IMUNOEKSPRESI KI-67 PADA TUMOR PAYUDARA TIKUS WISTAR
YANG DIINOKULASI TUMOR TERINDUKSI BENZO(Α)PYRENE
DAN DIBERIKAN EKSTRAK DAUN SIRSAK
TESIS
MEGA SARI SITORUS NIM. 087108008
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS I DEPARTEMEN PATOLOGI ANATOMI
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
IMUNOEKSPRESI KI-67 PADA TUMOR PAYUDARA TIKUS WISTAR
YANG DIINOKULASI TUMOR TERINDUKSI BENZO(Α)PYRENE
DAN DIBERIKAN EKSTRAK DAUN SIRSAK
TESIS
Untuk Memperoleh Gelar Spesialis Patologi Anatomi Dalam Program Pendidikan Dokter Spesialis I Pada Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara
MEGA SARI SITORUS NIM. 087108008
PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS I DEPARTEMEN PATOLOGI ANATOMI
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
Judul Penelitian : Imunoekspresi Ki-67 Pada Tumor Payudara Tikus Wistar
Yang Diinokulasi Tumor Terinduksi Benzo(Α)Pyrene
Dan Diberikan Ekstrak Daun Sirsak Nama : Mega Sari Sitorus
NIM : 087108008
Program Studi : Program Pendidikan Dokter Spesialis Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara
TESIS INI TELAH DIPERIKSA DAN DI SETUJUI OLEH : PEMBIMBING I
dr. H. Joko S.Lukito,SpPA(K) 19460308 197802 1 001
PEMBIMBING II
Prof. Dr.Drs. Syafruddin Ilyas, M.Biomed 19660209 199203 1 003
Ketua Program Studi Ketua Departemen Patologi Anatomi FK-USU Patologi Anatomi FK-USU
PERNYATAAN
IMUNOEKSPRESI KI-67 PADA TUMOR PAYUDARA TIKUS
WISTAR YANG DIINOKULASI TUMOR TERINDUKSI
BENZO(Α)PYRENE
DAN DIBERIKAN EKSTRAK DAUN SIRSAK
TESIS
Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam tesis ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Medan, 12 Oktober 2012
LEMBAR PANITIA UJIAN
Judul Tesis : Imunoekspresi Ki-67 Pada Tumor Payudara Tikus Wistar Yang Diinokulasi Tumor Terinduksi Benzo(Α)Pyrene Dan Diberikan Ekstrak Daun Sirsak
Telah diuji pada :
Hari/ Tangga : 24 September 2012
Pembimbing : dr.H.Joko S.Lukito,Sp.PA
Prof.Dr. Drs. Syafruddin Ilyas, M.Biomed
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Kuasa atas berkat dan karuniaNya,
sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dengan judul : “Imunoekspresi Ki-67 Pada Tumor Payudara Tikus Wistar Yang Diinokulasi Tumor Terinduksi
Benzo(Α)Pyrene Dan Diberikan Ekstrak Daun Sirsak”. Tesis ini merupakan salah satu syarat yang harus dilaksanakan penulis dalam rangka memenuhi persyaratan untuk meraih gelar keahlian dalam Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Anatomi pada Fakultas Kedokteran Universits Sumatera Utara.
Dengan selesainya tesis ini, perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
Rektor Universitas Sumatera Utara, Prof. dr. Syahril pasaribu, DTM&H, SpPA dan seluruh jajarannya yang telah memberikan kesempatan pada penulis untuk mengkuti pendidikan pada Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Anatomi pada Fakultas Kedokteran Universits Sumatera Utara.
Dekan Fakultas Kedokteran USU, Prof. dr. Gontar A. Siregar, SpPD, KGEH, atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Anatomi pada Fakultas Kedokteran Universits Sumatera Utara.
Terima kasih yang tidak terhingga dan penghargaan setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada dr.H.Joko S.Lukito,Sp.PA(K) (pembimbing I) dan Prof. Dr. Drs. Syafruddin Ilyas, M.Biomed (pembimbing II) yang dengan penuh perhatian dan kesabaran telah mengorbankan waktu untuk memberikan dorongan, bimbingan, bantuan serta saran-saran yang bermanfaat kepada penulis mulai dari persiapan penelitian sampai pada penyelesaian tesis ini.
Terima kasih kepada Prof. dr. Gani W. Tambunan, SpPA(K) dan dr. Soekimin, SpPA yang telah bersedia menguji tesis penelitian penulis.
dan di RSUP H. Adam Malik Medan, dan tidak lupa penulis mengucapkan terima kasih kepada seluruh staf di Departemen Patologi Anatomi FK USU dan RSUP H. Adam Malik Medan yang telah membantu penulis menyelesaikan tesis ini.
Persembahan terima kasih, rasa hormat kepada ayahanda (Drs. W.Sitorus) dan ibunda tercinta (Alm. L. Sianipar), yang telah membesarkan, membimbing dengan penuh kasih saying dan jasa mereka inilah penulis dapat menjalani Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Anatomi FK USU. Semua Tuhan Yesus memberkati ayahanda dan ibunda.
Kepada suamiku tercinta Jun F. Purba, anak-anak tersayang Otniel Franga Mori Purba, Sebastian Franga Purba, Theeyo Franga Purba, tiada kata yang setara untuk mengutarakan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya atas cinta, kasih sayang, pengertian, pengorbanan, kesabaran dan dorongan serta doa yang diberikan kepada penulis.
Akhirnya penulis menyadari bahwa isi hasil penelitian ini masih perlu mendapat masukan untuk kesempurnaan. Oleh karena itu penulis berharap adanya kritik serta saran untuk penyempurnaan tulisan ini. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi kita semua.
