Penuntun Praktikum
BIOKIMIA
Untuk Prodi Biologi
Rini Puspitaningrum Supriyatin
Aprialiana L. Fitri
PROGRAM STUDI BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA
LAB BIOLOGI UNJ
i KATA PENGANTAR
Alhamdulillah dengan mengucap syukur atas rahmat dan kasih sayang Allah penyusunan buku “Penuntun Praktikum Biokimia” untuk mahasiswa Pendidikan Biologi dapat diselesaikan. Buku ini disiapkan sebagai pegangan mahasiswa jurusan biologi untuk melakukan praktikum di laboratorium Biokimia.
Buku ini berisi teknik dasar praktikum biokimia yang dilengkapi dengan berbagai teknik pengujian struktur dan fungsi biomolekul dalam tubuh. Sebagian besar teknik uji yang disusun dalam buku ini adalah hasil penelitian dibidang biokimia yang diaplikasikan di Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Jakarta sejak tahun 2012.’Dengan membaca buku penuntun praktikum dan mengikuti kegiatan praktikum biokimia, mahasiswa diharapkan dapat meningkatkan ketrampilan dalam berbagai pengujian dibidang biokimia dan meningkatkan pemahaman teori biokimia. Akhirnya keterampilan dan pemahaman biokimia yang diperoleh mahasiswa diharapkan dapat diterapkan dalam kehidupan sehari-hari baik dalam bidang pendidikan, penelitian dan kegiatan pelayanan kepada masyarakat.
Dosen tim MK Biokimia
LAB BIOLOGI UNJ
ii DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ...
DAFTAR ISI ... ii
DAFTAR GAMBAR ... ii
PENDAHULUAN... iii
PRAKTIKUM I. UJI BIOMOLEKUL ... 1
PRAKTIKUM II. ISOLASI DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) genom ... 6
PRAKTIKUM III. TEKNIK DETEKSI DNA ... 8
PRAKTIKUM IV. DETEKSI ENZIM DENGAN TEKNIK SPEKTROFOTOMETER... 10
PRAKTIKUM V. ANALISIS BERBAGAI LARUTAN JUS BUAH ... 14
PRAKTIKUM VI. UJI AKTIVITAS ENZIM ... 15
PRAKTIKUM VII. ISOLASI, PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEIN MIOGLOBIN ... 16
PRAKTIKUM VIII. ANALISIS KANDUNGAN BAHAN KIMIA TAMBAHAN PADA MAKANAN... 19
PRAKTIKUM IX. EKSTRAKSI DAN ANALISIS FITOKIMIA SECARA KUALITATIF ... 21
DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Grafik nilai serapan eluat (protein Ro tabung 13- 32) (λ 280 nm) ... 17
Gambar 2. Skema teknik imunodifusi Ouchterlony. ... 18
Gambar 3. Pola hasil uji imunodifusi Ouchterlony... 18
Gambar 4. Uji positif senyawa fenolat ... 22
Gambar 5. Uji positif senyawa triterpenoid ... 23
Gambar 6. Uji positif senyawa steroid ... 23
Gambar 7. Uji positif senyawa flavonoid ... 23
Gambar 8. Uji positif senyawa tanin ... 23
Gambar 9. Uji positif senyawa alkaloid ... 24
Gambar 10. Uji positif senyawa saponin ... 24
LAB BIOLOGI UNJ
iii PENDAHULUAN Deskripsi Mata Kuliah
Tujuan dari mata kuliah ini adalah untuk memahami struktur serta fungsi dan klasifikasi biomolekul di dalam tubuh. Mata kuliah ini membahas tentang struktur, fungsi dan klasifikasi berbagai biomolekul mahluk hidup. Termasuk di dalamnya kajian mengenai peran berbagai faktor fisik dan kimia yang mempengaruhi struktur, fungsi biomolekul dalam tubuh melalui berbagai teknik uji karakterisasi di laboratorium.
Pustaka Wajib
1. Bagian Biokimia FKUI. 1983. Penuntun Praktikum Biokimia. Jakarta.
2. Bagian Biokimia Jurusan Biologi, FMIPA, UI. Penuntun Praktikum Biokimia.
3. Bagian Biokimia FKUI. 1998. Penuntun Praktikum Biokimia Program Diploma II Bidan.
Jakarta.
4. Bagian Biokimia FKUI. 1998. Biokimia Eksperimen Laboratorium. Widya Medika. Jakarta.
5. Devlin, T.M. 1992. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlation 3rd.ed 3. New York:
Wiley Liss Publication.
6. Plummer D.T. 1979. An Introduction to Practical Biochemistry 2nd ed. Tata McGraw-Hill Publishing Company Ltd, New Delhi.
7. Boyer RF. 2005. Concepts in Biochemistry, 3rd Edition. Hope College publ.USA
8. Murray, RK Granner, DK, Mayes PA, and Rodwell, VW. 1996. Harper's Biochemistry 24th edition. Appleton & Lange, Stamford, UK.
9. Stryer, L. 1995. Biochemistry (4th ed). W.H.Freeman and Co., New York
10. D.L. Nelson and M.M.Cox . 2004. Lehninger : Principles of Biochemistry 4th ed. Palgrave Macmillan. USA.
Tata Tertib dan Peraturan Tata Tertib
1. Dilarang makan dan minum di dalam laboratorium, karena beberapa bahan kimia/biologis yang digunakan bersifat racun dan berbahaya bagi kesehatan.
2. Mahasiswa wajib menggunakan jas laboratorium.
3. Rambut harus diikat rapih dan tidak boleh tergerai.
4. Bila terjadi kontak dengan bahan-bahan berbahaya, korosi atau beracun, segera bilas dengan air sebanyak-banyaknya dan segera lapor ke asisten praktikum.
5. Menutup kembali bahan kimia yang disediakan dalam botol tertutup, untuk mencegah inhalasi bahan-bahan tersebut.
6. Dilarang menumpahkan bahan-bahan kimia di meja kerja atau pada lantai. Hal ini terutama berlaku untuk asam/basa pekat, dan segera laporkan kepada asisten praktikum.
7. Gunakan alat instrumen yang digunakan sesuai dengan cara kerja tanpa mengubah letak alat instrument yang ada. Dan mintalah bantuan asisten praktikum.
8. Berhati-hati bila bekerja denga bahan uji yang berasal dari bahan cairan tubuh seperti darah, air liur/saliva, urine karena memungkinkan bahan-bahan tersebut dapat terinfeksi kuman atau virus berbahaya.
Bila terdapat luka pada tangan, sebaiknya menggunakan sarung tangan sekali pakai.
Hindari kemungkinan tertusuk jarum.
Mencuci segera tangan atau anggota tubuh yang terpercik darah. Mencucinya dengan menggunakan sabun.
Membuang bahan yang mengandung darah dalam wadah plastik tertutup.
Mencuci alat-alat praktikum dengan sabun bila perlu disterilisasi dengan merendamnya dalam larutan hipoklorit 0.5 % selama 30 detik.
Peraturan
1. Wajib membuat piket kelompok yang bertanggung jawab terhadap kesediaan alat, bahan dan kebersihan setelah praktikum.
2. Bertanggung jawab terhadap alat yang digunakan selama praktikum, jika ada kerusakan wajib melapor ke asisten atau dosen pengampu dan mengganti sesuai spesifikasi alat tersebut.
LAB BIOLOGI UNJ
iv
3. Tidak diperbolehkan berbicara yang tidak perlu selama bekerja di lab jika didapatkan menganggu akan dikeluarkan dari ruang lab dan tidak diperbolehkan mengikuti praktikum.
4. Sebelum praktikum akan dilaksanakan pre test dan mahasiswa yang mendapat nilai pre test dibawah 60 tidak diijinkan untuk praktikum.
5. Kehadiran praktikum adalah 100%, jika tidak hadir dengan alasan apapun diharuskan lapor ke asisten atau dosen pengampu dan mengganti waktu praktikum serta menyelesaikan laporan secara individu.
6. Laporan kelompok dikumpulkan satu minggu setelah praktikum, jika terlambat kelompok tidak diperkenankan mengikuti praktikum selanjutnya.
Pentunjuk Pembuatan Laporan Praktikum Sistematika Penulisan
1. Ukuran kertas adalah A4 dengan batas margin atas dan kiri 4 cm serta margin kanan dan bawah 3 cm.
2. Spasi 1.5 dengan huruf times new roman 12.
3. Penulisan laporan mengikuti alur penulisan sebagai berikut:
A. Tujuan Praktikum B. Dasar Teori C. Alat dan Bahan D. Cara kerja E. Hasil Pengamatan F. Pembahasan G. Kesimpulan
H. Daftar Pustaka : - Berdasarkan ketentuan abjad - Minimal 5 kepustakaan wajib 4. Halaman pertama adalah halaman judul dengan penulisan sbb:
LAB BIOLOGI UNJ
v Penilaian laporan
Tujuan dan Tinjauan Pustaka 15%
Metodologi 5%
Hasil Pengamatan 15%
Pembahasan 40%
Kesimpulan 20%
Daftar Pustaka 5%
Sistem Penilaian
Evaluasi untuk praktikum biokimia meliputi:
1. Pre test 10%
2. Laporan praktikum 30%
3. Kehadiran 10%
4. Ujian Akhir 50%
Laporan Praktikum Biokimia (judul praktikum)
Oleh : Kelompok ...
(Nama anggota kelompok)
Program Studi/ angkatan Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Jakarta
Tahun
LAB BIOLOGI UNJ
1 PRAKTIKUM I.
UJI BIOMOLEKUL UJI KARBOHIDRAT
Tes Molish Tujuan
Membedakan karbohidrat dengan senyawa yang bukan karbohidrat.
