PREPARASI
99mTc-HYNIC-TOC YANG AKAN DIGUNAKAN
UNTUK PENCITRAAN TUMOR
Widyastuti, Laksmi A., Anna Roseliana, Yunilda, Cecep Taufik, Evi Sovilawati P2RR - BATAN
ABSTRAK
PREPARASI 99mTc-HYNIC-TOC YANG AKAN DIGUNAKAN UNTUK PENCITRAAN TUMOR. 99m
Tc-HYNIC-TOC telah diketahui dapat digunakan untuk pencitraan berbagai jenis tumor neuroendokrin dan tuberkulosis paru-paru, hal ini akan sangat membantu dalam penanganan tumor dan tuberkulosis terutama sebagai salah satu modalitas diagnosis. Telah dilakukan penandaan HYNIC-TOC dengan 99mTc
menggunakan EDDA sebagai koligan dan pembuatan kit kering HYNIC-TOC. Identifikasi 99m
Tc-HYNIC-TOC dilakukan dengan HPLC fasa balik dengan pembanding HYNIC-Tc-HYNIC-TOC, sedangkan efisiensi penandaan diuji dengan kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis dengan 3 macam eluen yaitu aseton, dapar fosfat salin (PBS) pH 7 dan campuran ammonium asetat-metanol (1:1). Uji biodistribusi untuk melihat farmakokinetika 99mTc-HYNIC-TOC dilakukan pada mencit sehat. Stabilitas kit pada penyimpanan suhu
4C diamati dengan menguji kemurnian radiokimia kit yang ditandai dengan 99mTc setiap bulannya.
Identifikasi dengan HPLC menunjukkan kesamaan waktu retensi HYNIC-TOC yang belum dan sudah ditandai yaitu pada 18-19 menit, sedangkan kromatogram kertas dan lapis tipis menunjukkan kemurnian radiokimia diatas 80%. Biodistribusi pada mencit sehat menunjukkan akumulasi yang tinggi pada saluran kemih sedangkan pada organ-organ lain relatif rendah. Stabilitas kit kering HYNIC-TOC pada penyimpanan suhu 4C hanya bertahan selama 1 bulan, pada bulan kedua hasil pengujian kemurnian radiokimia menunjukkan penurunan yang cukup berarti yaitu dibawah 80%.
Kata kunci : HYNIC-TOC, 99mTc, penandaan, biodistribusi, tumor
ABSTRACT
PREPARATION OF 99mTc-HYNIC-TOC TO BE USED AS TUMOR IMAGING AGENT. 99m
Tc-HYNIC-TOC has been widely used as tumor imaging agent specifically for neuroendokrin tumor and also for lung tuberculosis, so it can become an alternative of diagnosis modality for tumor and tuberculosis. Labeling HYNIC-TOC with 99mTc has been carried out using EDDA as co-ligands as well as preparation of
HYNIC-TOC dry kits. Identification of 99mTc-HYNIC-TOC was carried out using reversed phase HPLC, the results
was compared with unlabeled HYNIC-TOC, whereas radiochemical purity was measured by thin layer chromatography (TLC) and paper chromatography (PC) using 3 eluants, i.e. acetone, phosphate buffer saline pH 7 and mixture of ammonium acetate and methanol (1:1). Biodistribution test of 99m
Tc-HYNIC-TOC was carried out on normal mice to see its pharmacokinetic behaviour. Kit stability on storage at 4C was observed by measuring its labeling efficiency with 99mTc every month. The results of HPLC
measurement showed similar retention time between labeled and unlabeled HYNIC-TOC (at 18-19 minutes), and it radiochemical purity resulted from TLC/PC analysis was more than 80%. Biodistribution on normal mice showed high accumulation in kidneys and bladder whereas in blood and other organs the accumulation was low. The dry kits of HYNIC-TOC stored at 4C was remain stable up to 1 month, but in the second month of storage the radiochemical purity decreased significantly to less than 80%.