Medan, 12 Oktober 2012 Penulis
DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PERSETUJUAN i
PERNYATAAN ii
LEMBAR PANITIA UJIAN iii
UCAPAN TERIMA KASIH iv
DAFTAR ISI vii
1.2. Perumusan Masalah 5
1.3. Hipotesa 5
1.4. Tujuan Penelitian 5
1.4.1. Tujuan Umum 5
2.1.2. Pengaturan Siklus Sel 8
2.1.3. Apoptosis 10
2.2. Kanker Payudara 11
2.2.1. Epidemiologi Kanker Payudara 11
2.2.2. Faktor Risiko 12
2.2.3. Etiologi dan Patogenesis 14
2.2.4. Penatalaksanaan 16
2.3. Ki-67 Sebagai Petanda Proliferasi 17
2.4. Tanaman Sirsak (Anonna muricata) 17
2.4.1. Morfologi Tumbuhan Sirsak 18
2.4.2. Manfaat Tanaman Sirsak 20
2.4.2.1. Annonaneous acetogenins (ACGs) 21 2.4.2.2. Bukti Penelitian Manfaat Daun
Sirsak 23
BAB 3 METODE PENELITIAN 27
3.1. Desain Penelitian 27
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian 27
3.3. Rancangan Penelitian 27
3.4. Populasi dan Sampel Penelitian 28
3.4.1. Populasi 28
3.4.2. Sampel 29
3.4.3. Cara Pengambilan Sampel 29
3.5. Variabel Penelitian 29
3.5.1. Variabel Bebas 30
3.5.2. Variabel Tergantung 30
3.6. Bahan dan Alat 30
3.6.1. Bahan untuk perlakuan 30
3.6.2. Bahan transplantasi jaringan tumor pada tikus
31 3.6.3. Bahan untuk pemeriksaan histopatologi dan
immunohistokimia
31 3.6.4. Alat transplantasi jaringan tumor pada tikus 31 3.6.5. Alat-alat untuk pewarnaan HE dan
imunohistokimia
32
3.7. Aur Kerja 33
3.8. Definisi Operasional 34
3.9. Pemeliharaan Tikus Wistar 35
3.10. Persiapan Hewan Percobaan 35
3.11. Prosedur Kerja 36
3.11.1.Induksi kanker payudara oleh benzoalphapyrene
36 3.11.2. Prosedur transplantasi tumor 36 3.11.3. Pengamatan morfologi benjolan, perubahan
berat badan tikus
38 3.11.4. Pembuatan ekstrak daun sirsak dan suspensi
ekstrak daun sirsak
38 3.11.5. Pencekokan suspensi ekstrak daun sirsak 39
3.11.6. Prosedur pembuatan slide HE 39
3.11.7. Prosedur imunohistokimia 40
3.12. Analisis Data 42
BAB 4 HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 42
4.1. Hasil Penelitian 42
4.1.1. Deskripsi Lokasi Penelitian 42
4.1.2. Karakteristik Sampel 42
4.1.3. Suspensi ekstrak daun sirsak 42
4.1.5. Rata-rata perubahan berat badan tikus selama penelitian
45 4.1.6. Makroskopis massa di payudara tikus 45
4.1.7. Mikroskopis massa 47
4.1.8. Tampilan imunohistokimia Ki-67 pada massa payudara tikus
48
4.2. Pembahasan 51
4.2.1. Perubahan berat badan tikus selama penelitian
51 4.2.2. Kejadian timbulnya massa di payudara tikus 52 4.2.3. Tampilan imunohistokimia Ki-67 di massa 53 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan 55
5.2. Saran 55
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 2.1. Nama-nama sirsak pada berbagai negara 20 Tabel 4.1 Rata-rata perubahan berat badan tikus setiap minggu 45
Tabel 4.2. Berat massa di payudara tikus 46
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1. Siklus sel 8
Gambar 2.2. Regulasi Siklus Sel 10
Gambar 2.3. Pohon sirsak dan buahnya 19
Gambar 2.4. Tempat kerja ACGs pada chemiosmosis di mitokondria
22
Gambar2.5. Skema kerangka teori penelitian 26
Gambar 3.1. Alur Kerja 33
Gambar 4.1. Mikroskopik sel yang terlihat dari bubur tumor 44
Gambar 4.2. Makroskopis tumor. 45
Gambar 4.3. Sediaan histopatologi massa 47
Gambar 4.4. Histopatologis massa 47
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Ethical Clearence 61
Lampiran 2 Master Data 62
Lampiran 3 Uji Statistik Tampilan Ki-67 63
Lampiran 4 Output Pengolahan dan Analisa Data Berat Badan dengan SPSS versi 18.0
65
Lampiran 5 Karakterisasi Ekstrak Daun Sirsak 69
Lampiran 6 Karakterisasi kadar Sari Larut Ekstrak Daun Sirsak 70
DAFTAR SINGKATAN
SIRS : Sistem Informasi Rumah Sakit
CFR : Case Fatality Rate
PAH : polycyclic aromatic hydrocarbons
ITB : Institut Teknologi Bandung
ATP : Adenosine Tri Phosphat
DNA : Deoxyribonucleic Acid
NADH : Nicotinamide adenine dinucleotide
USU : Universitas Sumatera Utara
FMIPA : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
RAL : Rancangan Acak Lengkap
HE : Hematoksilin Eosin
DAB : Diamino Benzydine
ABSTRAK
Imunoekspresi Ki-67 Pada Tumor Payudara Tikus Wistar Yang
Diinokulasi Tumor Terinduksi Benzo(Α)Pyrene
Dan Diberikan Ekstrak Daun Sirsak
(Hasil Penelitian)Mega Sari Sitorus, Joko S. Lukito, Syafruddin Ilyas
Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Departemen Biologi Fakultas FMIPA, USU Medan.
