KULTUR PROTOPLAS. Yushi Mardiana, SP, Msi Retno Dwi Andayani, SP, MP

(1)

KULTUR PROTOPLAS

Yushi Mardiana, SP, Msi Retno Dwi Andayani, SP, MP

(2)

Pendahuluan

• Protoplas adalah sel

yang telah

dihilangkan dinding selnya. Sehingga sangat rentan pada perubahan

(3)

Pendahuluan

• Protoplas adalah sel

yang telah

dihilangkan dinding selnya. Sehingga sangat rentan pada perubahan lingkungan • Studi tentang protoplas banyak digunakan sebagai model untuk mempelajari sifat tanaman dan

bakteri pada tingkat seluler

(4)

Isolasi Protoplas

• Protoplas dapat

diisolasi dari berbagai

bagian tanaman,

(5)

Isolasi Protoplas

• Protoplas dapat

diisolasi dari berbagai

bagian tanaman,

seperti:

(6)

Isolasi Protoplas

• Protoplas dapat

diisolasi dari berbagai

bagian tanaman,

seperti:

• Akar

• Daun

(7)

Isolasi Protoplas

• Protoplas dapat

diisolasi dari berbagai

bagian tanaman,

seperti:

• Akar

• Daun

(8)

Isolasi Protoplas

• Protoplas dapat

diisolasi dari berbagai

bagian tanaman,

seperti:

• Akar

• Daun

• Koleoptil

• Jaringan buah

(9)

Isolasi Protoplas

• Protoplas dapat

diisolasi dari berbagai

bagian tanaman,

seperti:

• Akar

• Daun

• Koleoptil

• Jaringan buah

• Kalus

(10)

(11)

Isolasi Protoplas secara Enzimatik

• Pada umumnya, proses isolasi protoplas

(12)

Isolasi Protoplas secara Enzimatik

• Pada umumnya, proses isolasi protoplas

dilakukan secara enzimatik.

• Yaitu memanfaatkan kerja enzim untuk

(13)

Isolasi Protoplas secara Enzimatik

• Pada umumnya, proses isolasi protoplas

dilakukan secara enzimatik.

• Yaitu memanfaatkan kerja enzim untuk

mendegradasi dinding sel.

• Dinding sel tanaman terbuat dari pektin,

(14)

Isolasi Protoplas secara Enzimatik

• Pada umumnya, proses isolasi protoplas

dilakukan secara enzimatik.

• Yaitu memanfaatkan kerja enzim untuk

mendegradasi dinding sel.

• Dinding sel tanaman terbuat dari pektin,

hemiselulosa, dan selulosa.

• Setidaknya ada 15 jenis enzim yang dapat

(15)

Enzim

• 15 Enzim yang digunakan untuk mendegradasi

dinding sel adalah:

Pectin glycosidase

pectinase

Cellulase R10

xylanase

Macerozyme

meicelase

Rohament P

cellulase onozuka RS

Driselase

cellulase

Pectolyase Y23

hemicellulase

Cellulosyn

Macerase

(16)

Enzim

Organisme

Produsen

Selulase

driselase Basidiomycetes Kyowa Hakko Kogyo Co. Japan onozuka RS Trichoderma viride Yakult Honsha Co. Japan

cellulysin T. viride Calbiochem, USA cellulase Aspergillus niger Sigma Chemical Co

meicelase CESB T. viride Meiji Seika Kaisha, Ltd. Japan

Hemicelulase

rhozyme HP-150 Aspergillus niger Rohm and Hass Co. USA hemicellulase A. niger Sigma Chemical Co.

Pectinase

macerozyne R-10 Rhizopus spp Yakult Honsha Co. Japan macerase Rhizopus spp Calbiochem, USA

pectolyase Y-23 Aspergillus japonicus Seishim Pharmaceutical Co. pectinol AC A. niger Corning glass, USA

pectinase A. niger Sigma Chemical Co. PATE (pectic acid acetil transfer) Hoescht, Germany

(17)

(18)

Isolasi Protoplas dari Daun

(19)

Isolasi Protoplas dari Daun

• Sterilisasi daun

• Penghilangan

(20)

Isolasi Protoplas dari Daun

• Sterilisasi daun

• Penghilangan

epidermis

• Perlakuan

enzimatik

(21)