Kajian Pustaka
Tes ini digunakan untuk mengetahui adanya karbohidrat. Karbohidrat dalam kondisi asam membentuk furfural dan turunannya, kemudian bereaksi dengan dua molekul α-naftol menghasilkan quinsid yang berwarna ungu.
Alat dan Bahan
1. Larutan Karbohidrat (Pati, Sukrosa, Laktosa, Glukosa, Lugol) 2. Larutan Molish
3. Asam Asetat Pekat Cara Kerja
1. Pipetkan 2 ml larutan karbohidrat ke dalam tabung reaksi yang bersih.
2. Tambahkan 3 tetes pereaksi Molish.
3. Masukkan 2 ml H2SO4 pekat (dari buret) ke dalam tabung, melalui dinding tabung yang dimiringkan.
4. Terbentuknya cincin ungu merupakan petunjuk adanya karbohidrat
5. Lakukan uji Molish terhadap beberapa sample, yaitu larutan pati, maltose, laktosa, sukrosa, dan glukosa.
Tes Fuchsin Tujuan
Mengetahui adanya gugus aldehid pada karbohidrat Kajian Pustaka
Pencampuran antara pereaksi Schiff dengan karbohidrat akan membentuk warna merah jambu.
Alat dan Bahan
1. Larutan karbohidrat (Pati, sukrosa, laktosa, glukosa, lugol) 2. Pereaksi schiif
Cara Kerja
Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 2 ml pereaksi Schiif, 1 tetes larutan karbohidrat dan kemudian dikocok. Terbentuknya warna merah jambu menunjukkan adanya gugus aldehid dalam karbohidrat yang diuji.
UJI PROTEIN
Uji Pengendapan Protein: pengendapan protein oleh logam berat Tujuan
1. Untuk memperlihatkan bahwa logam berat seperti timah hitam (Pb) dan air raksa (Hg) dapat menganggu sifat protein, antara lain kelarutannya, sehingga protein tidak dapat berfungsi lagi dan mengendap.
2. Untuk membuktikan bahwa logam berat dapat berfungsi sebagai antiseptik untuk membunuh bakteri.
Kajian Pustaka
Logam berat akan mendenaturasikan dan mengendapkan protein. Peristiwa itu terjadi bila berbagai gugus di permukaan molekul protein bermuatan negatif, sehingga membentuk garam dengan kation logam berat. Jumlah protein yang diendapkan sebanding dengan jumlah logam berat yang ditambahkan. Endapan terus terjadi selama dalam larutan uji masih terdapat protein.
LAB BIOLOGI UNJ
2 Alat dan Bahan
1. Larutan putih telur 2. Susu
3. Larutan HgCl2 1%
4. Larutan Pb-asaetat Cara Kerja
1. Pipetkan 1 mL larutan putih telur ke dalam suatu tabung reaksi
2. Tambahkan larutan Pb-asaetat tetes demi tetes. Perhatikan dan catat perubahan yang terjadi pada penambahan tiap tetes pereaksi.
3. Ulangi percobaan dengan menggunakan larutan HgCl2. UJI LIPID
Uji kelarutan Tujuan
Memperlihatkan bahwa lemak tidak larut dalam air dan hanya larut dalam pelarut organik.
Kajian Pustaka
Molekul lemak berinteraksi dengan molekul pelarut organik.
Alat dan Bahan
1. Gajih atau minyak goreng 2. Aquades
3. Eter
4. Kloroform 5. Aseton 6. Toluen Cara Kerja
PERHATIAN SELAMA PRAKTIKUM BERLANGSUNG DILARANG MENYALAKAN API ! 1. Tempatkan sejumlah kecil lemak dalam tabung reaksi.
2. Tambahkan air, kemudian kocok kuat-kuat. Lihat dan laporkan, larut atau tidak dan apakah kedua bahan tersebut terpisah kembali bila didiamkan.
3. Ulangi percobaan dengan air mendidih, aseton, eter, kloroform, dan toluen.
LAB BIOLOGI UNJ
3 Uji Emulsi Lipid
Tujuan
Memperlihatkan bahwa minyak dan air dapat dicampur secara merata dan stabil dalam bentuk emulsi, dengan bantuan suatu bahan pengemulsi.
Kajian Pustaka
Kebanyakan lipid larut dalam etanol 95%, akan tetapi membentuk suatu emulsi apabila ke dalamnya ditambahkan beberapa tetes air. Emulsi yang terbentuk mempunyai penampilan seperti susu. Teknik ini sangat sensitif untuk digunakan sebagai tes lemak.
Alat dan Bahan 1. Aquades 2. Minyak kelapa
3. Bahan pengemulsi, dalam hal ini sabun bubuk.
Cara Kerja
1. Satu volume aquades dicampur dengan 1 volume minyak kelapa dalam suatu tabung reaksi.
2. Kocok kuat-kuat sehingga terbentuk emulsi yang keruh.
3. Diamkan dan catat, apakah emulsi tersebut terpisah kembali menjadi 2 carian berbatas tegas.
4. Ulangi percobaan dengan menambahkan sedikit sabun. Lihat dan catat, apakah emulsi yang terjadi stabil, artinya tidak terpisah kembali bila didiamkan.
VITAMIN
Uji Vitamin sebagai antioksidan Tujuan
Mengetahui sifat antioksidan yang terdapat pada buah-buahan.
Kajian Pustaka
Vitamin adalah senyawa organik yang terdapat dalam makanan dan dibutuhkan untuk pertumbuhan yang normal. Vitamin tidak menghasilkan energi.
Vitamin Larut dalam Air
Vitamin Sumber Makanan Utama Beberapa Fungsi Utama dalam Tubuh
Vitamin B1 (tiamin) Daging, polong-polongan, kacang
tanah, biji-bijian utuh Koenzim yang digunakan dalam pengeluaran CO2 dari senyawa organik Vitramin B2 (riboflavin) Produk susu, daging, biji-bijian dan
sayuran Komponen koenzim FAD dan FMN
Niasin Kacang-kacangan, daging, biji-bijian Komponen koenzim NAD+ dan NADP+ Vitamin B6 (piridoksin) Daging, sayuran dan biji-bijian utuh Koenzim yang digunakan dalam
metabolisme asam amino Asam pantotenat Sebagian besar makanan, daging,
produk susu, biji-bijian utuh, dll
Komponen koenzim A Asam folat (folasin) Sayuran hijau, jeruk, kacang, polong-
polongan, biji-bijian utuh (juga dibuat oleh bakteri kolon)
Koenzim dalam metabolisme asam nukleat dan asam amino
Vitamin B12 Daging, telur, produk susu Koenzim dalam metabolisme asam
nukleat dan asam amino
Biotin Polong-polongan, sayuran dan daging Koenzim dalam sintesis lemak, glikogen, dan asam amino
Vitamin C jeruk, brokoli, kol, tomat, cabe hijau Digunakan dalam sintesis kolagen (tulang sejati, tulang rawan, gusi);
antioksidan; membantu detoksifikasi;
membantu peyerapan besi Vitamin Larut dalam Lemak
Vitamin Sumber Makanan Utama Beberapa Fungsi Utama dalam Tubuh
Vitamin A Provitamin A (β-karoten) dalam
sayuran dan buah hijau gelap dan orange gelap; retinol dalam produk susu
Komponen pigmen visual (penglihatan); diperlukan untuk pemeliharaan jaring-an epithelium;
antioksidan; membantu mencegah keru-sakn lipid membran sel
LAB BIOLOGI UNJ
4
Vitamin D Produk kuning susu, kuning telur (juga
dibuat dalam kulit manusia dengan kehadiran cahaya matahari)
Membantu penyerapan dan penggunaan kalsium dan fosfor;
meningkatkan per-tumbuhan tulang sejati
Vitamin E (tokoferol) Minyak nabati, kacang-kacangan, biji-
bijian Antioksidan; membantu mencegah
kerusakan lipid membran sel Vitamin K (filokuinon) Sayuran hijau, teh (juga dibuat oleh
bakteri kolon) Penting dalam penggum-palan darah
Alat dan Bahan
Larutan asam askorbat 1% (1g/100mL) dan apel.
Cara Kerja
1. Siapkan 2 gelas kimia.
2. Isi gelas kimia pertama dengan larutan vitamin C dan gelas kimia kedua dengan aquades.
3. Tempatkan potongan apel yang dikupas kulitnya dalam tiap gelas kimia.
4. Perhatikan adanya bintik-bintik hitam pada potongan apel dalam aquades, yang tidak ada pada apel yang direndam dalam larutan vitamin C.
Uji vitamin sebagai inhibitor enzim polifenol oksidase Tujuan
1. Mengetahui proses oksidasi senyawa fenol oleh polifenol oksidase (PPO) di dalam kentang.
2. Mengetahui efek anti oksidan vitamin C terhadap oksidasi fenol oleh PPO.
Kajian Pustaka
Fenol yang terdapat dalam kentang akan dioksidasi oleh PPO menjadi katekol yang kemudian menjadi kinon, dan selanjutnya melalui kondensasi membentuk senyawa berwarna coklat.
PPO juga mengubah pirogalol menjadi purpurogalin yang berwarna coklat. Penambahan vitamin C (asam askorbat) dapat menghambat oksidasi fenol oleh PPO karena asam askorbat dioksidasi menjadi dehidroaskorbat.