Keywords : HYNIC-TOC, 99mTc, labeling, biodistribution, tumor
PENDAHULUAN
ingga saat ini angka kematian akibat penyakit keganasan termasuk tumor dan kanker masih tinggi, dan belum dapat diatasi dengan optimal. Sebelum dilakukan pengobatan perlu dilakukan diagnosis yang pasti, dan lebih baik apabila dapat diketahui lebih dini. Untuk itu
H
diperlukan metoda diagnosis yang sensitif, spesifik dengan biaya yang terjangkau agar penyakit ini dapat diketahui sejak dini, sehingga pengobatannya akan lebih mudah.
Dalam beberapa dekade terakhir telah dikembangkan penandaan monoclonal antibody (MoAb) untuk pencitraan tumor, tetapi masih ada
beberapa kendala antara lain immunogenisitas dari murin MoAb, reaktivitas silang dengan antigen lain, hilangnya immunoreaktivitas setelah proses konjugasi dan rendahnya uptake oleh tumor target (T/NT ratio rendah) serta blood clearance rendah dikarenakan berat molekulnya tinggi. Dengan ditemukannya reseptor peptida dan dapat disintesisnya secara kimia peptida berukuran kecil yang aktif secara biologis, merupakan suatu pendekatan baru dalam pengembangan radio-farmaka. Dalam beberapa hal peptida lebih baik daripada MoAb karena afinitas terhadap reseptor lebih besar, immunogenisitasnya rendah dan blood
clearance relatif cepat karena berat molekulnya
kecil[1,2].
Dalam banyak kasus penyakit kanker ditemukan sejumlah reseptor somatostatin yang dikelompokkan ke dalam 5 subtipe, sehingga memungkinkan bisa digunakan sebagai target untuk pencitraan tumor neuroendokrin. Salah satu analog somatostatin yang dilabel dengan radionuklida ialah octreotide, yang hanya dapat berikatan dengan reseptor subtipe 2, 3 dan 5 dan ditemukan antara lain pada kasus neuroblastoma dan tumor endokrin gastrointestinal[1].
Sediaan radiofarmaka berbasis peptida analog somatostatin kini sudah banyak digunakan antara lain ialah 111In-DTPA-Octreotide dan 99m
Tc-Hydra-zinonicotinamide-Tyr3-Octreotide (99m
Tc-HYNIC-TOC). Peptida bertanda 99mTc lebih
menguntungkan dibandingkan peptida bertanda
111In karena lebih murah, lebih mudah
pengadaannya karena tersedia dalam bentuk generator 99Mo/99mTc dan sudah digunakan secara
rutin di Rumah Sakit serta mem-punyai sifat peluruhan fisis yang lebih menguntung-kan[1,3].
Metoda penandaan peptida pada umumnya menggunakan metoda tidak langsung (menggunakan ligan penghubung yang berfungsi juga sebagai bifunctional chelator) dimana tidak ada proses pemutusan ikatan disulfida, karena pemutusan ikatan disulfida pada peptida yang berukuran relatif kecil dapat merusak keutuhan sifat biologinya.[2]
Pembentukan 99mTc-HYNIC-TOC
memerlu-kan senyawa ligan lain untuk menstabilmemerlu-kan konfigurasi molekul kompleks tersebut yang disebut koligan, diantaranya yang dapat digunakan adalah trisin, EDDA (ethylenediaminediacetic acid), asam nikotinat dan sebagainya. Apabila digunakan trisin sebagai koligan efisiensi penandaan yang dihasilkan sangat tinggi (>98%), sedangkan apabila digunakan EDDA efisiensi yang dihasilkan relatif rendah (<60%). Sebaliknya bila digunakan trisin ikatan 99mTc-HYNIC-TOC dengan protein plasma
relatif tinggi hingga mencapai 30%, sedangkan bila digunakan EDDA ikatan dengan protein plasma hanya <10%. Oleh sebab itu pada pelabelan 99m
Tc-HYNIC-TOC digunakan campuran trisin dan EDDA, yang mana trisin diperlukan untuk mem-bentuk struktur kompleks 99mTc-HYNIC-TOC dengan efisiensi penandaan yang tinggi, dan melalui proses pemanasan trisin akan disubstitusi oleh EDDA, sehingga struktur akhir berbentuk
99mTc-HYNIC-TOC-EDDA yang memberikan
kestabilan in-vitro maupun in-vivo yang tinggi.[4]
BAHAN DAN TATA KERJA
Bahan dan Peralatan
Bahan yang digunakan ialah Hidrazinoni-kotinamid-Tirosin3-octreotide yang disingkat
HYNIC-TOC (Polatom, Polandia), ethylenediamine-diacetic acid (EDDA, Sigma), Trisin (Sigma), manitol (Merck), timah klorida dihidrat (Aldrich), Generator 99m Tc (BATEK),
bahan-bahan kimia standar (Merck) misalnya asetonitril, asam tri-fluoroasetat, asam hidroklorida, natrium hidroksida, dan sebagainya, air bidestilata steril dan larutan NaCl 0.9% (IPHA), serta gas nitrogen (High Purity, medical grade).