Latar Belakang: Meningkatnya jumlah sel dalam populasi tertentu dapat terjadi karena peningkatan proliferasi ataupun karena penurunan kematian atau diferensiasi sel. Proliferasi yang tinggi pada suatu tumor, khususnya kanker dapat menunjukkan prognosis dan agresifitas tumor. Bahan aktif daun sirsak yaitu
Annonaceous acetogenins(ACGs) diteliti memiliki sifat sitotoksik (antitumor) akibat inhibisi kerja NADH-ubiqiunone oxidireductase (NADH-dehydrogenase atau complex I). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh eskstrak daun sirsak terhadap pertumbuhan tumor yang dinilai berdasarkan imunoekspresi Ki-67. Metode: Penelitian ini menggunakan tikus Wistar yang telah diinokulasikan kanker, dan dibagi dalam 5 kelompok, yaitu C1, T1, C2, T2 dan T3. Kelompok T1dan T2 diberikan ekstrak daun sirsak 2 mg/hr, dan kelompok T3 dengan dosis 4 mg/hr. Sedangkan kelompok C1 dan C2 merupakan kelompok kontrol, hanya diberikan diet standar. Tumor yang tumbuh diambil, dibuat sediaan HE dan dipulas dengan pulasan imunohistokimia Ki-67.
Hasil: Dengan uji Kruskal-Wallis didapati perbedaan bermakna antara kelima kelompok yaitu p=0,02 (P<0,05). Dilanjutkan dengan uji Mean-Whitney antara C1 dan T1 didapati perbedaan bermakna imunoekspresi dengan p=0,04 (P<0,05). Terdapat perbedaan bermakna imunoekspresi Ki-67 pada kelompok C2 dan T2 yaitu p=0,017 (P<0,05).
Kesimpulan: Daun sirsak dapat menghambat pertumbuhan tumor dosis 2 mg/hari dan 4 mg/hari.
ABSTRACT
Ki-67 Immunoexpressions of breast tumour Witar rat which were inoculated tumour activated
Benzo(Α)Pyrene
dan treated by extract of soursop .
(Result Result)
Mega Sari Sitorus, Joko S. Lukito, Syafruddin Ilyas
Department of Pathology Faculty of Medicine, Biology Departement of FMIPA, University of North Sumatra, Medan.
Background: Increased cell population as result of proliferation increasing or decreased of death or differentiation cell. Tumors, mainly cancers which has higher proliferation activity, show prognostic factor and tumor aggressiveness.
Annonaceous acetogenins(ACGs) which are the active agent of soursop leaves have a potential cytotoxic (antitumor) effect through inhibiting work on NADH-ubiqiunone oxidireductase (NADH-dehydrogenase or complex I). The purpose of this research to explore the impact of soursop leaves extract (anonna muricata) against tumor growth based on Ki-67 immunoexpression.
Methods: This study used Wistar rats inoculated cancer, were divided into five groups C1, T1, C2, T2 and T3.T1 and T2 group was given soursop extract with dose of 2mg/day and T3 with dose of 4 mg/day. Meanwhile C1 and C2 group only feed by standart diet. The mass from rat is incised and prepared to slide histopathologic. Immunohistochemical with Ki-67 were performed.
Result: There is significance expression within five groups with Kruskal-Wallis test p=0,02 (P<0,05). Mean–Whitnet test between C1 and T1 showed there is a significance difference expression with p=0,04 (p<0,05). There is also a significance difference Ki-67 expression in C2 and T2 group p=0,017 (P<0,05). Conclusion: Soursop leaves at 2 mg/day and 4 mg/day doses can be used to inhibit tumour growth.
ABSTRAK
Imunoekspresi Ki-67 Pada Tumor Payudara Tikus Wistar Yang
Diinokulasi Tumor Terinduksi Benzo(Α)Pyrene
Dan Diberikan Ekstrak Daun Sirsak
(Hasil Penelitian)Mega Sari Sitorus, Joko S. Lukito, Syafruddin Ilyas
Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Departemen Biologi Fakultas FMIPA, USU Medan.
Latar Belakang: Meningkatnya jumlah sel dalam populasi tertentu dapat terjadi karena peningkatan proliferasi ataupun karena penurunan kematian atau diferensiasi sel. Proliferasi yang tinggi pada suatu tumor, khususnya kanker dapat menunjukkan prognosis dan agresifitas tumor. Bahan aktif daun sirsak yaitu
Annonaceous acetogenins(ACGs) diteliti memiliki sifat sitotoksik (antitumor) akibat inhibisi kerja NADH-ubiqiunone oxidireductase (NADH-dehydrogenase atau complex I). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh eskstrak daun sirsak terhadap pertumbuhan tumor yang dinilai berdasarkan imunoekspresi Ki-67. Metode: Penelitian ini menggunakan tikus Wistar yang telah diinokulasikan kanker, dan dibagi dalam 5 kelompok, yaitu C1, T1, C2, T2 dan T3. Kelompok T1dan T2 diberikan ekstrak daun sirsak 2 mg/hr, dan kelompok T3 dengan dosis 4 mg/hr. Sedangkan kelompok C1 dan C2 merupakan kelompok kontrol, hanya diberikan diet standar. Tumor yang tumbuh diambil, dibuat sediaan HE dan dipulas dengan pulasan imunohistokimia Ki-67.
Hasil: Dengan uji Kruskal-Wallis didapati perbedaan bermakna antara kelima kelompok yaitu p=0,02 (P<0,05). Dilanjutkan dengan uji Mean-Whitney antara C1 dan T1 didapati perbedaan bermakna imunoekspresi dengan p=0,04 (P<0,05). Terdapat perbedaan bermakna imunoekspresi Ki-67 pada kelompok C2 dan T2 yaitu p=0,017 (P<0,05).