Alat dan Bahan
1. Ekstrak kentang 2. Larutan fenol 1%
3. Larutan Pirogalol 1%
4. Larutan vitamin C Cara Kerja
Bahan Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 Tabung 4
Ekstrak kentang 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
Lar. Vitamin C - 10 tetes - 10 tetes
Lar. Fenol 1% 10 tetes 10 tetes - -
Lar. Pirogalol 1% - - 10 tetes 10 tetes
Kocok Tabung Hasil:
Perhatikan warna yang terbentuk
MINERAL
Pengujian Filtrat Tujuan
Membuktikan bahwa mineral dapat mengendap dalam larutan asam.
Kajian Pustaka
Mineral adalah semua unsur kimia yang terkandung dalam jaringan tubuh kecuali karbon, hidrogen, oksigen, dan nitrogen. Mineral dibagi menjadi 2 golongan, yaitu esensial dan non esensial.
LAB BIOLOGI UNJ
5
Berdasarkan jumlahnya, mineral dikelompokkan ke dalam kelompok mayor atau makro, kelompok minor atau mikro dan kelompok renik (trace element).
Kelompok makro terdiri dari unsur-unsur Ca, P, K, Na,Cl,Mg dan S. Kelompok mikro terdiri dari Fe, I, Cu, Zn, Mn, Co, dan Se. Kelompok renik terdiri dari F, Mo, As, Cr, Si dan lain-lain. Beberapa unsur mineral ini ada yang termasuk golongan racun dan biasanya masih terdapat didalam sel meskipun jumlahnya sangat kecil, misalnya Ag, Hg, dan Pb.
Perendaman tulang dalam larutan asam atau pemanasan tulang dalam air akan menyebabkan terlarutnya bahan anorganik. Sisanya merupakan pembentuk matriks tulang yaitu yang terdiri atas air dan bahan organik.
Alat dan Bahan
1. Filtrat yang telah direndam dalam larutan asam (selama 1 minggu) 2. Larutan HNO3 10%
3. Larutan AgNO3 2%
4. Larutan HCl 10%
5. Larutan BaCl2 2%
6. Larutan asam asetat 10 %
7. Amonium Oksalat 1%
Cara Kerja
Uji Klorida
Sebagian filtrat diasamkan dengan larutan HNO3 10% (gunakan lakmus). Ke dalam filtrat asam tersebut tambahkan larutan AgNO3 2%. Endapan putih yang terbentuk menunjukkan adanya klor.
Uji Sulfat
Sebagian filtrat diasamkan dengan larutan HCl 10% (gunakan lakmus). Ke dalam filtrat asam tersebut tambahakan larutan BaCl2 2%. Endapan putih yang terbentuk menunjukkan adanya sulfat.
Uji Kalsium
Sebagian filtrat disaring. Tambahkan larutan asam asetat 10 % pada endapan yang terdapat pada kertas saring. Tempatkan filtrat hasil pencucian endapan di dalam gelas piala dan sesuaikan jumlahnya untuk pengujian. Kemudian ke dalam 2 ml filtrat tambahkan 1 ml ammonium oksalat 1%.
Endapan putih terbentuk menunjukkan adanya kalsium.
LAB BIOLOGI UNJ
6 PRAKTIKUM II.
ISOLASI DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) genom Isolasi DNA genom dari akar rambut/bulu
Tujuan
Mempelajari prinsip dan teknik isolasi DNA genom dari bulbus akar rambut/bulu.
Kajian Pustaka
DNA dapat ditemukan dalam semua sampel biologis yang mengandung sel berinti, seperti akar rambut, darah, tulang, saliva, daun, dan lain-lain. Untuk memperoleh DNA diperlukan pertimbangan pemilihan jenis jaringan sebagai sumber DNA. Pertimbangan pertama adalah bahwa perolehan jenis jaringan sumber DNA harus diambil melalui teknik yang non ivasif untuk tujuan meminimalisasi kesakitan suatu organisme yang diambil jaringannya sebagai sampel.
DNA suatu organisme dapat diidentifikasi dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) atau menggunakan enzim endonuklease restriksi (DNA fingerprinting/RFLP). Hasil analisis DNA dapat digunakan untuk diagnosis penyakit infeksi, mendeteksi adanya mutasi gen, menentukan jenis kelamin, hubungan kekerabatan untuk tumbuhan dan hewan. Analisis DNA dapat digunakan sebagai alat bantu di bidang kedokteran dan kriminologi, misalnya untuk identifikasi teroris ataupun kasus bayi tertukar.
Alat dan Bahan a. Alat
1. Tabung mikro 2. Pipet mikro dan tip 3. Inkubator
4. Gunting b. Bahan
1. Bulbus akar rambut/bulu 2. Larutan pengisolasi DNA – MBC 3. Akuabides
Cara Kerja
1. Masukkan 6 helai bulbus akar rambut/bulu yang sama asalnya dan dipotong sekitar 0,5-1cm dari bawah termasuk akarnya kemudian tempatkan pada tabung mikro 1,5mL yang telah berisi 50uL larutan pengisolasi DNA MBC untuk isolasi DNA.
2. Menginkubasikan dalam penangas air 55o C selama 1 jam. Kemudian inkubasikan dalam penangas air 95o C selama 10 menit.
Isolasi DNA genom Buah Tujuan
Mempelajari prinsip dan teknik isolasi DNA genom menggunakan bahan dapur.
Kajian Pustaka
DNA (DeoxyriboNucleic Acid) yang merupakan asam nukleat pembawa pesan genetik dalam kehidupan. Informasi genetik terletak di dalam sel dan tersusun rapi membentuk kromosom. Pola DNA penyusun kromosom inilah yang menentukan jenis rambut, warna kulit dan sifat-sifat khusus yang berbeda antara satu individu dengan lainnya. Karena perbedaan DNA yang dimiliki oleh seseorang inilah maka metode sidik DNA menjadi salah satu alat pembuktian yang cukup handal saat ini.
DNA ditemukan pertama kali pada tahun 1869. Melalui teknologi X-ray diketahui bahwa DNA memiliki struktur yang tertata secara rapi dan memiliki model rantai ganda DNA yang dipublikasikan oleh Watson dan Crick di jurnal Nature pada tahun 1953. Sejak itu, teknik pemurnian DNA mengalami perkembangan yang pesat dan menjadi prosedur rutin yang dilakukan didalam penelitian bioteknologi.
DNA terletak didalam sel. Oleh karena itu untuk mendapatkan DNA diperlukan tahap khusus yang biasanya dilakukan di laboratorium tertentu. Untuk mengeluarkan DNA dari sel maka teknik pemurnian DNA secara biokimia dilakukan dengan cara merusak dinding sel menggunakan larutan bufer tententu dan berbagai jenis deterjen. Dengan terbukanya lapisan sel maka DNA dapat dikeluarkan dan diendapkan dengan penambahan alkohol.
LAB BIOLOGI UNJ
7
Cara memisahkan endapan gumpalan DNA dari bagian lainnya adalah dengan teknik sentrifugasi pada kekuatan dan waktu tertentu. Dengan terus berkembanganya teknik ini maka saat ini kita bisa membeli kit pengisolasi DNA. Namun, kit tersebut memiliki harga yang tidak murah dan memerlukan alat-alat tambahan untuk menjamin akurasi tahap pemurnian DNA, misalnya pipet mikro, filter dan tentu saja sentrifuge, maka proses pemurnian DNA kini belum bisa dilakukan pada sebarang laboratorium apalagi dijadikan materi praktikum bagi mahasiswa dan juga siswa SMA.
Sementara itu tuntutan ketrampilan untuk melakukan isolasi DNA genom sebagai penunjang memahami teori DNA menjadi sangat penting. Keadaan ini mendorong kreativitas para ilmuwan untuk merancang teknik pemurnian DNA genom dengan alat dan bahan yang murah dan sederhana, bahkan bisa dilakukan dengan alat dan bahan yang biasa tersedia di dapur rumah kita. Inovasi ini membuka peluang untuk memperkenalkan teknik pemurnian DNA genom kepada siswa secara dini, bahkan bisa dilakukan bagi mereka yang masih duduk di bangku sekolah dasar sekalipun dengan dipandu oleh anggota keluarga yang sudah pernah melakukannya.
Beberapa bahan yang diperlukan untuk pemurnian DNA genom secara sederhana terdiri dari bahan sumber DNA genom, air, sabun cuci piring, nanas, alkohol 95 %. Selain bahan sederhana tersebut, alat yang diperlukan juga sangat sederhana yaitu sendok makan, sendok teh, sendok atau tusuk es kream dari kayu, botol transparan dan termometer. Bahan sumber DNA genom yang akan dimurnikan bisa berasal dari apa saja, karena semua bagian makhluk hidup mengandung DNA genom sehingga bisa menggunakan apa saja misalnya daging, hati ayam, kedelai, kacang hijau, brokoli dan lain-lain.
Alat dan Bahan
Sendok makan, sendok teh, lumpang dan alu/blender, sendok atau tusuk es kream dari kayu, botol, transparan dan termometer.
Sampel sumber DNA genom : daging, hati ayam, kedelai, kacang hijau, brokoli dll, Air, sabun cuci piring, jus nanas, alkohol 95 %.
Cara Kerja
1. Hangatkan air sampai sekitar 60o C, ambil 1 sendok teh wheat germ dan masukkan ke dalam botol plastik, tambahkan 1.5 sendok makan air hangat dan kocok hingga kurang lebih 3 menit. Bila sampel yang digunakan adalah daging atau hati maka haluskan bahan tersebut dengan menggunakan penghancur daging (ditumbuk/haluskan dengan blender) hingga halus.
