Desain DNA Probe Secara In Silico Sebagai Pendeteksi Mutasi Pada Kodon 315 Gen katG Mycobacterium tuberculosis Untuk Metode Real-Time Polymerase Chain Reaction.

(1)

Mycobacterium tuberculosis

TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

FAKULTAS MATEMATIKA DAN

Mycobacterium tuberculosis

UNTUK METODE

Skripsi

KADEK WIDYA YULIHARTATI 1208505010

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA

2016

UNTUK METODE

REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

(2)

DESAIN DNA

PENDETEKSI MUTASI PADA KODON 315 GEN

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

DESAIN DNA

PROBE

SECARA

IN SILICO

UNTUK METODE

Skripsi

KADEK WIDYA YULIHARTATI 1208505010

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA

2016

IN SILICO

SEBAGAI

katG

UNTUK METODE

(3)

(4)

FAKULTAS MATEMATIKA DAN

UNTUK METODE

Skripsi

KADEK WIDYA YULIHARTATI

1208505010

JURUSAN FARMASI

UNIVERSITAS UDAYANA

2016

UNTUK METODE

(5)

DESAIN DNA

PROBE

SECARA

IN SILICO

UNTUK METODE

Skripsi

KADEK WIDYA YULIHARTATI

1208505010

JURUSAN FARMASI

UNIVERSITAS UDAYANA

2016

IN SILICO

SEBAGAI

katG

UNTUK METODE

(6)

(7)

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan Skripsi yang berjudul “DESAIN DNA PROBE SECARA IN SILICO SEBAGAI PENDETEKSI MUTASI PADA KODON 315 GEN

katGMycobacterium tuberculosis UNTUK METODE REAL-TIME

POLYMERASE CHAIN REACTION”. Skripsi ini diajukan sebagai syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.

Penulisan Skripsi ini tidak terlepas dari dukungan dan bantuan berbagai pihak secara langsung dan tidak langsung. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada:

1. Bapak Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M.Si, selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.

2. Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Udayana.

3. Putu Sana Yustiantara, S.Farm., M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing I yang telah membimbing hingga akhir penyusunan Skripsi ini.

4. Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing II yang membimbing dan memotivasi demi kelancaran penyusunan Skripsi ini. 5. Rasmaya Niruri, S.Si., M.Farm.Klin., Apt., Luh Putu Mirah Kusuma Dewi,

(8)

6. Seluruh dosen pengajar beserta pegawai di Jurusan Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Udayana yang telah membina penulis dan membantu memenuhi kelengkapan administratif.

7. Kedua orang tua penulis, I Nyoman Wardana dan Ni Ketut Mariani yang tidak berhenti memberikan dukungan moral, materiil, doa dan semangat.

8. Saudara penulis Rida Ari Anggraeni (Mida) yang selalu mendukung dan memberikan semangat dan nasihat bagi penulis.

9. Mtb team (Dek tri, Rai, Linda, Ratih, Ebi) dan kakak kelas dari Mtb team

yang telah menjadi teman diskusi, memberi saran untuk kelancaran penyusunan Skripsi ini.

10.Teman-teman TANPO (Tantri, Novi, Anggi, Lina, Linda, Sarah, dan Meci) yang selalu menghibur dan memotivasi penulis.

11.Teman Dioscury Hygeia dan pihak-pihak lain yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu.

Penulis sepenuhnya menyadari bahwa penulisan Skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak demi karya yang lebih baik di masa yang akan datang. Semoga Skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.

Bukit Jimbaran, 8 Juni 2016

(9)

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... i

LEMBAR PENGESAHAN ... ii

KATA PENGANTAR ... iii

DAFTAR ISI ... v

DAFTAR SINGKATAN ... viii

DAFTAR SINGKATAN ASAM AMINO ... x

DAFTAR ISTILAH ... xi

DAFTAR TABEL ... xiii

DAFTAR GAMBAR ... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ... xv

ABSTRAK ... xvi

ABSTRACT ... xvii

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Rumusan Masalah ... 5

1.3 Tujuan Penelitian ... 6

1.4 Manfaat Penelitian ... 6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 7

2.1 Tuberkulosis (TB) ... 7

2.2 Genom Mycobacterium tuberculosis ... 8

(10)