Kesimpulan: Daun sirsak dapat menghambat pertumbuhan tumor dosis 2 mg/hari dan 4 mg/hari.
ABSTRACT
Ki-67 Immunoexpressions of breast tumour Witar rat which were inoculated tumour activated
Benzo(Α)Pyrene
dan treated by extract of soursop .
(Result Result)
Mega Sari Sitorus, Joko S. Lukito, Syafruddin Ilyas
Department of Pathology Faculty of Medicine, Biology Departement of FMIPA, University of North Sumatra, Medan.
Background: Increased cell population as result of proliferation increasing or decreased of death or differentiation cell. Tumors, mainly cancers which has higher proliferation activity, show prognostic factor and tumor aggressiveness.
Annonaceous acetogenins(ACGs) which are the active agent of soursop leaves have a potential cytotoxic (antitumor) effect through inhibiting work on NADH-ubiqiunone oxidireductase (NADH-dehydrogenase or complex I). The purpose of this research to explore the impact of soursop leaves extract (anonna muricata) against tumor growth based on Ki-67 immunoexpression.
Methods: This study used Wistar rats inoculated cancer, were divided into five groups C1, T1, C2, T2 and T3.T1 and T2 group was given soursop extract with dose of 2mg/day and T3 with dose of 4 mg/day. Meanwhile C1 and C2 group only feed by standart diet. The mass from rat is incised and prepared to slide histopathologic. Immunohistochemical with Ki-67 were performed.
Result: There is significance expression within five groups with Kruskal-Wallis test p=0,02 (P<0,05). Mean–Whitnet test between C1 and T1 showed there is a significance difference expression with p=0,04 (p<0,05). There is also a significance difference Ki-67 expression in C2 and T2 group p=0,017 (P<0,05). Conclusion: Soursop leaves at 2 mg/day and 4 mg/day doses can be used to inhibit tumour growth.
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Jumlah sel yang ada pada suatu jaringan merupakan kumulatif antara masuknya sel baru dan keluarnya sel yang ada pada populasi. Masuknya sel ke dalam populasi jaringan sebagian besar ditentukan oleh kecepatan proliferasinya, sementara sel dapat meninggalkan populasinya karena kematian sel ataupun karena berdiferensiasi menjadi sel lain. Oleh karena itu, meningkatnya jumlah sel ke dalam populasi tertentu dapat terjadi karena peningkatan proliferasi ataupun karena penurunan kematian atau diferensiasi sel. Sel yang berproliferasi berkembang memalui serangkaian fase yang disebut siklus sel.1
Proliferasi sel yang berlebihan dapat menyebabkan pertumbuhan sel yang abnormal seperti pada tumor. Tumor atau yang sering disebut neoplasma adalah massa abnormal jaringan yang pertumbuhannya berlebihan dan tidak terkoordinasikan dengan pertumbuhan jaringan normal serta terus demikian walaupun rangsangan yang memicu perubahan tersebut telah berhenti.1
Perkembangan dan pertumbuhan tumor yang terus menerus berhubungan dengan proliferasi sel yang berubah. Proliferasi sel dapat dirangsang oleh faktor pertumbuhan intrinsik, jejas, kematian sel atau bahkan oleh deformasi mekanis jaringan.1
Faktor risiko terjadinya tumor payudara meliputi karakteristik masa reproduktif yang berhubungan dengan estrogen dan hormon lain, hormon farmaseutikal, penggunaan alkohol, tidak adanya aktifitas fisik yang berpengaruh terhadap level hormon. Menurut studi ditemukan bahwa produk komersial ynag mengandung hormon dan polusi masih merupakan prioritas terhadap insidens kanker payudara. Penelitian binatang menunjukkan hubungan antara kanker payudara dengan paparan organic solvent tertentu dan polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), seperti benzoalphapyrene.3 Banyak studi epidemiologi yang menunjukkan hubungan yang jelas antara paparan campuran PAHs yang mengandung benzoalphapyrene (hasil pembakaran tidak sempurna seperti asap kendaraan, emisi oven pemasak, emisi tar dan asap rokok) dengan peningkatan kanker paru dan kanker lainnya.4 Hal ini menyatakan bahwa tingginya tingkat polusi akan turut membantu peningkatan insidens kanker payudara.