2. Setelah tampak tercampur dan sebagian larut, tambahkan setengah sendok teh deterjen cair. Campurkan deterjen itu dengan cara membolak-balikan botol secara perlahan tapi sempurna, setiap setengah menit sekali selama 5 menit. Hilangkan busa dengan cara menghisapnya dengan tisue. Bila sumber DNA genom adalah hati atau daging maka setelah penambahan deterjen juga dilakukan penambahan jus nanas segar setengah sendok makan, kemudian dicampur secara perlahan dan merata.
3. Siapkan alkohol 95 % dengan volume kira-kira sama dengan larutan pada tahap 2 dan juga dalam botol yang kira-kira ukurannya sama. Miringkan botol berisi campuran yang sudah tercampur, secara perlahan tambahkan alkohol 95 % dengan cara mengalirkannya pada dinding botol tersebut sampai kira-kira total volumenya menjadi 2 kali. Pada tahap ini tidak dibolehkan mencampur secara keras dan tidak boleh diaduk. Setelah semua alkohol dituang kedalam botol yang berisi campuran bahan DNA genom, air dan deterjen, maka akan terbentuk lapisan antara alkohol dengan lainnya yang tidak bercampur. Perhatikan secara seksama pada batas kedua lapisan cairan dalam tabung. Lapisan putih yang terbentuk adalah DNA genom.
CATATAN:
1. DNA genom dapat diwarnai dengan acetocarmin dan diperiksa di bawah mikroskop.
2. Sifat asam DNA genom dapat diketahui dengan cara mengukurnya menggunakan larutan indikator Universal.
3. Pekerjaan ini dapat dilakukan untuk sampel jaringan lunak hewan (misalnya telur ikan, daging, hati dll) atau mikroorganisme.
LAB BIOLOGI UNJ
8 PRAKTIKUM III.
TEKNIK DETEKSI DNA Deteksi DNA dengan Teknik Spektrofotometri Tujuan
Mendeteksi DNA yang telah di isolasi dengan teknik spektrofotometri dan Mengetahui nilai konsentrasi, jumlah dan indeks kemurnian DNA
Kajian Pustaka
Teknik spektrofotometri
Konsentrasi DNA dalam larutan dihitung dengan menggunakan spektrofotometer, dengan mengingat, bahwa 50ug/mL DNA untai ganda mempunyai kerapatan optik 1,0 pada 260nm.
Penghitungan sebaiknya dilakukan in duplo pada OD 260nm dan 280nm, untuk mengetahui indeks purifikasi, yaitu OD260/280 = 1,75 - 1,80. Bila pada penghitungan didapatkan nilai kurang dari 1,75, maka proses ekstraksi dengan fenol harus diulang. Sebagai contoh, dari 10mL darah akan dapat diperoleh 100-700ug DNA.
Konsentrasi DNA dapat ditentukan dengan cara mengukur nilai serapan cahaya (A) dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260nm. Nilai perkiraan konsentrasi DNA dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
DNA ug/mL = A260 x 50ug/mL : C Keterangan :
A260 = Serapan cahaya pada panjang gelombang 260nm
50 = 50uL/mL DNA untai ganda yang mempunyai kerapatan optik ( Optical Density OD )1,0 pada panjang gelombang 260nm.
C = Konsentrasi DNA yang ada dalam kuvet
Untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA harus dilakukan pengukuran nilai serapan cahaya protein pada panjang gelombang 280nm. Selanjutnya, tingkat kemurnian DNA dapat ditentukan dengan menggunakan rumus :
Kemurnian DNA = A260 : A280 Keterangan :
A260 = Serapan cahaya pada panjang gelombang 260nm A280 = Serapan cahaya pada panjang gelombang 280nm Alat dan Bahan
1. Spektrofotometer 2. DNA sampel 3. Aquabidest Cara Kerja
a. Isi kuvet dengan 1 mL akuades
b. Masukkan 1 – 5uL DNA yang akan dihitung ke dalam kuvet. Kocok perlahan c. Ukur serapan DNA pada panjang gelombang 260nm (A260)
d. Pada A260 = 1, konsentrasi DNA adalah 50ug/mL 𝑲𝒐𝒏𝒔𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒔𝒊 𝑫𝑵𝑨 (𝒖𝒈
𝒎𝒍) = 𝑨𝟐𝟔𝟎 𝒙 𝟓𝟎 𝒖𝒈. 𝒎𝒍
𝑷𝒆𝒏𝒈𝒆𝒏𝒄𝒆𝒓𝒂𝒏 𝑱𝒖𝒎𝒍𝒂𝒉 𝑫𝑵𝑨 (𝒖𝒈)𝒚𝒂𝒏𝒈 𝒅𝒊𝒕𝒂𝒎𝒃𝒂𝒉𝒌𝒂𝒏 (𝒎𝑳) Menentukan kemurnian DNA
1. Ukur serapan protein pada panjang gelombang 280nm (A280) 2. Kemurnian DNA ditentukan dengan indeks kemurnian
CATATAN:
Indeks kemurnian = A260/A280
DNA murni bila indeks kemurnian > 1,75
LAB BIOLOGI UNJ
9
Deteksi DNA secara visual menggunakan teknik elektroforesis Tujuan
Untuk mendeteksi DNA sampel dengan teknik elektroforesis Kajian Pustaka
Prinsip teknik elektroforesis adalah berdasarkan migrasi partikel bermuatan di bawah pengaruh medan elektronik pada kondisi yang konstan. Oleh karena setiap nukleotida dalam molekul DNA memiliki muatan negatif, maka panjang suatu molekul DNA dapat ditetapkan dengan teliti menggunakan teknik elektroforesis yang memisahkan molekul berdasarkan berat molekul. Panjang suatu molekul DNA yang sedang diteliti dapat diketahui dengan cara membandingkannya dengan standar berat molekul DNA tertentu
Metoda pemisahan DNA dengan elektroforesis ini secara luas digunakan untuk tujuan analitik dan preparatif. Untuk analisis pemisahan molekul DNA dengan ukuran kurang dari 500 nukleotida umumnya dilakukan dengan menggunakan gel poliakrilamid, karena pori-pori gel poliakrilamid lebih kecil dari molekul DNA yang melewatinya. Sedangkan pori-pori yang lebih besar dimiliki oleh gel agarose yang dapat digunakan untuk analisis molekul DNA yang lebih besar ukuran pori-pori gel poliakrilamid sangat dipengaruhi oleh konsentrasi akrilamid total pada saat polimerisasi.
Keefektifan ukuran pori-pori akan menurun sesuai dengan rendahnya konsentrasi akrilamid.
Konsentrasi gel yang digunakan dapat disesuaikan dengan ukuran bahan uji yang akan dianalisis melalui pengukuran mobilitas sampel. Misalnya, konsentrasi gel akrilamid 2,5% dapat digunakan untuk berat molekul sekitar 106, kira-kira untuk agarose adalah sebesar 5%. Gel poliakrilamid 30%
dapat digunakan untuk berat molekul kurang dari 2000 Dalton.
Gel poliakrilamid dibuat dengan cara mereaksikan monomer akrilamid ke dalam rantai panjang dan ikatan silang senyawa bifungsional NN methylene bisakrilamid, bereaksi dengan gugus fungsional bebas pada rantai termini. Polimerisasi akrilamid diinisiasi oleh penambahan amonium persulfat (APS). Penambahan N,N,N,N-tetrametiletilendiamida (TEMED) dilakukan untuk mempercepat proses polimerisasi. Peningkatan TEMED akan meningkatkan laju polimerisasi.
Molekul DNA pada gel agarose atau gel poliakrilamid tidak tampak sebelum DNA ditandai dengan pewarna. Satu metoda sensitif pewarnaan DNA adalah dengan mereaksikan dengan pewarna etidium bromida, yang dapat berfluoresensi di bawah sinar ultra violet pada saat mengikat DNA. Metoda lain yang lebih sensitif adalah menggunakanan radioisotop P32 yang diikorporasikan ke dalam molekul DNA sebelum di elektroforesis. Radiosiotop ini digunakan sebagai petanda yang masuk ke fosfat DNA dan energi emisi partikel beta dapat secara mudah dideteksi secara autoradiografi.
Alat
1. Alat elektroforesis horizontal dan sisir pembentuk sumur pada gel.
2. Pemasok daya
3. Transiluminator dan sinar ultra violet Bahan
1. Bubuk gel agarose
2. Larutan etidium bromida10mg/mL 3. Penanda DNA
4. Tris (Hydroxymethyl) aminomethan Cara Kerja
Pembuatan gel agarose 1%
Seratus mililiter larutan dapar TAE 1X (50mM Tris-HCl, 20mM Na-asetat, 2mM EDTA pH 7,2) mengandung 1 gram bubuk gel agarose dipanaskan hingga larut. Setelah agak dingin, tuang larutan gel agarose tersebut ke dalam cetakan. Selanjutnya, setelah terbentuk gel dan sumur-sumurnya, wadah kiri dan kanan diisi dengan larutan dapar TAE 1x sebagai larutan elektrolit. Masukkan ke dalam sumur, 1ug sampel DNA dicampur larutan zat pewarna 1x (2% sukrosa, 0,01% biru bromfenol dalam 10mL dapar TAE 1x pH 7,2). Hubungkan ke pemasok daya dan nyalakan pada tegangan 100 volt selama 2 jam. Setelah selesai, gel agarose direndam dalam larutan etidium bromida 0.5ug/mL15 menit dan rendam sebanyak 2 kali dangan akuades sampai bersih. DNA genom dianalisis di atas transiluminator- sinar ultra violet.