2.4 Mutasi Gen ... 11

2.5 Resistensi Isoniazid (INH) ... 12

2.6 Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real-Time PCR) ... 14

2.7 DNA Probe ... 15

BAB III METODE PENELITIAN ... 20

3.1 Rancangan Penelitian ... 20

3.2 Batasan Operasional Penelitian ... 21

3.3 Lokasi dan Waktu Penelitian ... 21

3.4 Bahan Penelitian ... 22

3.5 Alat Penelitian ... 23

3.6 Prosedur Penelitian ... 23

3.6.1Urutan Nukleotida Target Perancangan DNA Probe Mutan ... 23

3.6.2Perancangan DNA Probe ... 25

3.6.3Analisis Hasil Perancangan DNA Probe ... 25

3.7 Penyimpulan Hasil Penelitian ... 27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 28

4.1 Urutan Nukleotida Target Perancangan DNA Probe Mutan ... 28

4.2 Hasil Perancangan DNA Probe ... 30

4.3 Hasil Analisis Rancangan Probe Mutan ... 33

4.3.1Hasil Analisis Kriteria Umum Probe Mutan ... 33

(11)

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 51

5.1 Kesimpulan ... 51

5.2 Saran ... 51

DAFTAR PUSTAKA ... 52

(12)

DAFTAR SINGKATAN

Cy3 : Cyanine-3 Cy5 : Cyanine-5

DNA : Deoxyribonucleic acid

dNTP : Deoxynucleotide triphosphates

FAM : 6-carboxyfluorescein

FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer

GC : Guanin-Sitosin

HIV : Human Immunodeficiency Virus

INH : Isoniazid

MDR : Multi-drug resistant

MIC : Minimum Inhibitory Concentration

NADH : Nicotinamide Adenine Dinucleotide

OAT : Obat Anti Tuberkulosis pb : pasang basa

PCR : Polymerase Chain Reaction

PE : Prolin Glutamat

PGRS : Polymorphic GC-rich repetitive sequences

PPE : Prolin Prolin Glutamat ROX : 6-Carboxyl-X-Rhodamine

(13)

Taq : Thermus aquaticus

TB : Tuberkulosis Tm : Melting temperature

tRNA : Transfer Ribonucleic Acid

WHO : World Health Organization

VIC : 4,7,2’-trichloro-7’-phenyl-6-carboxyfluorescein

(14)

DAFTAR SINGKATAN ASAM AMINO

(15)

DAFTAR ISTILAH

Amplifikasi DNA : Perbanyakan DNA

Asam amino : Unit monomer penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida

Dimer : Primer mengalami hibridisasi secara bersama-sama DNA polimerase : Enzim yang diperlukan dalam proses sintesis DNA Fluoresensi : Pemancaran sinar oleh suatu zat yang telah menyerap

sinar atau radiasi elektromagnetik lain

Fluorophore : Komponen kimia yang dapat mengemisikan kembali cahaya pada proses eksitasi

Gen : Urutan DNA yang menyandi suatu protein

H37Rv : Galur standar yang dijadikan wild type M. tuberculosis Hairpin : Struktur lengkungan yang dibentuk oleh DNA tunggal

akibat adanya suatu bagian tertentu dari DNA yang terhibridisasi pada bagian komplemen di dalam untai DNA yang sama

Hibridisasi : Proses pemasangan antara DNA yang menjadi sasaran dan DNA pelacak.

In silico : Menggunakan komputerisasi

Kodon : Deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam amino tertentu

(16)

Mutasi DNA : Perubahan basa dari urutan nukleotida yang lazim dari suatu sekuen DNA organisme yang dapat menyebabkan perubahan sifat fenotip

Nukleotida : Unit monomer pembentuk DNA

PCR (Polymerase : Teknik amplifikasi sekuens DNA dengan menggunakan reaksi enzimatis

Primer : Oligonukleotida pendek yang komplementer dengan urutan nukleotida template DNA

DNA Probe : Molekul asam nukleat berupa rantai tunggal DNA yang memiliki afinitas kuat dengan target spesifik yang berupa urutan DNA atau RNA.