terapi sistemik dapat dipergunakan sebagai prediktor respon terapi.5,6 Pengukuran angka proliferasi sel, dilakukan salah satunya dengan imunohistokimia dengan pewarnaan Ki-67. Ki-67 merupakan protein non-histon, yang diekspresikan pada setiap fase siklus sel, yang berperan sebagai penanda proliferasi sel.6
Wanita dengan kanker payudara akan menjalani pengobatan lokal bahkan bila terjadi kanker akan dilanjutkan dengan pengobatan sistemik. Terapi bedah dan radiasi adalah tindakan yang diberikan untuk mengurangi resiko kekambuhan kanker pada payudara, dinding dada dan kelenjar limfe regional. Kemoterapi sitotoksik dan terapi hormonal adalah terapi sistemik yang diberikan setelah terapi lokal untuk mengurangi kekambuhan sistemik dan mortalitas akibat kanker payudara.4 Regimen kemoterapi yang sering digunakan adalah doxorubicin, cyclophosphamide (selama 3 bulan) atau cyclophosphamide, methotrexate dan
fluorouracil (selama 6 bulan). Efikasi keduanya sama tetapi kedua regimen tersebut menyebabkan efek samping berupa muntah, alopesia, penekanan sumsum tulang dan kegagalan ovarium. Terapi hormonal berupa estrogen antagonist (Tamoxifen) lebih bersifat selektif tetapi juga memberikan efek samping yang tidak menyenangkan kepada pasien, yaitu kemerahan, vaginal discharge, bengkak, libido menurun, mual, gangguan menstruasi, perdarahan dari vagina, kehilangan berat badan, perubahan mood, dan pembekuan darah walaupun sangat jarang.7,8
mengunjungi rumah sakit. Efek samping serius yang lain adalah rendahnya jumlah sel darah putih dan keping-keping darah (platelet) serta gangguan elektrolit yang mengakibatkan dehidrasi.10
Efek samping yang tidak menyenangkan dan biaya pengobatan yang mahal mendorong para pasien mencari pengobatan alternatif lain dengan efek samping yang minimal dan murah melalui tanaman obat, salah satunya adalah daun sirsak. Telah banyak testimoni yang mengalami kesembuhan dari kanker setelah meminum air rebusan daun sirsak. Tahun 1997, Universitas Purdue, Amerika Serikat, mempublikasikan Annonaceous acetogenins yang efektif membunuh sel kanker.11 Annonaceous acetogenins (ACGs) adalah famili metabolit sekunder yang diisolasi dari tanaman famili annonaceae yang ditandai
dengan subunit γ-lactone terminal, dengan satu sampai tiga cincin tetrahydrofuran (THF) dan regio aliphatik panjang dengan fungsi yang lain. Senyawa tersebut merupakan sitotoksik yang poten sebagai antitumor, antiparasit, antibakteri dan antifungi.12,13,14 Annonaceous acetogenins bekerja sebagi penghambat NADH-ubiquinone oxidoreductase (respiratory complex I) di mitokondria. Senyawa
Annonaceous acetogenins menyebabkan ATP yang dibentuk mitokondria akan berkurang, energi berkurang dan akhirnya kematian sel, proliferasi sel terhambat dan terhenti.12 Senyawa Acetogenin pada daun sirsak merupakan pilihan lain untuk mengatasi kanker.
1.2. Perumusan Masalah
Bagaimana efek ekstrak metanol daun sirsak (Anonna muricata) terhadap aktifitas proliferasi kanker payudara tikus Wistar yang diinokulasi kanker terinduksi benzoalphapyrene.
1.3. Hipotesa
1. Ekstrak metanol daun sirsak (anonna muricata) dapat menghambat proliferasi sel kanker payudara tikus Wistar yang diinokulasi sel kanker terinduksi oleh benzoalphapyrene.
2. Aktifitas proliferasi kanker payudara tikus Wistar pada pemberian ekstrak metanol daun sirsak (anonna muricata) lebih kecil dibandingkan dengan sesudah inokulasi kanker.
1.4. Tujuan Penelitian
1.4.1. Tujuan Umum
1.4.2. Tujuan Khusus
1. Menghitung skoring aktifitas proliferasi kanker payudara tikus yang terjadi setelah inokulasi sel kanker terinduksi oleh benzoalphapyrene.
2. Menghitung skoring aktifitas proliferasi kanker payudara tikus yang diinokulasi sel kanker terinduksi oleh benzoalphapyrene setelah diberikan ekstrak metanol daun sirsak dengan dosis 2 mg/kgbb dan 4 mg/kbgg
3. Menghitung skoring aktifitas proliferasi kanker payudara tikus yang diinokulasi sel kanker terinduksi oleh benzoalphapyrene bersamaan dengan pemberian ekstrak metanol daun sirsak.
4. Mengevaluasi efek perbedaan skoring aktifitas proliferasi kanker payudara tikus bila diberikan ekstrak metanol daun sirsak bersamaan dan setelah inokulasi sel kanker terinduksi oleh benzoalphapyrene.
1.5. Manfaat Penelitian
1. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi potensi daun sirsak (anonna muricata) sebagai antikanker terutama kanker payudara.
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Proliferasi Sel
Proliferasi sel menghasilkan dua sel yang berasal dari satu sel. Keadaan ini membutuhkan pertumbuhan sel yang kemudian diikuti oleh pembelahan (divisi) sel. pertumbuhan sel yang tidak terkendali merupakan ciri khas kanker. Sel kanker secara umum berisi biomolekul yang diperlukan untuk bertahan, proliferasi, diferensiasi, kematian sel dan ekspresi tipe sel dengan fungsi khusus (cell-type-spesifics functions). Kegagalan regulasi fungsi inilah yang menghasilkan perubahan fenotip dan kanker.2,15
Pada jaringan normal, proliferasi sel mengarah kepada penambahan jaringan. Dimana jumlah sel tidak hanya tergantung kepada proliferasi sel tetapi juga oleh kematian sel. kematian sel terprogram (apoptosis) adalah proses dikeluarkannya sel-sel yang rusak. Keseimbangan antara produksi sel baru dan kematian sel itulah yang mempertahankan sel yang tepat pada jaringan (homeostasis).2
2.1.1. Siklus Sel