LAB BIOLOGI UNJ
10 PRAKTIKUM IV.
DETEKSI ENZIM DENGAN TEKNIK SPEKTROFOTOMETER Tujuan
1. Menentukan panjang gelombang dengan serapan maksimum.
2. Membuktikan hukum Beer-Lambert.
3. Penentuan kadar larutan yang tidak diketahui.
Kajian Pustaka
Teknik spektrofotometri telah lama digunakan sebagai suatu Teknik yang handal untuk deteksi, identifikasi dan pengukuran kadar senyawa kimia dalam suatu larutan.
Bahan kimia dapat menyerap dan menghantarkan cahaya. Suatu larutan mempunyai warna tertentu karena larutan ini dapat menyerap semua warna kecuali warna yang dapat ditangkap oleh mata. Contohnya suatu larutan berwarna merah, karena larutan itu menyerap cahaya pada daerah kuning – biru, sedangkan cahaya pada panjang gelombang warna merah akan diteruskan sehingga dengan mata tampak berwarna merah.
Spektrum cahaya yang dapat dilihat oleh mata terentang antara 400 nm – 800 nm. Pada Teknik spektrofotometri, cahaya dari sumber cahaya diuraikan dengan menggunakan prisma sehingga diperoleh cahaya monokromatis yang diserap oleh zat yang akan diperiksa. Cahaya monokromatis merupakan cahaya satu warna dengan satu panjang gelombang, sehingga cahaya yang diserap oleh larutan berwarna dapat diukur.
Hubungan antara konsentrasi dengan cahaya yang diserap dinyatakan dalam hukum Beer- Lambert.
Hukum Beer-Lambert:
Pengurangan intensitas cahaya monokromatis yang melalui suatu larutan berwarna berlangsung secara eksponensial dan tergantung pada panjang larutan yang dilalui cahaya dan kadar zat dalam larutan.
Hukum Beer-Lambert menghasilkan persamaan sebagai berikut:
𝐿𝑜𝑔 𝐼 =𝑘𝑐𝑙 Keterangan : 𝐼𝑜
Io = intensitas cahaya masuk I = intensitas cahaya keluar
k = konstanta yang didasarkan pada sifat-sifat zat dalam larutan c = konsentrasi zat tersebut
l = panjang larutan yang dilalui cahaya
Perbandingan I/Io disebut sebagai transmisi sinar (T) dan dinyatakan dalam persen (%).
Serapan (absorbance) = A atau disebut juga kerapatan optik (optical density) = OD, merupakan istilah yang lebih sering digunakan dan berasal dari persamaan:
A = -log T Jadi A = k c l
Pada alat spektrofotometer, sinar yang datang adalah sinar monokromatis sedangkan sinar- sinar lainnya tertahan dalam dinding kuvet. Jalur sinar pada setiap bagian kuvet adalah sama, oleh karena itu dapat dihitung nilai k untuk berbagai senyawa dalam berbagai larutan dan berbagai panjang gelombang. Bila konsentrasi dinyatakan dengan mol per liter dan jarak tempuh cahaya dalam cm, maka nilai k disebut sebagai koefisien ekstingsi molar (εm) yaitu serapan (absorbancy) 1 M suatu larutan dan jarak tempuh cahaya 1 cm.
Ԑ = 𝐸𝑘𝑠𝑡𝑖𝑛𝑔𝑠𝑖 𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 (𝑚𝑜𝑙𝑎𝑟)
E1cm1% adalah koefisien ekstingsi untuk larutan 1% (1 g/100mL atau 10 mg/mL) dan jarak tempuh cahaya 1 cm. Koefisien ekstingsi dapat dilihat pada tabel beberapa buku tertentu (a.l.
Merck’s Index).
Hukum Beer-Lambert adalah :
A = k c l
Bila kita melakukan beberapa pemeriksaan maka persamaan menjadi : A1 = k c1 l
LAB BIOLOGI UNJ
11 A2 = k c2 l A1/A2 = c1/c2
C1 = A1/A2 x c2
Bila c2 kita ketahui kadarnya (sebagai standar), maka c1 dapat kita tentukan kadarnya. Jadi dengan menentukan A dari masing-masing larutan dengan hanya menggunakan satu standar dapat kita tentukan kadar dari tabung-tabung lainnya. Dengan membuat serangkaian larutan standar dapat juga dibuat suatu kurva kalibrasi standar. Kadar bahan yang tidak diketahui dengan demikian dapat ditentukan dari kurva standar tersebut dengan menggunakan perhitungan regresi linier. Hal ini dilakukan dengan pengukuran sampel yang sangat banyak.
Pada penetapan kadar zat dalam darah atau urin akan terjadi pengenceran dari bahan- bahan yang diperiksa dengan berbagai pereaksi, maka dari persamaan di atas dapat dikembangkan persamaan berikut:
Untuk zat dalam darah/serum:
Ru Vu 100 Cu (g/dL) = _____ x Cs x ____ x __________________________
Rs Vs mL serum yang dianalisis Untuk zat dalam urin:
Au Vu volume urin 24 jam Cu = _____ x Cs x ____ x __________________________
As Vs volume urin yang dianalisis Keterangan :
Cu = kadar bahan yang akan ditentukan Au = serapan bahan yang diperiksa As = serapan standar
Cs = kadar standar
Vu = volume bahan yang diperiksa Vs = volume standar yang dipakai
Pada umumnya Vu = Vs sehingga Vu/Vs bisa dihilangkan. Hal-hal yang perlu diperhatikan selama pemeriksaan:
1. Pada tiap pemeriksaan jangan lupa menutup tempat kuvet.
2. Tabung kuvet yang akan dibaca harus dalam keadaan bersih.
3. Bila pada dinding tabung kuvet terdapat udara, hilangkan dengan menjentik-jentik tabung dengan jari.
4. Jangan sampai menumpahkan cairan yang diperiksa ke dalam lubang tempat kuvet atau pada alat.
5. Pastikan bahwa larutan yang akan diperiksa sudah tercampur dengan baik sebelum dilakukan pengukuran.
6. Pengukuran selalu dikerjakan dalam duplo.
7. Untuk penetapan pada panjang gelombang yang berbeda pada tiap panjang gelombang (λ) alat harus ditera dengan aquades (A harus menunjuk angka 0).
Penentuan panjang gelombang dengan serapan maksimum Tujuan
Menentukan panjang gelombang dengan serapan maksimum.
Kajian Pustaka
Suatu zat berwarna menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu.
Alat dan Bahan
1. Spektrofotometer 2. Kuvet
3. Larutan jus nenas segar (1 mL jus nenas segar diencerkan dengan amonia encer sampai mencapai volume 500 mL).
LAB BIOLOGI UNJ
12 Cara Kerja
1. Sediakan 2 tabung kuvet, pada tabung 1 masukkan 5 mL aquades (sebagai blanko) dan pada tabung 2, masukkan 5 mL larutan jus nenas.
2. Baca serapan larutan itu pada panjang gelombang antara 500 – 600 nm dengan interval 10 nm. Perhatikan bahwa pada setiap pembacaan pada suatu panjang gelombang alat ditera dengan blanko yang berisi aquades (A = 0 atau T = 100%).
3. Buatlah kurva dengan panjang gelombang sebagai sumbu x dan A sebagai sumbu y.
Hubungan serapan dengan kadar zat dalam larutan Tujuan
Membuktikan hukum Beer-Lambert.
Kajian Pustaka
Jumlah cahaya yang diserap oleh suatu larutan pada panjang gelombang tertentu sebanding dengan kadar zat pada larutan. Bila hukum Beer-Lambert ini diikuti oleh larutan tersebut, maka kurva hubungan serapan (A) dengan kadar zat akan merupakan garis lurus.
Alat dan Bahan
1. Spektrofotometer Spectronic-20 2. Kuvet
3. Larutan jus nenas segar 4. Pipet
5. Labu volumetrik 100 Ml 6. 6 tabung reaksi
7. Kertas grafik Cara Kerja
1. Encerkan 1 mL larutan jus nenas dingin dalam labu volumetrik menjadi 500 mL dengan larutan ammonia encer (4 mL ammonia pekat dalam 1 L aquades). Kocok dengan membalik- balikkannya.
2. Pipetkan ke dalam 6 buah tabung reaksi masing-masing0,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 dan 10 mL larutan jus nenas-amonia tersebut. Kemudian tambahkan ammonia encer pada ke enam tabung berturut-turut 10,0; 8,0; 6,0; 4,0; 2,0; 0,0 mL.
3. Kemudian baca serapan masing-masing tabung dengan menggunakan tabung 1 sebagai blanko pada panjang gelombang maksimum yang didapat pada percobaan 1.
4. Buatlah kurva pada selembar kertas grafik dengan A (serapan) sebagai sumbu y dan pengenceran sebagai sumbu x.
Penentuan kadar suatu larutan Tujuan
Menentukan kadar suatu larutan yang belum diketahui.
Kajian Pustaka
Kadar suatu zat dapat diketahui dengan membandingkannya dengan kadar standar.
Alat dan Bahan
1. Spektrofotometer 2. Kuvet
3. 3 buah tabung reaksi 4. Pipet
5. Kertas grafik
6. Larutan larutan jus nenas (U1, U2, U3) Cara Kerja
1. Siapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering.
2. Isilah tabung pertama dengan 5 mL larutan U1.
LAB BIOLOGI UNJ
13 3. Isilah tabung kedua dengan 5 mL larutan U2.
