EFEKTIVITAS ANTIBAKTERI MINYAK ATSIRI BUNGA CENGKEH
(
Syzygium arimaticum) TERHADAP B. subtilis, B. cereus,
S. aureus, E. coli, DAN P. aeruginosa SERTA ISOLASI
SENYAWA AKTIFNYA
Nani Radiastuti, Dede Sukandar, dan Fiqi Khusnul Khotimah Program Studi Biologi FST UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ABSTRACT
The research done to isolation of component active of the essential clove bud oils (�yzygium arimaticum). An essential oil had been isolated using water desstilation method.Water distillation and chemical purity of the dry clove buds yielded 6.5% (v/w) essential oils. The physyco-chemical of essential clove bud oils are dark yellow oils, the refractive value (25° C) 1,5287��, density value (25° C) 1.0636 g/ml and solubility in ethanol 70% 1:2 (pure). The antibacterial activity of essential clove bud oils against B. subtilis, B. cereus, S. aureus, P. aeroginosa dan E. coli. The result indicated that essential clove bud oils have a potent antibacterial, the inhibitory effect of essential clove bud oils of B. subtilis (18,66 mm) and B. cereus (17.5 mm) started at consentration 2%, while inhibitory effect of E. coli (20.33 mm), P. aeruginosa (19.83 mm) and S. aureus (17 mm) at consentration ��%. The result of one way anova showed that essential clove bud oils have connectivity with inhibition diameter. GCM� analysis of the essential clove bud oils revealed that the component were eugenol (72.98%), eugenol acetate (15.58%), caryophyllene (10.��0%) and α-humulene (1.0��%). Component active of essential clove bud oils which inhibited five bacteria probably is eugenol.
Key words: clove, essential clove bud oils, antibacterial, GCM�, T�C
PENGANTAR
Bahan makanan merupakan media yang baik bagi pertumbuhan mikroorganisme. Mikroba perusak makanan dapat tumbuh pada kisaran suhu 4–66° C, aw (water activity)
sekitar 0,91 atau lebih, pH 4,6–7 dan membutuhkan oksigen. Pada kondisi tersebut mikroba perusak makanan yang berupa bakteri, khamir atau kapang dapat merusak karbohidrat, lemak dan protein sehingga makanan mengalami perubahan warna, bau, rasa, tekstur dan lain-lain.
Menurut Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 722/ Menkes/Per/IX/88, yang dimaksud dengan pengawet adalah bahan tambahan makanan yang mencegah atau menghambat fermentasi, pengasaman atau penguraian lain terhadap makanan yang disebabkan oleh mikroorganisme. Pengawet yang diijinkan penggunaannya dalam makanan antara lain asam benzoat, asam propionat, asam sorbat, natrium nitrit dan kalium sulfit.
Efektivitas dari bahan pengawet ditentukan oleh konsentrasi, jenis bahan pengawet, dan lingkungan bagi bahan pengawet itu ditambahkan. �mumnya semakin tinggi konsentrasi bahan pengawet yang diberikan semakin besar pula efektivitasnya, jika bahan pengawet tidak membahayakan bagi kesehatan. Sedangkan, menurut
Food and DrugsAdministration (FDA), keamanan suatu pengawet makanan harus mempertimbangkan jumlah yang
mungkin dikonsumsi dalam produk makanan atau jumlah zat yang akan terbentuk dalam makanan dari penggunaan pengawet, efek akumulasi pengawet dalam makanan dan potensi toksisitas yang dapat terjadi jika dicerna oleh manusia atau hewan termasuk potensi menyebabkan kanker. Tingginya permintaan konsumen terhadap makananTingginya permintaan konsumen terhadap makanan yang terbebas dari penambahan senyawa kimia sintesis melahirkan berkembangnya metode pengawetan dengan pengawet alami, contohnya, asam-asam organik dari fermentasi buah-buahan, komponen minyak atsiri dari ekstrak tumbuhan (rempah-rempah, tanaman tingkat tinggi dan rumput-tumputan). Rempah-rempah berfungsi sebagai bahan pemberi cita rasa khas pada makanan. Hasil penelitian Ağouğlu et al. (2007) menyatakan bahwa rempah-rempah seperti kunyit, kayu manis cengkeh, cabe merah tumbuk, fennel dan anise sebagai bahan tambahan makanan pada produk daging memiliki aktivitas antimikroba.
