 97% disumbang oleh faktor-faktor lain. Pada model 2 yaitu model 4 ditambah variabel umur penderita diperoleh R2 0,134 berarti diprediksi model ini berkontribusi terhadap terjadinya outcome sebesar 13,4 % atau variabel umur berkontribusi terhadap terjadinya outcome sebesar 10,4 %. Model 3 yaitu model 1 ditambah variabel BMI didapat nilai R2 0,045 artinya variabel BMI berkontribusi terhadap terjadinya outcome sebesar 1,5%. Model 4 dengan tambahan variabel kadar CA 125 diperoleh nilai R2 0,193 berarti bariabel kadar CA 125 berkontribusi terhadap terjadinya outcome sebesar 16,3%. Model 5 dengan menambah variabel asal penderita diperoleh nilai R2 0,75 berarti variabel asal penderita berkontribusi terhadap terjadnya outcome sebesar 4,5%, Pada model 6 dengan menambahkan keempat variabel confounder pada model 1, diperoleh R2 0,374 berarti model ini berkontribusi terhadap terjadinya outcome sebesar 37,4% sedangkan 62,6% disumbang oleh faktor-faktor lain. Model 7 dengan mencoba mengurangi salah satu confounder dan dilihat nilai R2 terbesar, maka itulah model intervensi terbaik. Kebetulan variabel yang direduksi adalah
variabel umur yang mana dalam upaya intervensi tentu kita tidak akan dapat membuat intervensi dengan umur penderita.
Analisis Regresi Logistik Multinomial: analisis ini untuk melihat apakah metilasi
BRCA1, metilasi BRCA2, IHC_BRCA1 dan IHC_BRCA2 ada hubungan dengan jenis
histopatologi, derajad diferensiasi dan stadium penyakit. Secara klinis metilasi gen BRCA1, ekspresi protein BRCA1 dan ekspresi protein BRCA2 berpengaruh terhadap jenis histopatologi adenokarsinoma endometrioid dan clear cell carcinoma, walaupun secara statistik tidak bermakna. Metilasi gen BRCA1 dan ekspresi protein BRCA2 berpengaruh secara klinis bermakna tetapi tidak bermakna secara statistik terhadap derajad diferensiasi sedang dan diferensiasi buruk. Metilasi gen BRCA1, ekspresi protein BRCA1 dan ekspresi protein BRCA2 berpengaruh secara klinis bermakna terhadap stadium lanjut penyakit.
Analisis kemampuan hidup (survival analysis): dengan analisis log rank test dapat ditunjukkan pengaruh variable of interest terhadap survival penderita dimana tampak bahwa penderita tumor ganas epitelial ovarium yang gen BRCA1 dan gen BRCA2 termetilasi
survivalnya lebih rendah dibanding yang tidak termetilasi walaupun seca statistik tidak
berbeda bermakna berturut-turut p = 0,974 dan p = 0,719. Sedangkan survival penderita yang tumornya terekspresi protein BRCA1 dan protein BRCA2 survivalnya lebih tinggi dibanding penderita yang protein BRCA1 dan protein BRCA2 tidak terekspresi walaupun secara statistik tidak berbeda bermakna dimana berturut-turut p = 0,530 dan p = 0,335.
Dengan uji log rank test juga teridentifikasi variabel luar yang potensial berpengaruh terhadap survival penderita antara lain; umur
menars
, kadar CA 125, stadium penyakit, dan residu operasi. Setelah dilakukan uji Cox regression (Proportional Hazard model) faktor yang berpengaruh terhadap survival adalah kadar CA 125 dengan p = 0,036.K e s i m p u l a n
1. Ditemukan penderita-penderita kanker epitelial ovarium status metilasi gen BRCA1
didapat sebanyak 89,9% penderita, dan metilasi gen BRCA2 didapat sebanyak 98,6% penderita.
2. Proporsi status metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 di jaringan tumor ovarium dengan di serum penderita tidak berbeda bermakna berturut-turut p 0,328 dan 0,237. Hasil pemeriksaan status metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 dalam serum tidak dapat digunakan sebagai prediktor untuk menentukan status metilasi gen BRCA1 dan gen
BRCA2 dalam jaringan tumor ovarium. Degan nilai kappa statistik berturut – 0,035 dan – 0,062
3. Secara klinis metilasi gen BRCA1, ekspresi protein BRCA1 dan ekspresi protein BRCA2 berhubungan terhadap jenis histopatologi adenokarsinoma endometrioid dan clear cell
carcinoma, walaupun secara statistik tidak bermakna. Didapat bahwa metilasi gen
BRCA1 dan ekspresi protein BRCA2 berpengaruh secara klinis bermakna tetapi tidak bermakna secara statistik terhadap derajad diferensiasi sedang dan diferensiasi buruk tumor. Didapat bahwa metilasi gen BRCA1, ekspresi protein BRCA1 dan ekspresi protein BRCA2 berpengaruh secara klinis bermakna terhadap stadium lanjut penyakit. 4. Metilasi gen BRCA1 dan gen BRCA2 serta ekspresi protein BRCA1 bukan faktor
prognosis terhadap survival penderita kanker epitelial ovarium, sedangkan ekspresi protein BRCA2 secara klinis berpengaruh terhadap survival penderita,
S a r a n
1. Untuk pemeriksaan metilasi DNA dalam serum penderita perlu diupayakan untuk mendesain beberapa primer yang lebih pendek dan spesifik untuk gen BRCA1 dan gen BRCA2 sehingga akan dapat mengidentifikasi fragmen-fragmen gen BRCA1 dan gen BRCA2 dalam serum
2. Perlu dilakukan penelitian lagi terhadap status metilasi gen-gen yang lain untuk membuktikan bahwa status metilasi gen-gen pada populasi Indonesia memang berbeda dengan populasi negara lain yang mungkin disebabkan karena perbedaan ras dan lingkungan.
3. Untuk menguji kebenaran hasil penelitian ini perlu mendesain beberapa primer yang spesifik dari beberapa site (bagian) dari promoter gen BRCA1 dan gen BRCA2, atau dapat dilakukan pemeriksaan sequencing.