Alat alat yang digunakan ialah peralatan gelas, misalnya vial 2 cc, 5 cc dan 10 cc, tabung mikro, tabung reaksi, dan lain lain, pipet eppendorf berbagai ukuran, syringe berbagai ukuran, timbangan, pH-meter, kertas indikator pH, peralatan HPLC (Shimadzu) dengan kolom C18, peralatan kromatografi kertas/lapis tipis, alat pencacah gamma (GIC & mini assay), dan lain lain.
Tata Kerja
Penandaan Tc99m-TOC (kit HYNIC-TOC Cara Basah)
Kedalam vial dimasukkan 0.5 ml larutan EDDA dalam NaOH 0.1 N (20 mg/ml), 0.5 ml larutan trisin dalam dapar fosfat 0.2N pH 6 (40 mg/ml), 40 l larutan HYNIC-TOC dalam etanol 10% (0.5 mg/ml), 25 l larutan SnCl2.2H2O dalam
HCl 0.1N bebas oksigen (1 mg/ml) dan 5-10 mCi larutan perteknetat Tc99m yang fresh. Larutan reaksi
dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 10 menit.
Karakterisasi danAanalisis Kemurnian Radiokimia
Karakterisasi HYNIC-TOC yang belum maupun yang sudah ditandai dengan 99mTc
dilakukan menggunakan HPLC fasa balik (Reversed Phase HPLC) dengan eluen asetonitril dan air yang mengandung 0.1% asam trifluoroasetat dan dielusi secara gradien dengan pengaturan 3 menit 0% asetonitril, 3-13 menit 0-40% asetonitril, 13-23 menit 0-40% asetonitril, 23-26 menit 40-70% ase-tonitril, dan 26-27 menit 70-100% asetonitril. Kemurnian radiokimia diuji dengan kromatografi kertas dengan eluen aseton untuk menentukan % perteknetat 99mTc bebas (Rf 1)
dan kromatografi lapis tipis dengan eluen campuran ammonium asetat 0.25M pH 5.2 dengan metanol (1:1) untuk menen-tukan % 99mTc koloid
(Rf 0), serta kromatografi lapis tipis dengan eluen dapar fosfat-salin (PBS) pH 7 untuk menentukan % 99mTc-koligan yang bercampur dengan
perteknetat 99mTc bebas (Rf 0.8). Dengan
mengetahui % spesi 99mTc yang merupakan
pengotor, maka % 99m Tc-HYNIC-TOC dapat
dihitung.
Uji Stabilitas Kit Kering HYNIC-TOC
Kit kering HYNIC-TOC dibuat dalam 2 kemasan vial, vial yang satu (vial A) berisi 20 g HYNIC-TOC, 20 mg trisin, 10 mg EDDA dan 25 g SnCl2.2H2O, sedangkan vial yang lain (vial B)
berisi larutan dapar fosfat 0.2 N pH 6. Kit A dibuat dengan cara yang sama dengan kit HYNIC-TOC cara basah tetapi tanpa penambahan larutan perteknetat 99mTc. Stabilitas kit diuji dengan
menganalisis kemurnian radiokimia hasil penandaan kit setiap bulan setelah kit kering HYNIC-TOC disimpan selama beberapa bulan di dalam lemari pendingin (suhu 4C).