4. Isilah tabung ketiga dengan 5 mL larutan U3.
5. Baca serapan dan hitung kadar larutan U1, U2, dan U3 berdasarkan kurva standar yang saudara buat pada percobaan 2.
LAB BIOLOGI UNJ
14 PRAKTIKUM V.
ANALISIS BERBAGAI LARUTAN JUS BUAH Tujuan
Untuk memeriksa kadar pati, pektin dan stabilitas berbagai larutan jus buah Kajian Pustaka
Sari buah biasanya masih mengandung partikel padat. Partikel tersebut perlu dihilangkan agar mendapatkan sari buah yang jernih. Penghilangan partikel padat dalam sari buah dapat dilakukan dengan penyaringan, pemisahan dengan cara didiamkan beberapa waktu (akan terjadi pengendapan partikel padat dari larutannya karena adanya gaya gravitasi partikel padat), kemudian dapat diambil bagian jernihnya. Selain itu, penyaringan sari buah dapat dilakukan dengan menggunakan kain atau kertas saring. Beberapa cara yang digunakan untuk penjernihan sari buah skala industri, antara lain : penambahan enzim, penabahan tannin dan gelatin, sentrifugasi dan pemanasan.
Perlakuan pemberian enzim dalam sari buah akan dapat membantu proses penjernihan sari buah. Enzim yang biasa digunakan adalah pektinase, yaitu enzim pemecah pektin, yaitu substrat polisakarida yang ditemukan di dinding sel tumbuhan. Salah satu pektinase yang banyak digunakan secara komersial adalah poligalakturonase. Petin merupakan suatu matriks mirip jelly yang merekatkan sel-sel tumbuhan dan merekatkan antar dinding sel tumbuhan, seperti serbut selulosa.
Oleh karenanya, enzim ini berperan dalam proses degradasi bahan yang berasal dari tumbuhan, seperti mempercepat ektraksi jus dari buah-buahan.
Pektinase biasanya merupakan campuran dari beberapa enzim, seperti selulase, yang digunakan secara luas dalam industri jus untuk membantu ekstraksi, menjernihkan, dan memodifikasi jus. Enzim yang termasuk dalam kelompok pektinase adalah poligalakturonase, pektin metil esterase, dan pektin lyase.
Penambahan enzim pektin akan membantu penjernihan sari buah dalam 2 cara: (1) enzim pektin menyebabkan koagulasi dan sedimentasi bahan-bahan tersuspensi dan kandungan koloid yang terdapat dalam jus, dan (2) penambahan enzim memperkecil viskositas jus buah dan sebagai akibatnya mempermudah dan mempercepat filtrasi.
Alat
Tabung reasi dan rak, incubator, jarum suntik, pipet.
Bahan
Berbagai jenis jus buah (suhu jus sekitar 21 C), larutan KI, HCl pekat, etanol absolut es.
Cara Kerja Uji pati
Panaskan 10 mL berbagai jus pada suhu 70 C dalam tabung reaksi. Biarkan dingin kemudian tambahkan 2-3 tetes dari 1 yodium% dalam 10% larutan kalium iodida (jenis yang digunakan untuk tes makanan). Sebuah warna biru menunjukkan adanya pati; menunjukkan bahwa pati coklat sebagian dipecah; kuning menunjukkan pati tidak ada. Catatan: beberapa jus apel komersial biasanya tidak mengandung pati (oleh karena itu perlu menggunakan beberapa jenis jus apel dari sumber berbeda).
Uji pektin
Tambahkan 1 bagian dari jus hingga 1,5 bagian etanol diasamkan (96% alkohol murni yang 1% asam klorida pekat telah ditambahkan). Jika flokulasi terjadi setelah 15 menit, pektin masih ada.
Uji stabilitas
Untuk menjernihan jus dilakukan pemanasan pada suhu 75C, segera didinginkan dan disimpan selama 4-6 jam pada 0 C dalam air es atau freezer. Catat perubaha yang terjadi dalam dinding tabung jus, apakah terbentuk kabut dalam jus.
LAB BIOLOGI UNJ
15 PRAKTIKUM VI.
UJI AKTIVITAS ENZIM Tujuan
Menentukan waktu optimum aktivitas enzim Kajian Pustaka
Pembuatan roti adalah salah satu contoh bioteknologi tertua yang berasal dari Mesir kuno (4.000 SM). Di Inggris, roti secara tradisional terbuat dari adonan tepung terigu, air, garam dan mungkin lemak, tergantung pada resep. Hal ini membentuk matriks untuk tujuan ‘menjebak’ ragi dalam adonan. Tambahan enzim amilase dalam adonan tepung akan mengkonversi pati menjadi glukosa, yang akan ‘memelihara’ sel ragi tetap hidup. Ragi juga memerlukan sumber nitrogen.
Nitrogen berasal dari Pepton dan asam amino yang tersedia dalam tepung akibat proses reaksi hidrolisis parsial protein tepung (disebut glutein). Dalam kondisi respirasi anaerob ragi akan menghasilkan karbon dioksida dan alkohol (fermentasi).
Elastisitas dan plastisitas adonan tepung menyebabkan karbon dioksida tetap terperangkap dalam adonan tepung dan memperbesar gelembung udara dalam adonan, menyebabkan adonan tepung membengkak. Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh berbagai komponen resep campuran dalam adonan tepung yang baik melalui modifikasi jenis tepung (komponen protein yang terandung dalam tepung) dan menganalisis aktivitas enzim dalam adonan.
Alat dan Bahan
a. Alat : Gelas kecil untuk pencampuran adonan, batang pengadu, timer, gelas ukur.
b. Bahan untuk setiap adonan:
Ragi kering 1 g, berbagai jenis tepung 75 g , Air 50mL, asam askorbat, kalium bromide.
Cara Kerja
1. Menghidupkan ragi kering di dalam air. Tambahkan tepung dan aduk rata.
2. Aduk dan bentuk adonan menjadi berbentuk sosis, dan menempatkannya di salah satu gelas ukur. Ulangi langkah 1-2 untuk jenis adonan kedua .
3. Catat ketinggian adonan dalam silinder setiap 10 menit selama satu jam.
4. Apakah ada pengaruh volume pembengkaan adonan akibat penggunaan berbagai jenis ragi kering?
5. Apa ada perbedaan volume pembengakan jenis adonan berbagai jenis tepun? (Misalnya tepung gandum putih, tepung ketan, tepung terigu dll)
6. Apa ada pengaruh pemberian asam askorbat (vitamin C) terhadap peningkatan pembengkakan adonan? asam askorbat berinteraksi dengan enzim dalam adonan untuk membatasi sejauh mana obligasi sulfihidril terbentuk antara protein tepung gluten.
(Tambahkan 1g asam asorbat untuk resep diberikan untuk adonan di atas.) Apakah pengaruh penambahan kalium bromide dalam adonan. Bandingkan dibuat dengan menggunakan adonan tepung dengan dan tanpa aditif ini. Garam dapat menghambat aktivitas protease dan mencegah dari yang melemahkan gluten menjadi massa lengket yang tidak dapat mempertahankan gas karbon dioksida. Kelebihan garam bentuk ikatan ion yang kuat dengan rantai samping molekul protein, membuat adonan kurang elastis dan menyebabkan adonan roti sulit mengembang. Kelebihan garam juga menghambat pertumbuhan ragi. Cobalah untuk menentukan kadar garam optimum ke dalam adonan.
LAB BIOLOGI UNJ
16 PRAKTIKUM VII.
ISOLASI, PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEIN MIOGLOBIN Isolasi protein mioglobin
Isolasi mioglobin dari jaringan otot Kajian Pustaka
Mioglobin adalah protein pengikat dan penyimpan oksigen jaringan. Protein ini banyak ditemukan di jaringan otot skelet. Jaringan otot yang banyak mengandung mioglobin ditandai dengan serat otot berwarna merah.
Alat dan Bahan Alat
Alat pelumat jaringan (Wheaton Overhead Stirrer), sentrifugasi (Hettich Zentrifugen Universal 32R), pengaduk magnetik (Thermolyne Cimarex 2), pipet mikro dan tip.
Bahan
Jaringan otot, bubuk (NH4)2SO4, akuabides, Inhibitor protease, larutan PBS (Phosphate Buffer Saline).
Cara Kerja
Isolasi protein mioglobin otot tukik
Jaringan otot hewan seberat 5 gram dipotong halus dan dimasukkan ke dalam tabung pelumat. Selanjutnya ditambahkan larutan PBS yang mengandung anti-protease 0,1% ke dalam tabung pelumat hingga mencapai volume 7,2 ml. Homogenat jaringan otot di sentrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang dihasilkan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml masing-masing 0,9 ml ditambahkan (NH4)2SO4 55% 1,1 ml ke dalam tabung mikro tersebut dan dilanjutkan dengan sentrifugasi kembali pada kecepatan 14.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4oC. Supernatan yang diperoleh dimasukkan ke dalam kantung selofan untuk didialisis dengan akuades selama 24 jam. Protein hasil dialisis yang diperoleh diberi kode α.
Purifikasi protein mioglobin Tujuan
Purifikasi mioglobin dan perkiraan berat molekul mioglobin Kajian Pustaka
Isolasi dan purifikasi protein mioglobin jaringan otot menggunakan teknik Maeda dan Fitch58. Alat dan Bahan
Alat :
Sentrifugasi (Hettich Zentrifugen Universal 32R), kolom kromatografi, tabung mikro, pipet, spektrofotometer (Bio Rad Smart Spec 3000) dam kuvet.