Cristina (�00�) menyatakan hasil pemeriksaan fitokimia pada ekstrak metanol, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi air menunjukkan bahwa cengkeh dan fraksi-fraksi bunga cengkeh mengandung tannin, polifenol, kuinon dan flavonoid yang diduga senyawa aktif antioksidan.
Ayoola et al. (2008) menyatakan minyak atsiri cengkeh yang diperoleh dari distilasi uap mengandung senyawa eugenol, eugenol asetat, kariopilena dan α-humulena. Minyak atsiri cengkeh berpotentsi sebagai antibakteri
terhadap �taphylococcus aureus ATTC 25923, Enterobacter
cloaceae, �almonella paratypi, �lebsiella pneumoniae,
Eschericha coli, Escherichia coli ATCC 35218, Citrobacter
spp, dan Candida albicans.
Berdasarkan latar belakang tersebut, penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi senyawa aktif minyak atsiri bunga cengkeh yang bersifat antibakteri dan membandingkan minyak atsiri bunga cengkeh dengan standar mutu SNI. Selain itu, senyawa aktif minyak asiri bunga cengkeh juga dikarakterisasi dengan �C-MS.
BAHAN DAN CARA KERJA
Penampung. Kadar minyak atsiri dinyatakan dalam persentase v/m sebagai berikut:
V
M �� 100%
V adalah volume minyak yang diperoleh (ml) dan M adalah massa bunga cengkeh kering (g).
Pemurnian Minyak Atsiri Bunga Cengkeh
Distilat bunga cengkeh dipisahkan menggunakan
rotary evaporator. Minyak bunga cengkeh dimasukan ke dalam Erlenmeyer 250 ml dan ditambahkan NaOH 1 N dengan perbandingan volume minyak dan NaOH 1:2 kemudian diaduk, campuran tersebut didiamkan di dalam penanggas es sampai terbentuk dua lapisan yaitu air dan persenyawaan lain (bagian atas) dan garam eugenolat yang berwarna putih dadih (bagian bawah) kemudian dipisahkan garam eugenolat dari lapisan atas.
�aram eugenolat diasamkan dengan H2SO4 2 N
dengan perbandingan volume garam eugenolat dan H2SO4 1:2, kemudian didiamkan di dalam penanggas es sampai terbentuk dua lapisan yaitu lapisan air (bagian atas) dan lapisan minyak (bagian bawah). Lapisan minyak tersebut dicuci dengan akuades kemudian dihilangkan sisa-sisa air yang terdapat pada minyak dengan Na2SO4 anhidrat
kemudian disaring.
Uji Penghambatan Bakteri
Bakteri untuk uji aktivitas bakteri adalah B. subtilis, B. cereus, �. aureus, P. aeroginosa dan E. coli. �ji antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar. Suspensi bakteri NB yang telah berumur fasemid log diambil 0,1 ml kemudian dimasukkan ke dalam 10 ml NA agar tegak yang telah dicairkan, divortex dan dituangkan ke dalam cawan petri steril. Setelah agar membeku dimasukan kertas cakram (diameter 16 mm) yang telah diteteskan minyak atsiri bunga cengkeh dengan konsentrasi (%v/v) 2%, 4%, 6%, 8%, 10% dan 100% sebanyak 0,03 ml.
Biakan bakteri ini diinkubasi dengan cara terbalik selama 24 jam pada suhu 37° C. Daerah bening disekitar kertas cakram menunjukan uji positif, sebagai kontrol digunakan kertas cakram yang telah diteteskan etanol 70%. Daerah bening yang terbentuk diukur dan dibandingkan dengan antibiotik amoksisilin (kontrol positif) dengan konsentrasi (%w/v) 2%, 4%, 6%, 8%, 10% dan 100% sebanyak 0,1 ml.