Uji Biodistribusi
Uji biodistribusi dilakukan dengan menyuntikkan 0.2 ml (600 –800 Ci) 99mTc–
HYNIC-TOC pada mencit yang sehat. Setelah 1 jam hewan dikorbankan dan organ organ termasuk sampel darah dan tulang dicacah radioaktifitasnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengujian dengan HPLC untuk HYNIC-TOC yang belum ditandai memberikan waktu retensi pada 18 menit, sedangkan 99mTc–
HYNIC-TOC memberikan waktu retensi pada 19 menit (pengukuran dilakukan menggunakan detektor radioaktif eksternal sehingga ada selisih waktu /keterlambatan antara deteksi menggunakan detektor UV dengan detektor radioaktif tersebut) dengan jumlah cacahan maksimum (Gambar 1 dan 2).
Gambar 2. Kromatogram HPLC 99mTc–HYNIC-TOC (berdasarkan hasil cacahan eluat HPLC).
Hasil pengujian dengan KLT/ kromatografi kertas untuk 99mTc-HYNIC-TOC yang ditandai
dengan metoda basah dan metoda kering berturut-turut ialah 81.9 % dan 82.4 % (Tabel 1). Jumlah perteknetat (Tc bebas) yang masih cukup tinggi (lebih dari 5%) pada penandaan kit kering HYNIC-TOC sesaat setelah pembuatan menunjukkan jumlah reduktor (Sn+2) masih kurang, yang
mungkin disebabkan oleh teroksidasinya Sn+2
menjadi Sn+4 selama proses pembuatan kit. Untuk
mengatasi hal itu perlu diperhatikan teknik pembuatan kit terutama pada proses pengaliran gas nitrogen sehingga oksigen dari atmosfer dapat diusir sehingga kemungkinan teroksidasinya reduktor yang digunakan. dapat diminimalkan.
Uji stabilitas kit kering HYNIC-TOC menun-jukkan penurunan % kemurnian radiokimia yang berarti setelah 2 bulan penyimpanan pada
suhu 4C yaitu menjadi 71.8%, sehingga pengamatan hanya dilakukan hingga bulan ke-4 dengan penurunan kemurnian radiokimia sebesar 65.5% (Tabel 1).
Hasil uji biodistribusi untuk 99m
Tc-HYNIC-TOC menunjukkan radioaktivitas yang tinggi pada ginjal dan kandung kemih, dan relatif rendah pada organ organ lain (Gambar 3). Tingginya perban-dingan % radioaktivitas pada sistim ekskresi (ginjal dan kandung kemih) terhadap organ organ lain menunjukkan sifat farmakokinetika yang diharapkan dari sediaan penatah tumor atau infeksi, sehingga apabila terdapat tumor atau infeksi di dalam tubuh diharapkan akan diperoleh gambaran gamma kamera yang cukup jelas. Biodistribusi pada mencit yang diinduksi tumor tidak dapat dilakukan karena fasilitas yang diperlukan tidak tersedia.
Tabel 1. Pengujian stabilitas kit HYNIC-TOC.
Waktu Analisis kemurnian radiokimia dengan kromatografi kertas dan lapis tipis
penyimpanan % TcO4- % TcO
2 %Tc-coligand %Tc-HYNIC-TOC
1 minggu 5.7 6.8 5.1 82.4
1 bulan 6.5 4.3 7.7 81.5
2 bulan 16.8 3.5 7.9 71.8
Gambar 3. Hasil uji biodistribusi 99mTc-HYNIC-TOC pada mencit sehat.
KESIMPULAN
Pelabelan HYNIC-TOC dengan 99mTc
meng-gunakan koligan trisin dan EDDA demikian juga pembuatan kit HYNIC-TOC telah berhasil dilakukan walaupun hasilnya belum optimal dan masih dapat ditingkatkan. Stabilitas kit kering HYNIC-TOC hanya bertahan hingga satu bulan setelah disimpan pada suhu 4C, hal ini sangat tidak efisien, sehingga perlu dicari formula atau kondisi pembuatan yang lebih baik yang dapat memberikan stabilitas kit yang lebih tinggi. Pengujian pada hewan percobaan yang sehat menunjukkan sifat farmakokinetika 99m
Tc-HYNIC-TOC sesuai dengan yang diharapkan untuk sediaan radiofarmaka penatah tumor, tetapi pengujian pada hewan yang mengidap tumor tidak dapat dilakukan karena fasilitas laboratorium untuk menginduksi tumor pada hewan percobaan tidak tersedia di P2RR.