Prodrug : Senyawa yang tidak aktif namun di dalam tubuh dapat menjadi aktif karena proses enzimatik

Repeat : Pengulangan dinukleotida secara berurutan

Resistensi : Hilangnya sensitivitas bakteri terhadap obat yang sebelumnya dapat membunuh bakteri

Runs : Pengulangan basa tunggal sama secara berurutan

Template DNA : DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan

Tetraplex : Struktur DNA yang dibentuk dari urutan kaya G yang terjadi antara empat basa guanin melalui ikatan hidrogen

Wild type : Bakteri yang tidak mengalami mutasi dan digunakan sebagai sekuen pembanding terjadinya mutasi

(17)

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Perubahan Asam Amino Akibat Mutasi Pada Kodon 315 ... 11

Tabel 3.1 Hasil Kriteria Primer Yang Telah Didesain Secara In Silico dengan Clone Manager Suite 6 ... 22

Tabel 3.2 Perubahan Nukleotida Kodon 315 Gen katG Mycobaterium tuberculosis Untuk Perancangan DNA Probe Mutan ... 24

Tabel 3.3 Format Tampilan Hasil Analisis Awal Probe Mutan ... 26

Tabel 3.4 Analisis Tahap Akhir Probe Mutan ... 27

Tabel 4.1 Hasil Analisis Tahap Awal Probe Mutan Untuk Kodon 315 ... 35

(18)

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Genom Mycobacterium tuberculosis H37Rv secara sirkuler ... 9

Gambar 2.2 Skema Daerah furA-katG M. tuberculosis ... 10

Gambar 2.3 Struktur Kimia Isoniazid ... 13

Gambar 2.4 Mekanisme Kerja TaqMan Probe ... 19

Gambar 3.1 Skema Alur Penelitian Desain DNA Probe Secara In Silico ... 20

Gambar 3.2 Urutan Nukleotida Gen katG Mycobacterium tuberculosis Yang Dijadikan Target Perancangan DNA Probe ... 24

Gambar 4.1 Pengaruh Posisi Mutasi Terhadap Hibridisasi Probe ... 32

Gambar 4.2 Contoh Tampilan Hasil Analisis Tahap Awal Pada Software ... 34

Gambar 4.3 Runs Pada Desain Probe Mutan K315MR8 ... 40

Gambar 4.4 Hasil Analisis Dimer Pada Desain Probe Mutan K315MN23 .... 41

Gambar 4.5 Penggambaran struktur hairpin yang dibentuk oleh probe mutan K315MT1 dengan Clone Manager Suite 6 ... 42

Gambar 4.6 Posisi Basa G Pada Probe K315MT4, K315MV4, dan K315MN3 ... 44

Gambar 4.7 Pelabelan Desain Probe K315MT1 ... 47

(19)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1 Peta Urutan Nukleotida Gen katG Mycobacterium tuberculosis ... 59 Lampiran 2 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi

S315T Dengan Clone Manager Suite 6 ... 61 Lampiran 3 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi

S315N Dengan Clone Manager Suite 6 ... 62 Lampiran 4 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi

S315R Dengan Clone Manager Suite 6 ... 63 Lampiran 5 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi

S315G Dengan Clone Manager Suite 6 ... 64 Lampiran 6 Hasil Perancangan In Silico Probe Mutan Spesifik Mutasi

S315V Dengan Clone Manager Suite 6 ... 65 Lampiran 7 Hasil Analisis Probe Mutan K315MT1 Dengan Software

Clone Manager Suite 6 ... 66 Lampiran 8 Hasil Analisis Probe Mutan K315MN5 Dengan Software

Clone Manager Suite 6 ... 67 Lampiran 9 Hasil Analisis Probe Mutan K315MN23 Dengan Software

(20)

ABSTRAK

Resistensi tingkat tinggi terhadap isoniazid sebagai salah satu obat lini pertama tuberkulosis dapat disebabkan oleh mutasi kodon 315 gen katG Mycobacterium tuberculosis. Mutasi pada kodon 315 adalah mutasi yang paling sering terjadi dengan variasi asam amino paling tinggi, dibandingkan kodon lain pada gen katG Mycobacterium tuberculosis. Oleh karena itu, probe yang spesifik diperlukan untuk deteksi cepat dan tepat adanya mutasi pada kodon 315. Pada penelitian ini, perancangan urutan nukleotida probe dengan pelabelan TaqMan

dilakukan menggunakan software Clone Manager Suite 6. Probe mutan yang diperoleh, dianalisis dua tahap. Analisis tahap awal didasarkan pada panjang

probe (22-30 basa), Tm (70ºC), %GC (35-65%), tidak terbentuk hairpin, dimer (< 5 basa), runs dan repeat (≤ 4 untuk basa A, T, C, dan < 3 untuk basa G). Selanjutnya dilakukan analisis tahap akhir dengan kriteria, yaitu tidak terdapat basa G pada 2 basa di ujung 5’ probe dan jumlah basa C ≥ G.