Identifikasi GC-MS
Minyak atsiri bunga cengkeh dimasukan ke dalam vial kemudian dilarutkan dengan petroleum eter, lalu sebanyak 1 ml sampel diinjeksikan ke dalam kolom Rtx® - 1MS
made in �SA crossbond® 100% dimethyl polysiloxane
(30 m × 0,�� mm/D, ketebalan film 0,�� mmdf), helium sebagai gas pembawa dan split rasio 1: 300. Temperatur oven diatur pada suhu 70° C selama 2 menit, perlahan-lahan temperatur ditingkatkan rata-rata 5° C permenit sampai 250° C dipertahankan selama 10 menit, sampel diinjeksi pada suhu 250° C. Senyawa yang terdapat dalam sampel diidentifikasi dengan membandingkan spektrum tersebut dengan senyawa yang terdapat di dalam library. sampel yang dibawa dari �C diteruskan sebagai sampel inlet MS, sumber ion pada suhu 250° C, fragmentasi ion yang terbentuk dideteksi oleh analyzer berdasarkan rasio massa.
HASIL
Uji Sifat Fisik dan Kimia Minyak Atsiri Bunga Cengkeh
Minyak atsiri bunga cengkeh memiliki sifat fisik dan kimia antara lain warna kuning kecoklatan, indeks bias (25°)°)) 1,52874, massa jenis (25°) 1,0636 g/ml, kelarutan dalam°) 1,0636 g/ml, kelarutan dalam) 1,0636 g/ml, kelarutan dalam etanol 70% pada perbandingan 1:� jernih. Sifat fisik dan kimia minyak atsiri bunga cengkeh hampir sama dengan mutu minyak atsiri bunga cengkeh SNI. Perbandingan mutuPerbandingan mutu minyak atsiri bunga cengkeh dengan standar SNI 06-4267-1996, tertera pada Tabel 1.
Tabel 1. Perbandingan mutu minyak atsiri bunga cengkeh dengan standar SNI-06-4267-1996. Parameter mutu Standar mutu SNI 06-4267-1996 Minyak atsiri bunga cengkeh
Warna Tak berwarna
– kuning muda
Kuning kecoklatan Bobot Jenis 25° C (g/ml) 1,030–1,060 1,0636 Indeks bias 25°° 1,527–1,535 1,52874 Kelarutan dalam etanol
70%
1:2 jernih, berikutnya jernih
1:2 jernih
Uji Antibakteri
�ji antibakteri minyak atsiri bunga cengkeh dilakukan dengan cara mengukur zona hambat (zona jernih). Bila senyawa aktif minyak atsiri bunga cengkeh menghambat pertumbuhan bakteri, maka akan terlihat zona hambat disekeliling kertas cakram. Konsentrasi minyak atsiriKonsentrasi minyak atsiri bunga cengkeh (%v/v) 100%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% dan 0% dalam etanol 70%. Penghambatan pertumbuhan bakteri terlihat dari zona hambat di sekeliling kertas cakram, luas zona hambat tergantung pada konsentrasi minyak atsiri bunga cengkeh.
Pada gambar 1 dijelaskan perbedaan zona hambat minyak atsiri bunga cengkeh masing-masing konsentrasi terhadap bakteri B. subtilis, B. cereus, E.coli, P. aeruginosa
dan �. aureus.
Gambar 1. Diameter zona hambat minyak atsiri bunga cengkeh terhadap bakteri.
Analisa GC-MS
Hasil analisa kormatogram �C menunjukan adanya 4 puncak yaitu adanya senyawa eugenol, kariopilena, α- α-humulena dan eugenol asetat (gambar 3).
Gambar 2. Diameter zona hambat amoksisilin terhadap bakteri.