DAFTAR PUSTAKA
1. D. BLOK, R.I.J. FEITSMA, P. VERMEIJ,
et.al., Peptide Radiopharmaceuticals in
Nuclear Medicine, Review article, Eur J Nucl
Med (1999) Vol. 26, No. 11, pp. 1511.
2. SHUANG LIU, D. SCOTT EDWARDS, and JOHN A. BARRETT, 99mTc Labeling of Highly
Potent Small Peptides, Bioconjugate Chem.
(1997), Vol. 8, No. 5, pp. 621-629.
3. C.DECRISTOFORO, S.J. MATHER,
Technetium-99m Somatostatin Analogues: Effect of Labeling Methods and Peptide Sequence, Eur J Nucl Med (1999) Vol.26, No.
8, pp. 869-870.
4. C. DECRISTOFORO, L. M. ALAFORT, J. K. SOSABOWSKI, et.al, 99m
Tc-HYNIC-[Tyr3]-Octreotide For Imaging Somatostatin-Receptor-Positive Tumors: Preclinical Evaluation and Comparison with 111In-Octreotide, J Nucl Med
(2000) Vol. 41, No. 6, pp. 1114-1119.
TANYA JAWAB
Aslina Ginting Kenapa didalam abstrak dan isi tidak di-gambarkan hasil pencitraan tumor.
Bagaimana mekanisme pencitraan tumor dengan menggunakan 99TCHynic-TOC ini?
Widyastuti
Penelitian ini merupakan tahap awal dari
pengembangan sediaan radiofarmaka berbasis peptide 99mTC-Hynic-TOC, dimana hasil
penelitian ini baru sampai pada tahap preparasi sediaan dan biodistribusi pada hewan sehat, sedangkan uji klinis pada pasien penderita tumor neuroendokrin atau uji pencitraan tumor akan dilakukan pada tahap penelitian selanjutnya.
Mekanisme pencitraan tumor berdasarkan pada
ikatan antara TOC (analog somatostatin) dengan reseptor somatostatin sub tipe 2 dan 5 yang banyak ditemukan pada permukaan sel tumor. Terakumulasinya 99mTC-Hynic-TOC
pada jaringan tumor memungkinkan pencitraan tumor dengan alat -kamera.
Tunjung
TOC secara umum (yang kami ketahui) adalah jaringan tumor dalam tubuh. Apa kegunaan Hynic disini mengingat dalam tata kerja harus disiapkan kit kering.
Bagaimana penandaan tumor langsung menggunakan Tc tanpa kit kering Hynic-TOC.
Widyastuti
Hynic adalah suati ligand yang dapat mengikat
Tc99m sekaligus dapat berikatan dengan TOC
(suatu peptida), jadi berfungsi sebagai penghubung.
Tc99m apabila dimasukkan langsung kedalam
tubuh, akan terakumulasi pada organ-organ lain (misal tiroid, lambung, otot) yang dapat mengganggu pencitraan tumor.
Filian Arbiyani
Apa Tc99m-Hynic-TOC?
Bagaimana kalau yang terkena tumor kandung kemih atau ginjal?
Mengapa waktu yang diberikan hanya satu jam?
Widyastuti
99mTc-Hynic-TOC adalah singkatan dari 99m
Tc-HydrazinoNicotinamide-Tyrosine Octreotide, yaitu sediaan radiofarmaka berbasis peptida yang ditandai dengan Tc99m, yang digunakan
untuk pencitraan tumor neuroendokrin.
Sulit untuk dideteksi apabila tumornya terdapat
pada kandung kemih dan ginjal, jadi harus digunakan cara lain.
Waktu 1 jam adalah umum untuk mengetahui