mitosis dibagi atas profase, metaphase, anaphase dan telofase. Tahap interfase terdiri dari G1, S dan G2. Replikasi DNA terjadi pada fase S. Fase S didahului oleh suatu gap disebut G1, masa ini sel bersiap-siap untuk sintesis DNA dan diikuti dengan gap yang disebut G2, yaitu sel siap untuk mitosis. Sel pada G1, sebelum berkomitmen repllikasi DNA, akan memasuki fase istirahat disebut G0. Sel pada G0 berada pada keadaan tidak tumbuh atau sel tidak berproliferasi.16
Gambar 2.1 Siklus sel
(Sumber: Pathologic Basis of Disease 7th ed, 2005. Kumar, Abbas, Fausto)
2.1.2. Pengaturan Siklus Sel
cyclin-dependent kinase (Cdk) family yang menyebabkan progresi siklus sel. Progresi siklus sel diatur oleh level family siklin tertentu. Siklin dibagi atas beberapa kelas yang berhubungan dengan fase siklus sel yang diaturnya. Anggota
cyclin D family adalah siklin fase G1 yang mengatur sel dari G0 memasuki G1. Siklin D di up-regulasi oleh faktor pertumbuhan dan signal eksternal melalui ras GTP-ase signaling pathway. Siklin D berikatan dengan Cdk4 dan Cdk6. Cyclin D-dependent kinases mendorong untuk memasuki fase S. Cyclin D-Cdk4 membuat hipofosforilasi protein Retinoblastoma (pRB) dan memfasilitasi ekspresi siklin E. Siklin E dan Siklin A mampu berikatan dengan Cdk2 dan mempromosikan progresi siklus sel melalui transisi G1/S. Siklin E-Cdk2 dan Siklin A-Cdk2 membuat hiperfosforilasi dan inaktifasi pRB. Inaktifasi pRB menyebabkan aktifasi faktor transkripsi E2F. Siklin E menstimulasi gabungan kompleks replikasi melalui interaksi dengan Cdc6. Siklin A mengaktifasi sintesis DNA melalui kompleks replikasi yang baru bergabung dan menghambat gabungan kompleks replikasi yang baru. Siklin E menginisiasi kembali kompleks replikasi yang diblok oleh siklin A. Siklin B1, B2 dan partner katalitiknya, Cdk1 (cdc2, p34 kinase) adalah komponen fase M/maturing factor (MPF) factors yang meregulasi proses yang mengarahkan gabungan mitotic spindle dan sister-chromatid pair.17
diperbaiki. Pada tahap tersebut kadar TP53 menurun, CDKN1A berkurang, sel dapat melanjutkan tahapan. Jika kerusakan DNA terlalu luas, TP53 akan memulai suatu kaskade peristiwa untuk meyakinkan sel agar melakukan bunuh diri (apoptosis).1
Gambar 2.2. Regulasi siklus sel1
2.1.3. Apoptosis
Apoptosis (berasal dari kata yang berarti “meninggalkan jauh dari”) menyebabkan
kematian sel terprogram. Kegagalan sel untuk mengalami apoptosis fisiologik dapat menyebabkan perkembangan aberan, proliferasi tumor yang tidak terkontrol, atau penyakit autoimun.1
Semua sinyal tersebut harus dapat menembus membran plasma ataupun transduksi untuk dapat menimbulkan respon. Sinyal intrinsik adalah respon yang diinisiasi oleh sel sebagai respon terhadap stress dan akhirnya dapat mengkibatkan kematian sel. Pengikatan reseptor nukleus oleh glukokortikoid, panas, radiasi, kekurangan nutrisi, infeksi virus dan hipoksia merupakan keadaan yang dapat menimbulkan pelepasan sinyal apoptosis intrinsic melalui kerusakan sel.1
Homeostasis antara proliferasi sel dan kematian sel yang terprogram (apoptosis) secara normal dipertahankan untuk menyediakan integritas jaringan dan organ.1
2.2. Kanker Payudara
Kanker payudara merupakan keadaan malignansi yang berasal dari sel-sel yang terdapat pada payudara. Payudara wanita terdiri dari lobulus, duktus, lemak dan jaringan konektif, pembuluh darah serta limfe. Pada umumnya karsinoma berasal dari sel-sel yang terdapat di duktus, beberapa diantaranya berasal dari lobulus dan jaringan lainnya.13
2.2.1. Epidemiologi Kanker Payudara
Semua perempuan memiliki risiko terkena kanker payudara, penyakit ini juga bisa terjadi pada laki-laki dengan perbandingan 1 : 100 antara laki-laki dan perempuan. American Cancer Society melaporkan pada tahun 2005 di Amerika perempuan yang didiagnosis menderita kanker payudara sebanyak 269.730.
Menurut Tjindarbumi yang dikutip oleh Wahyuni (2001), insiden kanker payudara bervariasi pada setiap negara. Di Amerika insidennya 71,7 per 100.000 penduduk, di Australia insidennya 55,6 per 100.000 penduduk. Sedangkan untuk Negara Asia misalnya di Indonesia insidennya 22,2 per 100.000 penduduk dan di Jepang 16 per 100.000 penduduk.18
2.2.2. Faktor Risiko Umur
Meningkatnya resiko kanker payudara sejalan dengan bertambahnya umur. Wanita yang paling sering terkena kanker payudara adalah di atas 40 tahun, meskipun demikian tidak berarti wanita dibawah usia tersebut tidak mungkin terkena kanker payudara, hanya kejadiannya lebih rendah dibandingkan dengan wanita diatas 40 tahun.18,19,20
Riwayat Perkawinan
Riwayat perkawinan dihubungkan dengan paritas, umur melahirkan anak pertama dan riwayat menyusui anak. Tidak kawin mempunyai risiko 2-4 kali lebih tinggi daripada wanita yang kawin dan tidak punya anak.18
tidak kawin risikonya 2,7 kali lenih tinggi daripada wanita yang kawin dan mempunyai anak.Wanita yang tidak menyusui anaknya mempunyai risiko kanker payudara dibandingkan wanita yang menyusui anaknya.19,20
Usia menarche dini
Bila haid pertama datang sebelum usia 12 tahun, maka wanita akan mengalami sirkulasi hormon estrogen sepanjang hidupnya lebih lama. Hormon estrogen dapat merangsang pertumbuhan duktus dalam kelenjar payudara. Keterpajanan lebih lama dari hormon estrogen dapat menimbulkan perubahan sel-sel duktus dari kelenjar payudara. Menarche kurang dari 12 tahun mempunyai risiko 1,7-3,4 kali lebih tinggi daripada wanita dengan menarche datang pada usia normal yaitu lebih dari 12 tahun.
Menopause Terlambat
Wanita yang mengalami masa menopausenya terlambat lebih dari 55 tahun, risikonya 2,5 hingga 5 kali lebih tinggi dari pada wanita yang masa menopausenya kurang dari 55 tahun.