PEMBAHASAN
Berdasarkan tabel di atas, minyak atsiri bunga cengkeh yang diperoleh berwarna kuning kecoklatan berbeda dengan standar SNI yaitu kuning muda, hal ini disebabkan komponen kimia minyak atsiri bunga cengkeh yang mudah teroksidasi oleh cahaya. Menurut �uenther (1987) minyak atsiri bunga cengkeh sangat peka terhadap proses oksidasi dan polimerisasi, minyak yang banyak mengandung terpen dan aldehid lebih mudah teroksidasi dan terpolimerisasi oleh cahaya, dan air dalam minyak
Minyak atsiri bunga cengkeh larut dalam alkohol pada perbandingan volume 1:2, mengingat etanol bersifat polar dan dapat melarutkan minyak atsiri bunga cengkeh pada perbandingan tersebut. Kemungkinan lain, adanya pencampuran bahan minyak atsiri bunga cengkeh dengan bahan lain dapat mempengaruhi kelarutan minyak atsiri bunga cengkeh. Hal ini dikarenakan terjadinya polimerisasi minyak selama penyimpanan, senyawa polimer yang terbentuk dapat menurunkan daya larutnya dalam alkohol.
Massa jenis minyak atsiri bunga cengkeh (25° C) sebesar 1,0636 g/ml termasuk dalam standar mutu minyak atsiri bunga cengkeh SNI pada suhu yang sama (1,030–1,060 g/ml). Menurut �uenther (1987) massa jenis berhubungan dengan fraksi berat komponen yang terkandung di dalamnya. Semakin besar fraksi berat yang terkandung dalam minyak atsiri bunga cengkeh semakin besar pula nilai densitasnya.
Indeks bias minyak atsiri bunga cengkeh (25°) sebesar 1,52874 termasuk dalam standar mutu SNI pada suhu yang sama (1,527–1,535). Menurut �uenther (1987) indeks bias dipengaruhi oleh komponen berantai panjang seperti seskuiterpen atau komponen bergugus oksigen ikut tersuling. Oleh sebab itu, kerapatan medium minyak atsiri bunga cengkeh akan bertambah, sehingga cahaya yang datang lebih sukar untuk dibiaskan. Nilai indeksNilai indeks bias juga dipengaruhi oleh adanya air dalam kandungan minyak. Semakin banyak kandungan airnya semakin kecil indeks biasnya, hal ini dikarenakan sifat air yang mudah membiaskan cahaya yang datang.
Konsentrasi 0% (etanol 70%) sebagai kontrol negatif menunjukan tidak adanya zona bening disekeliling kertas cakram pada masing-masing bakteri maka etanol 70% tidak menghambat pertumbuhan bakteri uji dan tidak mempengaruhi diameter zona hambat minyak atsiri bunga cengkeh.
Diameter zona hambat tertinggi minyak atsiri bunga cengkeh pada konsentrasi 2% adalah B. subtilis 18,66 mm dan B. cereus 17,5 mm. Sedangkan, P. aeruginosa, E. coli
serta �. aureus tidak terbentuk zona hambat, ketiga bakteri resisten terhadap minyak atsiri bunga cengkeh. Sehingga, penggunaan konsentrasi terendah minyak atsiri bunga cengkeh 2% lebih efektif untuk B. subtilis dan B. cereus.
Pada konsentrasi minyak atsiri bunga cengkeh 4% kelima bakteri uji dapat menghambat pertumbuhan bakteri, terlihat dari zona hambat yang berbeda-beda. Diameter zona hambat tertinggi minyak atsiri bunga cengkeh pada konsetrasi 4% adalah E. coli 20,33 mm dan terendah �. aureus 17 mm. Sehingga, penggunaan konsentrasi minyak atsiri bunga cengkeh 4% efektif untuk menghambat kelima bakteri uji. Sedangkan diameter zona hambat tertinggi minyak atsiri bunga cengkeh pada konsentrasi 6% adalah
B. cereus 22,66 mm dan terendah �. aureus 18,33 mm. Konsentrasi minyak atsiri bunga cengkeh 8% yang memiliki diameter zona hambat tertinggi adalah E. coli
27,83 mm dan terendah P. aeruginosa 22,33 mm, sehingga konsentrasi minyak atsiri bunga cengkeh 8% lebih efektif menghambat pertumbuhan E. coli dibandingkan bakteri lainnya.