Isolasi Protoplas dari Daun

• Sterilisasi daun

• Penghilangan

epidermis

• Perlakuan

enzimatik

• Isolasi dan

pemurnian

protoplas

(22)

Tahap Isolasi Protoplas pada Daun

• daun yang telah tumbuh sempurna pada fase

vegetatif direndam pada alkohol 70% selama

1 menit

(23)

Tahap Isolasi Protoplas pada Daun

• daun yang telah tumbuh sempurna pada fase

vegetatif direndam pada alkohol 70% selama

1 menit

• kemudian direndam sodium hypoclorite 2%

(24)

Tahap Isolasi Protoplas pada Daun

• daun yang telah tumbuh sempurna pada fase

vegetatif direndam pada alkohol 70% selama

1 menit

• kemudian direndam sodium hypoclorite 2%

selama 2-3 menit

• dibilas 3 kali dengan aquades steril.

Pembilasan dilakukan untuk menghasilkan

protoplas yang murni

(25)

Isolasi Protoplas secara

Enzimatik

(26)

Isolasi Protoplas secara

Enzimatik

Cara pertama, metode langsung:

• Cacahan daun direndam pada larutan enzim steril (0,5

macerozym +2% onozuka celulase dalam 13% sorbitol atau manitol pada pH 5,4)

(27)

Isolasi Protoplas secara

Enzimatik

(28)

Isolasi Protoplas secara

Enzimatik

• Kemudian diinkubasi selama 15-18 jam.

• Setelah diinkubasi, potongan daun digoyang-goyangkan

(29)

Isolasi Protoplas secara

Enzimatik

untuk melepaskan protoplasma

(30)

Isolasi Protoplas secara

Enzimatik

• Kemudian disaring untuk membuang debris

(31)

Isolasi Protoplas secara

Enzimatik

• Tambahkan 100 g supernatan, diambkan selama 1 menit • Murnikan dengan pencucian menggunakan 13% sorbitol,

(32)

Isolasi Protoplas secara

Enzimatik

• Tambahkan 100 g supernatan, diambkan selama 1 menit • Murnikan dengan pencucian menggunakan 13% sorbitol,

yang diulang sebanyak 3 kali

(33)

• Protoplas yang diisolasi dari daun berwarna

(34)

Kultur dan Regenerasi

Protoplas

• Protoplas yang sudah ditanam di media

kultur akan meregenarasi dinding sel di

sekelilingnya untuk membentuk sel yang

sempurna sehingga dapat membelah dan

(35)

Kultur dan Regenerasi

Protoplas

• Protoplas yang sudah ditanam di media

kultur akan meregenarasi dinding sel di

sekelilingnya untuk membentuk sel yang

sempurna sehingga dapat membelah dan

memperbanyak diri membentuk mikro kalus

• Dengan manipulasi media dan lingkungan

kultur yang tepat, kalus dari protoplasma

akan terinduksi menjadi embrio dan

(36)

• Regenerasi tanaman dengan metode

kultur protoplas merupakan metode

yang paling sulit.

(37)

• Regenerasi tanaman dengan metode

kultur protoplas merupakan metode

yang paling sulit.

• Setiap tanaman membutuhkan

modifikasi media dan penambahan ZPT

tertentu untuk meningkatkan peluang

keberhasilan kultur ini

(38)

• Regenerasi tanaman dengan metode

kultur protoplas merupakan metode

yang paling sulit.

• Setiap tanaman membutuhkan

modifikasi media dan penambahan ZPT

tertentu untuk meningkatkan peluang

keberhasilan kultur ini

• Protoplas biasanya diinkubasi pada

ruangan gelap selama beberapa hari

sebelum dipindahkan pada ruang

(39)

(40)

Metode Kultur Protoplas

• Metode kultur pada media agar

Metode ini dilakukan dengan cara

memekatkan konsentrasi protoplas

menjadi dua kali kerapatan media

Kemudian ditambahkan 1.2 % larutan

agar pada temperatur 40 oC, dan

dituangkan pada petridish

(41)

Metode kultur tetes

• Metode ini dilakukan dengan

mencampur protoplas pada media,

dengan meningkatkan kerapatan

protoplas menjadi dua kali kerapatan

medium

• Kemudian diteteskan pada medium

(42)

(43)