Menderita Tumor Jinak Payudara
Wanita yang pernah operasi tumor jinak payudara risikonya 2,5 kali lebih tinggi daripada wanita yang tidak pernah memiliki tumor jinak payudara. Wanita dengan karsinoma satu payudara mempunyai peningkatan risiko menderita karsinoma pada payudara sisi yang lain.
Riwayat Keluarga
Gaya hidup (obesitas, konsumsi makanan tinggi lemak, alkohol dan
Lingkungan, paparan terhadap senyawa polisiklik aromatik hidrokarbon
(PAH) sebagai bahan polutan yang dibentuk selama pembakaran (batubara, minyak, kayu, gas, sampah, rokok, pabrik dinyatakan pada hewan percobaan dapat beresiko menjadi kanker payudara, begitupun pada manusia masih belum jelas dan menjadi bahan penelitian yang terus dilakukan.3,4,21
2.2.3. Etiologi dan Patogenesis
Berkembangnya kanker payudara umumnya berhubungan dengan faktor hormonal dan genetik (riwayat keluarga). Secara sporadik, kanker payudara berhubungan dengan paparan hormonal dan secara herediter berhubungan dengan mutasi germ-line.
Herediter
Ditemukan 13% kanker payudara terjadi secara herediter pada garis pertama keturunan, hanya sekitar 15% yang diakibatkan oleh multifaktorial dan mutasi germ-line. Sekitar 23% kanker payudara terjadi secara familial. Hal ini dikaitkan dengan BRCA1 dan BCRA2. Probabilitas terjadinya kanker payudara berhubungan dengan mutasi gen ini meningkat jika terjadi pada garis pertama keturunan, penderita terkena sebelum menopause dan atau dengan kanker multiple, atau pada pria dengan kanker payudara dan jika ada anggota keluarga menderita kanker ovarium.
sekian banyak gen yang dapat mencetuskan suatu transformasi maligna didukung oleh faktor lain.22
Gen BRCA1 dan BCRA2
Pada kanker payudara ditemukan dua gen yang bertanggung jawab pada 2/3 kasus familial atau 5% secara keseluruhan, yaitu gen BRCA1 yang berlokasi pada kromosom 17(17q21) dan gen BCRA2 yang berlokasi pada kromosom 13q-12-13. Adanya mutasi dan delesi BCRA1 yang bersifat herediter pada 85% menyebbkan terjadinya peningkatan resiko terkena kanker payudara, 10% secara nonherediter dan kanker ovarium. Mutasi dari BCRA1 menunjukkan perubahan ke arah karsinoma tipe medular, cenderung high grade, mitotik sangat aktif, pola pertumbuhan sinsitial dan status reseptor estrogen negatif dan mempunyai Prognosis yang buruk. Gen BCRA2 yang berlokasi pada kromosom 13q melibatkan 70% untuk terjadinya kanker payudara secara herediter dan bukan merupakan mutasi sekunder dari BCRA1. Seperti halnya BCRA1 dan BCRA2 juga dapat menyebabkan kanker ovarium dan pada pria dapat meningkatkan resiko terjadinya kanker payudara.22
Mutasi Germline
otak dan kelenjar adrenal pada anak-anak dan kanker payudara pada orang dewasa. Ditemukan sekitar 1% mutasi p53 pada penderita kanker payudara yang dideteksi pada usia sebelum 40 tahun.22
Mutasi Sporadik
Secara mayoritas keadaan mutasi sporadik berhubungan dengan paparan hormon, jenis kelamin, usia menarche dan menopause, usia reproduktif, riwayat menyusui dan estrogen eksogen. Keadaan kanker seperti ini dijumpai pada wanita postmenopause dan overekspresi estrogen reseptor. Estrogen sendiri mempunyai dua kemampuan untuk berkembangnya kanker payudara. Metabolit estrogen dapat menyebabkan mutasi dan menyebabkan perusakan DNA-radikal bebas. Melalui aktivitas hormonal, estrogen dapat menyebabkan proliferasi lesi premaligna menjadi suatu maligna. Sifat bergantung hormon ini berkaitan dengan estrogen, progesteron dan reseptor hormon steroid lain di inti sel payudara. Pada neoplasma yang memiliki resptor ini terapi hormon (antiestrogen) dapat memperlambat pertumbuhannya dan menyebabkan regresi tumor.22
2.2.4. Penatalaksanaan
2.3. Ki-67 Sebagai Petanda Proliferasi
Pertumbuhan tumor ganas sangat bervariasi dan ini mencerminkan keadaaan klinisnya, begitupun, proliferasi adalah gambaran kunci progresifitas tumor.24
Ki-67 dikenali pertama kali oleh Gerdeset et al tahun 1991 sebagai protein non histon. Ki-67 adalah antigen inti berhubungan dengan proliferasi yang diekspresikan pada semua tahap siklus sel, yang diekspresikan pada sel yang berproliferasi selama pertengahan fase G1, meningkat pada saat memasuki fase S dan G2, dan mencapai puncak pada fase M pada silus sel, dan dikatabolisme dengan cepat pada akhir fase M dan tidak terdeteksi pada fase G0 dan awal G1.24,25,26,27
Pengukuran proliferasi tumor menjadi sangat penting pada penelitian bidang kanker payudara. Hal ini tidak hanya disebabkan oleh karena peran indikator prognostik dari aktivitas proliferasi, tetapi juga pengukuran aktivitas proliferasi yang berperan dalam angka pertumbuhan tumor dan penilaian respon terhadap pengobatan. Marker proliferasi tumor dan angka pertumbuhan tumor dipercaya sebagai parameter prognostik baru dalam kanker payudara. Kanker payudara mengekspresikan ki67 level tinggi, suatu marker inti proliferasi sel yang berhubungan dengan outcome yang buruk.28
2.4. Tanaman Sirsak (Anonna muricata)
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta Class : Dicotyledoneae Ordo : Ranales
Family : Annonaceae Genus : Annona
Spesies : Annona muricata L. Nama daerah : Sirsak 29
2.4.1. Morfologi Tumbuhan Sirsak
Tanaman sirsak tumbuh tersebar di daerah tropis, dan ditemui juga di India barat, Amerika utara dan selatan, dataran rendah Afrika, pulau Pasifik dan Asia tenggara.31,32,33,34,35
Tabel 2.1. Nama-nama sirsak pada berbagai negara
Sumber: Badrie N, Schauss AG in. Soursop (Anonna muricata L.): composition, Nutritional vakue, medicinal uses and toxicology dalam Bioactive foods in promoting health: fruit and vegetables. Elsevier;2010:621-42.