Diameter zona hambat tertinggi minyak atsiri bunga cengkeh pada konsentrasi 10% dan 100% adalah B. subtilis
30 mm dan B. cereus 36,33 mm. Sedangkan, zona hambat terendah �. aureus 27,16 mm. Dari kelima variasi konsentrasi minyak atsiri bunga cengkeh ternyata menghambat pertumbuhan dengan zona hambat yang berbeda-beda sesuai dengan besarnya konsentrasi. Perbedaan konsentrasi mempengaruhi luas zona hambat, konsentrasi minyak atsiri bunga cengkeh semakin rendah luas zona hambat juga semakin rendah, dikarenakan kandungan aktif yang terlarut dalam etanol 70% juga semakin sedikit dan konsentrasi minyak atsiri bunga cengkeh semakin tinggi luas maka zona hambat juga semakin luas. Hal ini disebabkan karena kandungan bahan aktif dari konsentrasi yang tinggi juga meningkat.
Diantara semua bakteri uji, B subtilis bersifat paling efektif terhadap minyak atsiri bunga cengkeh karena memiliki daerah zona hambat yang paling luas pada konsentrasi terkecil. Selanjutnya E.coli, dan B. cereus
dapat dihambat oleh minyak atsiri bunga cengkeh lebih baik dibandingkan P. aeruginosa dan �.aureus..
Perbedaan daya hambat minyak atsiri bunga cengkeh terhadap semua bakteri uji diduga disebabkan karena perbedaan komponen dinding selnya. E. coli dan
P. aeruginosa merupakan bakteri �ram negatif yang mempunyai struktur dinding sel yang lebih kompleks dan mengandung komponen lipid lebih banyak dibandingkan dengan struktur dinding sel pada bakteri B. cereus, B. substilis dan �. aureus (�ram positif). Dengan demikian, dinding sel bakteri B. cereus, dan B. substilis lebih mudah dirusak oleh senyawa aktif yang terdapat pada minyak atsiri bunga cengkeh.
Berdasarkan hasil analisa statistika anova satu-arah menunjukan bahwa F hitung masing-masing konsentrasi minyak atsiri bunga cengkeh terhadap kelima bakteri lebih besar daripada F tabel 0,01 dan 0,05. Artinya perbedaan yang nyata antara konsentrasi minyak atsiri bunga cengkeh dengan diameter zona hambat. Hal ini menyebabkan ada hubungan antara variasi konsentrasi minyak atsiri bunga cengkeh dengan diameter zona hambat bakteri
B. subtilis, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa dan �. aureus. Dengan demikian, minyak atsiri bunga cengkeh memiliki potensi sebagai antibakteri terhadap kelima bakteri tersebut. Hasil penelitian Sulieman et al. (2007) minyak atsiri bunga cengkeh yang diperoleh dari distilasi uap dapat menghambat pertumbuhan bakteri E.coli, �. aureus, B. subtilis, Candida albican, Aspergillus niger dan �hizopus, hasil tersebut menunjukkan bahwa minyak atsiri bunga cengkeh berpotensi sebagai antimikroba.
�ji antibakteri amoksisilin sebagai kontrol positif, konsentrasi (% w/v) 100%, 10%, 8%, 6%, 4% dan 2% menghambat pertumbuhan bakteri terlihat dari zona hambat di sekeliling kertas cakram. Pada gambar 2 dijelaskan perbedaan zona hambat masing-masing konsentrasi amoksisilin terhadap bakteri B. subtilis, B. cereus, E.coli, P. aeruginosa dan �. aureus.