Bahan :
Protein otot, bubuk Sephadex G-75 (Pharmacia), larutan PBS (Phosphate Buffer Saline) pH 7.4, BSA (Bovine Serum Albumin) 1mg/ml (Sigma A9647).
Cara Kerja
Suspensi gel Sephadex G-75 dituang ke dalam kolom kromatografi berdiameter 2cm sampai mencapai ketinggian 6 cm. Setelah gel benar-benar mengendap, ditambahkan larutan 10 ml PBS pH 7,4. Larutan bufer dialirkan hingga permukaan bufer mencapai permukaan gel. Selanjutnya, larutan protein kode α diaplikasikan ke dalam kolom secara perlahan. Alirkan dan tampung eluat yang keluar ke dalam tabung reaksi sebanyak 1mL. Lakukan sampai larutan jaringan otot di dalam kolom mencapai permukaan gel. Selanjutnya, ditambahkan larutan PBS ke dalam kolom. Eluat ditampung
LAB BIOLOGI UNJ
17
dan dibaca absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada λ 280nm dan λ 503nm.
Seluruh eluat disimpan dalam suhu 4oC. Fraksi puncak yang diperoleh diberi kode Ro.
Catatan : Hasil purifikasi mioglobin
Purifikasi protein mioglobin kode α dilakukan dengan menggukan kolom gel filtrasi Sephadex G-75. Eluat ditampung mulai dari tabung ke-13 hingga tabung ke-32 (Gambar 1) dan diberi kode Ro. Eluat Ro yang ditampung merupakan protein mioglobin dari jaringan otot. Mioglobin ini diharapkan telah terpisah dari molekul-molekul kecil dan protein jaringan otot lainnya (Gambar 1).
Kumpulkan seluruh tabung eluat yang memberikan gambaran puncak fraksi (berdasaran pebacaan nilai absorbansi ada spektrofotometer). Hitung volume total dan konsentrasi eluat Ro yang diperoleh.
Untuk produksi antibodi anti-mioglobin, eluat Ro yang dikumpulkan dijadikan antigen yang diimunisasikan pada kelinci. Jumlah Ro yang disuntik kepada kelinci adalah 1mg/mL.
Gambar 1. Grafik nilai serapan eluat (protein Ro tabung 13- 32) (λ 280 nm)
Berat molekul protein mioglobin dapat dianalisis menggunakan teknik eletroforesis SDS PAGE. Protein mioglobin memiliki kisaran berat molekul mioglobin sekitar 17 kDa.
Deteksi antibodi anti-mioglobin dengan teknik imunodifusi Ouchterlony.
Tujuan
Untuk mendeteksi protein mioglobin dari isolat homogenat.
Kajian Pustaka
Ouctherlony adalah teknik imunodifusi menggunakan lempeng gel agarose dengan serangkaian lubang atau "sumur". Setiap sumur berisi protein sampel sebagai antigen-Ag yang mengelilingi sumur yang berisi antibodinya. Selama sekitar 48 jam protein antigen dalam sampel uji dan antibodi-Ab akan berdifusi keluar dari sumur masing-masing. Difusi dalam gel terlihat sebagai garis putih. Garis putih difusi antigen dan antibodi akan bertemu sebagai reaksi presipitasi. Jika antibodi mengenali salah satu dari sejumlah antigen yang mengelilinginya akan ditandai oleh pertemuan antara kedua garis tersebut sebagai reaksi positif telah terbentuknya kompleks imun.
Alat dan Bahan
a. Alat : Cawan petri, pembolong gel, gelas beaker, batang pengaduk, water pass.
b. Bahan : Bubuk gel Agarose, antibodi anti mioglobin manusia, antigen mioglobin Ro, protein mioglobin kuda (Sigma), aquabides.
Cara Kerja
Uji ini untuk mendeteksi antigen bila antibodi diketahui ada dalam sampel berdasarkan reaksi presipitasi. Selanjutnya, cawan petri kecil yang bersih diletakkan pada permukaan meja lab yang benar-benar rata dengan menggunakan bantuan alat rata-rata air. Sebanyak 10mL gel agarose dituang ke dalam cawan petri kecil menggunakan pipet ukur. Gel didiamkan hingga membeku, kemudian dilubanginya dengan menggunakan pelubang gel berdiameter 0.5Cm sebanyak 5 lubang dengan jarak masing-masing 9mm. Antigen yang diketahui dan antibodi yang diuji diletakkan mengelilingi disekitarnya seperti pada Gambar 2. Letakkan gel berisi sampel dalam kotak plastik lembab dan amati setelah 48 jam penyimpanan. Amati dan catat hasil yang diperoleh.
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400
1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49
Nilai absorbansi λ280nm
Tabung fraksi
Ro = 0,734mg/mL
LAB BIOLOGI UNJ
18
Gambar 2. Skema teknik imunodifusi Ouchterlony.
Keterangan:
Ag1,2,3 = Antigen, (larutan protein otot tukik C. mydas C,X,Ro, AgK = Larutan Mb kuda murni (Sigma M0630-250MG).
Ab = Antibodi anti mioglobin manusia (santaCruz)
Gambar 3. Pola hasil uji imunodifusi Ouchterlony
LAB BIOLOGI UNJ
19 PRAKTIKUM VIII.
ANALISIS KANDUNGAN BAHAN KIMIA TAMBAHAN PADA MAKANAN Tujuan:
Mengetahui kandungan boraks dan formalin dari berbagai jenis makanan, minuman dan kosmetika
Kajian Pustaka
Boraks merupakan garam natrium yang sering digunakan di berbagai industri non pangan.
Boraks berbentuk serbuk kristal, tidak berbau, larut dalam air dan tidak larut dalam alkohol. Boraks biasa digunakan sebagai bahan pengawet dan antiseptik kayu. Sedangkan formalin merupakan cairan tidak berwarna, memiliki bau menyengat, mudah larut dalam air dan alkohol. Formalin biasa digunakan untuk desinfektan, pembasmi serangga, pengawet tekstil dan kayu.
Penggunaan boraks dan formalin dalam makanan sangat membahayakan bagi kesehatan tubuh, karena dapat menyebabkan kerusakan hati, gangguan jantung dan kerusakan saraf.
Beberapa makanan yang sering menggunakan boraks dan formalin adalah bakso, mie, ikan dan tahu. Ciri-ciri makanan yang mengandung boraks dan formalin memiliki tekstur lebih kenyal, tidak mudah hancur, dan tahan lama.
Alat
a. Tanur listrik
b. Cawan platina (kalau memakai cawan porselen harus memakai blanko) c. Pipet tetes
d. Kertas saring e. Corong f. Penangas air g. Bunsen Bahan
a. Sampel uji
b. Natrium karbonat kristal c. Na2CO3 kristal
d. Asam klorida e. HCl 5 N
f. Larutan asam oksalat jenuh g. Ekstrak etil alkohol dari turmeric
h. Ammonium (NH4OH) / natrium hidroksida (NaOH) encer Cara Kerja
Pengujian Boraks
Secara Semi Kuantitatif menurut: AOAC 10th ed. 1965 Bag. 27 Hal. 451. Pengujian boraks pada bahan makanan terdiri dari lima langkah yaitu:
Membuat Kertas Kunyit
Tambahkan 100 ml alkohol 80% dalam 1,5 – 2 gr turmeric / curcumin powder dalam Erlenmeyer 250 ml bertutup. Kocok selama 5 menit, kemudian saring. Celupkan kertas saring Whatman no 40 dalam larutan tersebut. Keringkan dengan diangin-anginkan. Setelah kering, gunting dalam bentuk memanjang dan simpan dalam tempat yang rapat dan terhindar dari cahaya.
Membuat Larutan Standar Asam Borat
Larutkan 1 gr H3BO3 dalam aquades sampai 100 ml. Pipet 0,0 ml ; 0,1 ml ; 0,2 ml ; 0,5 ml ; 0,75 ml ; 1,0 ml ; 2,5 ml ; 5 ml larutan tersebut, masukkan dalam labu ukur 50 ml. Encerkan dengan 10 ml aquades kemudian tambahkan 0,7 ml HCl pekat, tutup rapat, kocok. Standar ini bernilai 0,00
; 0,02 ; 0,04 ; 0,10 ; 0,15 ; 0,20 ; 0,50 dan 1,00 % H3BO3 dalam sampel.
LAB BIOLOGI UNJ
20 Perlakuan Sampel
Larutkan 25 gr sampel dalam 50 ml aquades, tutup dengan kaca arloji. Didihkan sebentar.
Kemudian masukkan dalam lemari pendingin selama ± 30 menit sampai lemaknya membeku. Saring dengan menggunakan kertas saring biasa yang sudah dilapisi dengan kapas. Pipet 10 ml filtrat, masukkan dalam tabung reaksi. Tambahkan 0,7 ml HCl, kocok.
Pengujian
Celupkan kertas kunyit dalam larutan sampel sampai setengah bagian. Angkat dan letakkan diatas kertas putih. Gunakan pinset untuk memegang kertas saring tersebut. Lakukan juga untuk larutan standar.
Setelah ± 1 jam pada suhu ruang maka kertas tersebut sudah cukup kering untuk uji pembandingan. Lakukan pencocokan warna di tempat terang (bukan sinar lampu). Bila warna kertas sample sama dengan salah satu kertas standar, maka kadar boraks dalam sampel dinyatakan sama dengan larutan standar tersebut. Bila warna kertas sampel berada diantara 2 warna kertas standar, maka perkirakan nilainya. Bila warna keluar dari range standar, ulangi uji sample dengan komposisi 5 ml filtrat, 5 ml aquades, 0,7 ml HCl dan seluruh hasil pembacaan dikalikan.