Penelitian menghasilkan 260 probe mutan. Setelah analisis tahap awal diperoleh 11 probe mutan yang mampu mengenali mutasi pada kodon 315 gen

katG Mycobacterioum tuberculosis. Probe tersebut terdiri dari 2 probe untuk mutasi S315T, 6 probe untuk mutasi S315N, dan 3 probe untuk mutasi S315V. Kriteria yang dimiliki 11 probe mutan adalah panjang 22-23 basa, Tm 70ºC, % GC 56-63%, 4 dimer, 2 runs, dan tidak memiliki repeats dan tidak membentuk

hairpin pada suhu 56ºC. Berdasarkan analisis tahap akhir, diperoleh 3 probe

mutan memenuhi kriteria pelabelan TaqMan probe, yaitu K315MT1 untuk deteksi spesifik mutasi S→T serta K315MN5 dan K315MN23 untuk deteksi spesifik mutasi S→N.

Kesimpulan dari penelitian ini adalah urutan nukleotida probe mutan terbaik untuk deteksi adanya mutasi pada kodon 315 gen katG Mycobacterium tuberculosis, yaitu 5’-FAM-CC ACC GGC ATC GAG GTC GTA TG-TAMRA-3’; 5’FAM-ATC ACC AAC GGC ATC GAG GTC G-TAMRA-TG-TAMRA-3’; dan 5’FAM-C ACC AAC GGC ATC GAG GTC GTA T-TAMRA-3’. Rancangan probe mutan yang telah sesuai dengan kriteria TaqMan probe untuk real-time PCR diperoleh sebanyak 3 probe dari 11 probe mutan terpilih pada analisis tahap awal.

Kata kunci: Tuberkulosis, mutasi gen katG, in silico, TaqMan probe, real-time

(21)

ABSTRACT

High level resistance of isoniazid as one of first-line tuberculosis drugs can be caused by mutations at codon 315th in katG gene of Mycobacterium tuberculosis. Mutation at codon 315 is the most often case and has the highest amino acid variations, compared to the other codons in the katG gene of

Mycobacterium tuberculosis. Therefore, specific probes required for rapid and precisely detection of mutations at codon 315. In this study,the nucleotide sequence with TaqMan probe was designed by using Clone Manager Suite 6 Software. Probe mutants were analyzed in two stages. Analysis of the initial stages of the probe based on length of the probe (22-30 bases), Tm (70ºC), %GC (35-65%), non-hairpin formed, dimer (<5 bases), runs and repeats (≤ 4 for bases A, T, C, and < 3 to the base G). The analysis of final stage is based on no G at two first bases in the 5’ position of probe and amount of C ≥ G.

The result has 260 mutant probes. After the initial stage of analysis, obtained 11 mutant probe that capable of recognize a mutation at codon 315th in

katG gene of Mycobacterioum tuberculosis. Those probe consists of 2 probes for mutation S315T, 6 probes for mutation S315N, and 3 probes for mutation S315V. Criteria of 11 mutant probe were 22-23 bases long, Tm 70ºC,% GC 56-63%, 4 dimers, 2 runs, and does not have repeats and does not form a hairpin at a temperature of 56ºC. Based on the analysis of the final stage, gained 3 mutant probes meet the labeling criteria of TaqMan probe, namely K315MT1 for the specific detection of mutation S→T, K315MN5 and K315MN23 for the specific detection of mutation S→N.

The conclusion of this study was nucleotide sequence of best mutant probes for the detection of mutation at codon 315th in katG gene of

Mycobacterium tuberculosis, that are 5’-FAM-CC ACC GGC ATC GAG GTC GTA TTAMRA-3’; 5’FAM-ATC ACC AAC GGC ATC GAG GTC G-TAMRA-3’; and 5’FAM-C ACC AAC GGC ATC GAG GTC GTA T-TAMRA-3’. Design of mutant probes which were accordanced with the criteria of TaqMan probe for real-time PCR obtained as many as 3 of 11 mutant probes selected at initial stage of analysis.