Pada konsentrasi 2–100% amoksisilin dapat menghambat pertumbuhan kelima bakteri uji dengan luas zona hambat yang berbeda-beda pada masing-masing bakteri uji. Diameter zona hambat tertinggi amoksisilin semua konsentrasi adalah E. coli. Sedangkan, terendah adalah P. aeruginosa. Karena amoksisilin lebih sensitif terhadap E. coli, terlihat dari luasnya zona bening di sekeliling kertas cakram.
Jika dibandingkan aktivitas antibakteri minyak atsiri bunga cengkeh dengan amoksisilin bahwa minyak atsiri bunga cengkeh menunjukkan aktivitas antibakteri lebih rendah daripada amoksisilin, karena kandungan aktif antibakteri amoksisilin lebih besar daripada kandungan aktif minyak atsiri bunga cengkeh. Sehingga amoksisilin lebih efektif menghambat pertumbuhan bakteri uji daripada minyak atsiri bunga cengkeh.
Berdasarkan data kromatogram di atas, puncak tertinggi dimiliki oleh senyawa dengan waktu retensi (Rt) 15,583 dan persen area sebesar 72,98% memiliki kemiripan 98% dengan senyawa eugenol. Hal ini menguatkan dugaan bahwa hasil isolat minyak atsiri bunga cengkeh mengandung senyawa eugenol. Analisis MS terhadap puncak hasil �C dengan Rt 15,583 dari isolat minyak atsiri bunga cengkeh menunjukkan bahwa massa molekul relatif eugenol adalah 164 dengan rumus molekul C10H12O2
Senyawa dengan Rt 17,787 dan persen area sebesar 10,40% memiliki kemiripan 97% dengan senyawa
kariopilena. Hal ini menguatkan dugaan bahwa hasil isolat minyak atsiri bunga cengkeh mengandung senyawa seskuiterpen yaitu kariopilena. Analisis MS terhadap puncak hasil �C dengan Rt 17,787 dari isolat minyak atsiri bunga cengkeh menunjukkan bahwa massa molekul relatif kariopilena adalah 204 dengan rumus molekul C15H24.
Senyawa dengan Rt 18,600 dan persen area sebesar 1,04% memiliki kemiripan 9�% dengan senyawa α- α--humulena. Hal ini menguatkan dugaan bahwa hasil isolat minyak atsiri bunga cengkeh mengandung senyawa seskuiterpen lain yaitu α-humulena. Analisis MS terhadapα-humulena. Analisis MS terhadap-humulena. Analisis MS terhadap puncak hasil �C dengan Rt 18,600 dari isolat minyak atsiri bunga cengkeh menunjukkan bahwa massa molekul relatif α-humulena adalah �04 dengan rumus molekul C-humulena adalah 204 dengan rumus molekul C15H24 KEPUSTAKAAN
Ağaoğlu, Sema, Hursel Dosbil dan Suleyman. �007. Antimicrobial Activity of Some Spices �sed in Meat Industry. Turkey: Bull Vet �nst Pulawy 51:53–57.
Ayoola, Lawore, Adelowotan, Aibiniu, Adenipenikun, Caker, dan Odugbemi. 2008. Chemical Analysis and Antimicrobial Activity of the Essential Oil of �yzygium aromaticum. African: African Journal of Microbiology �esearch. Vol.(2) pp. 162–166, July, 2008
Cristina, 2002. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Biji Pala, Bunga Cengkeh dan Buah Cabe Jawa dengan Metode NBT (Nitroblue Tetrazolium). lib.farmasi.unpad.ac.id.
�uenther Ernest diterjemahkan oleh Ketaren, 1987. MinyakAtsiriMinyak Atsiri jilid IVB. �I-PRESS, Jakarta.
Sulieman Abdel Moneim E, El Boshra, Iman MD and Amin A El Khalifa, 2007. Nutritive Value of Clove (Syzygium aromaticum) and Detection of Antimicrobial Effect of its Bud Oil. Sudan: �esearch Journal of Microbiology 2(3): 266–271, 2007. ISSN 1816–4935.