Metode lain untuk menguji boraks pada makanan:
1. Lebih kurang 20 gr sampel dibubuhi kristal Na2CO3 secukupnya 2. Arangkan diatas nyala bunsen dan abukan di dalam tanur listrik 3. Dinginkan
4. Tambahkan air dan beberapa tetes HCl 5N
5. Kemudian saring lalu tambahkan 4 tetes asam oksalat jenuh dan 1 ml ekstrak etil alcohol dari turmeric
6. Uapkan di atas penangas air sampai kering, bila terbentuk warna merah merah cherry) boraks positip yang pada sisa pengendapan dibubuhi NH4OH / NaOH encer akan terbentuk warna hijau kehitaman
Prosedur uji formalin pada makanan
1. Ambil produk makanan yang akan diuji 2. Cacah dan ambil sekitar 10 gr
3. Tambahkan air hangat sekitar 10 ml
4. Ambil air rendaman tersebut sebanyak 5 ml 5. Teteskan reagen dalam test kit, biarkan 10 menit
6. Jika terbentuk warna ungu, berart produk makanan yang anda uji mengandung formalin.
LAB BIOLOGI UNJ
21 PRAKTIKUM IX.
EKSTRAKSI DAN ANALISIS FITOKIMIA SECARA KUALITATIF EKSTRAKSI
Tujuan
Mempelajari cara pembuatan ekstrak tumbuhan.
Kajian Pustaka
Tumbuhan merupakan sumber daya hayati yang mempunyai potensi kimia karena mampu memproduksi senyawa kimia secara teratur dan seimbang berupa metabolit primer dan metabolit sekunder (Cunha, 1998). Tumbuhan umumnya mengandung senyawa aktif dalam bentuk metabolit sekunder seperti alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, tanin, saponin dan lain-lain.
Fitokimia merupakan suatu disiplin ilmu mengenai senyawa organik yang dibentuk oleh tumbuhan meliputi struktur kimia, biosintesis, perubahan serta metabolisme, penyebaran secara ilmiah dan fungsi biologis. Penapisan fitokimia dimulai dengan pengumpulan sampel dan membuatnya menjadi ekstrak. Ekstrak ialah sediaan yang diperoleh dari jaringan hewan atau tumbuhan dengan menarik senyawa aktifnya dengan pelarut yang sesuai kemudian memekatkannya hingga tahap tertentu (Harborne, 1996).
Ekstraksi yaitu proses penarikan zat pokok yang diinginkan dari bahan mentah menggunakan pelarut yang dipilih dimana zat yang diinginkan dapat larut (Fong, 1994). Ekstraksi yang tepat bergantung pada tekstur dan kandungan air bahan tumbuhan yang diekstraksi, jenis senyawa yang diisolasi serta jenis pelarut yang digunakan (Harborne, 1996). Simplisia lunak seperti rimpang dan daun mudah ditembus oleh cairan pelarut sehingga pada pelarutan tidak perlu dihaluskan. Sedangkan simplisia keras seperti biji dan kulit perlu dihaluskan sebelum dilakukan pelarutan (Sediaan Galenik, 1987).
Beberapa metode ekstraksi senyawa organik bahan alam yang umum digunakan antara lain (Darwis, 2000) :
1. Maserasi yaitu proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang dilakukan pada temperatur ruangan.
2. Perkolasi yaitu proses melewatkan pelarut organik pada sampel sehingga pelarut akan membawa senyawa organik bersama-sama pelarut.
3. Sokletasi menggunakan soklet dengan pemanasan, pelarut dapat dihemat karena terjadinya sirkulasi pelarut yang selalu membasahi sampel.
4. Destilasi uap lebih banyak digunakan untuk senyawa organik yang tahan pada suhu yang lebih tinggi dari titik didih pelarut yang digunakan.
Alat dan Bahan
1. Sampel tumbuhan 8. Erlenmeyer
2. Kipas angin 9. Spatula
3. Saringan 10. Gelas ukur
4. Alat penggiling (Dry Mill) 11. Corong
5. Kertas koran 12. Alumunium foil
6. Kain hitam 13. Kertas saring kasar
7. Timbangan 14. Etanol 96%
Cara Kerja
1. Menimbang berat basah sampel tumbuhan.
2. Mengeringanginkan sampel tumbuhan kurang lebih selama satu minggu.
3. Menimbang berat kering sampel tumbuhan.
4. Menggiling halus sampel tumbuhan lalu menimbang berat serbuk tersebut.
5. Merendamnya dalam pelarut etanol 96% dengan perbandingan 1:8 (w/v) selama dua hari sambil sesekali diaduk.
6. Setelah dua hari rendaman, menyaring rendaman menggunakan kertas saring dan corong pemisah.
LAB BIOLOGI UNJ
22 ANALISIS FITOKIMIA
Tujuan
Mempelajari analisis fitokimia secara kualitatif.
Kajian Pustaka
Fitokimia atau kadang disebut fitonutrien, dalam arti luas adalah segala jenis zat kimia atau nutrien yang diturunkan dari sumber tumbuhan, termasuk sayuran dan buah-buahan.
Fitokimia biasanya digunakan untuk merujuk pada senyawa yang ditemukan pada tumbuhan yang tidak dibutuhkan untuk fungsi normal tubuh, tapi memiliki efek yang menguntungkan bagi kesehatan atau memiliki peran aktif bagi pencegahan penyakit. Karenanya, zat-zat ini berbeda dengan apa yang diistilahkan sebagai nutrien dalam pengertian tradisional, yaitu bahwa mereka bukanlah suatu kebutuhan bagi metabolisme normal, dan ketiadaan zat-zat ini tidak akan mengakibatkan penyakit defisiensi, paling tidak, tidak dalam jangka waktu yang normal untuk defisiensi tersebut.
Alat dan Bahan
1. Tabung reaksi 12. Air panas
2. Pipet tetes 13. Magnesium
3. Test plate 14. HCl
4. Gelas ukur 15. FeCl3 1%I
5. Ekstrak tumbuhan 16. Raksa (II) klorida
6. Penangas 17. Bismut (III) nitrat
7. Kertas saring 18. Asam nitrat pekat
8. Larutan NaOH 10% 19. HCl 2 N
9. Kloroform 20. Aquades
10. Asam asetat anhidrida 21. Kalium iodida
11. Asam sulfat pekat 22. Iodium
Gambar 4. Uji positif senyawa fenolat
Cara Kerja
Pengujian fenolat
1. Memasukkan 1 ml sampel ekstrak ke dalam tabung reaksi.
2. Menambahkan larutan NaOH 10%.
3. Terbentuknya warna merah menandakan positif senyawa fenolat.
Pengujian triterpenoid dan steroid
1. Memasukkan 1 ml sampel ekstrak ke dalam tabung reaksi dan menambahkan 2 ml kloroform.
2. Menambahkan 10 tetes asam asetat anhidrida dan 3 tetes asam sulfat pekat.
3. Mengocok larutan secara perlahan dan dibiarkan selama beberapa menit.
4. Terbentuknya warna merah atau ungu menandakan positif senyawa triterpenoid sedangkan warna biru atau hijau positif senyawa steroid.
LAB BIOLOGI UNJ
23
Gambar 5. Uji positif senyawa triterpenoid
Gambar 6. Uji positif senyawa steroid
Pengujian flavonoid
1. Memasukkan 1 ml sampel ekstrak ke dalam tabung reaksi.
2. Menambahkan 20 ml air panas kemudian dididihkan selama 5 menit.
3. Menambahkan 0,5 gram Mg dan 10 tetes HCl lalu mengocoknya perlahan.
4. Terbentuknya warna merah, jingga atau ungu menandakan positif senyawa 5. flavonoid.
Gambar 7. Uji positif senyawa flavonoid
Pengujian tanin
1. Memasukkan 1 ml sampel ekstrak ke dalam tabung reaksi.
2. Menambahkan 12 ml air panas dan dididihkan selama 15 menit lalu menyaringnya.
3. Menambahkan filtrat dengan 1 ml larutan FeCl3 1%.
4. Terbentuknya warna biru tua atau hijau kehitaman menandakan positif senyawa tanin.
Gambar 8. Uji positif senyawa tanin
Pengujian alkaloid
1. Memasukkan 0,5 ml sampel ekstrak ke dalam tabung reaksi.
2. Menambahkan 1 ml HCl 2 N dan 9 ml air suling lalu memanaskannya di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring.
LAB BIOLOGI UNJ
24
3. Memasukkan 3 tetes filtrat ke dalam test plate lalu menambahkan 2 tetes larutan pereaksi Mayer (Raksa (II) klorida dan Kalium iodida) maka akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning.
4. Memasukkan 3 tetes filtrat ke dalam test plate lalu menambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat (Kalium iodida dan Iodium) maka akan terbentuk endapan coklat sampai hitam.
5. Memasukkan 3 tetes filtrat ke dalam test plate lalu menambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff (Bismut (III) nitrat, Asam nitrat pekat dan Kalium iodida) maka akan terbentuk warna merah atau jingga.
6. Alkaloid dikatakan positif apabila terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dua dari ketiga percobaan tersebut.
Gambar 9. Uji positif senyawa alkaloid
Pengujian saponin
1. Memasukkan 0,5 ml sampel ekstrak ke dalam tabung reaksi.
2. Menambahkan air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik.
3. Jika terbentuk buih yang mantap setinggi 1 – 10 cm, tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan HCl 2 N maka menunjukkan adanya saponin.
Gambar 10. Uji positif senyawa saponin