2.4.2. Manfaat Tanaman Sirsak
berbagai kandungan senyawa dan zat itulah sirsak bisa dimanfaatkan untuk mengobati berbagai jenis penyakit oleh masyarakat.
Berbagai bagian tanaman sirsak (bunga, daun, buah, biji, kulit dan akar) dapat dimanfaatkan sebagai obat tradisional. Bagian sirsak yang bermanfaat untuk obat kanker misalnya batang, daun dan buahnya.18
2.4.2.1 Annonaneous acetogenins (ACGs)
ACGs merupakan zat sitotoksik poten dengan aktivitas antitumor,
insecticidal, antifungi, antiparasit dan antibakteri.9 Target kerja senyawa ini adalah transport elektron mitokondria dengan kerja spesifik pada NADH-ubiqiunone oxidireductase (NADH-dehydrogenase atau complex I). Efek inhibisi ACGs lebih poten dibandingkan dengan inhibitor respiratori klasik seperti
rotenone atau piericidin A.12
Gambar 2.4. Tempat kerja ACGs pada chemiosmosis di mitokondria (tanda panah merah).12
ACGs dilaporkan bertanggung jawab terhadap konversi NADH menjadi NAD+ dan membentuk adanya proton gradient pada bagian atas membrane dalam mitokondria. Hal ini memgakibatkan ketidakmampuan untuk menghasilkan ATP
melalui jalur oksidatif, yang akan mendorong sel memasuki apoptosis atau nekrosis (gambar 2.3.).12
2.4.2.2. Bukti Penelitian Manfaat Daun Sirsak
Didapati banyak penelitian daun sirsak yang telah dilakukan, beberapa diantaranya adalah :
Efek Antikanker dan Antitumor
1. Kojima, N. “Systematic synthesis of antitumor Annonaceous acetogenins”
Yakugaku Zasshi. 2004; 124(10): 673-81.
2. Tormo, J. R., et al. “In vitro antitumor structure-activity relationships of threo/trans/threo mono-tetrahydro-furanic acetogenins: Correlations with their
inhibition of mitochondrial complex I.” Oncol. Res. 2003; 14(3): 147-54. 3. Yuan, S. S., et al. “Annonacin, a mono-tetrahydrofuran acetogenin, arrests
cancer cells at the G1 phase and causes cytotoxicity in a Bax- and
caspase-3-related pathway.” Life Sci. 2003 May: 72(25): 2853-61.
4. Liaw, C. C., et al. “New cytotoxic monotetrahydrofuran Annonaceous acetogenins from Annona muricata.” J. Nat. Prod. 2002; 65(4): 470-75 Gonzalez-Coloma, A., et al. “Selective action of acetogenin mitochondrial
complex I inhibitors.” Z. Naturforsch. 2002; 57(11-12): 1028-34.
Aktifitas Antimikroba
1. Takahashi, J.A., et al. “Antibacterial activity of eight Brazilian Annonaceae
plants.” Nat. Prod. Res. 2006; 20(1): 21-6.
2. Betancur-Galvis, L., et al. “Antitumor and antiviral activity of Colombian
medicinal plant extracts.” Mem. Inst. Oswaldo Cruz 1999; 94(4): 531-35. Antoun, M. D., et al. "Evaluation of the flora of Puerto Rico for in vitro
cytotoxic and anti-HIV activities." Pharmaceutical Biol. 1999; 37(4): 277-280.8
Aktifitas Antidepresan dan Antistres
1. Padma, P., et al. “Effect of Annona muricata and Polyalthia cerasoides on brain neurotransmitters and enzyme monoamine oxidase following cold
immobilization stress.” J. Natural Remedies 2001; 1(2): 144–46.
2. Hasrat, J. A., et al. “Screening of medicinal plants from Suriname for 5-HT 1A
ligands: Bioactive isoquinoline alkaloids from the fruit of Annona muricata.”
Phytomedicine. 1997; 4(20: 133-140.8
Aktifitas Antiparasit, Antimalaria dan Antiinsektisida
1. Luna, J. S., et al. “Acetogenins in Annona muricata L. (Annonaceae) leaves
are potent molluscicides.” Nat. Prod. Res. 2006; 20(3): 253-7.
3. Alali, F. Q., et al. “Annonaceous acetogenins as natural pesticides; potent toxicity against insecticide-susceptible and resistant German cockroaches (Dictyoptera: Blattellidae).” J. Econ. Entomol. 1998; 91(3): 641-9.8
Aktifitas Antikejang, Antispasme dan Smooth Muscle Relaxant :
1. N’gouemo, P., et al. “Effects of ethanol extract of Annona muricata on
pentylenetetrazol-induced convulsive seizures in mice.” Phytother. Res. 1997; 11(3): 243–45.
2. Feng, P. C., et al. “Pharmacological screening of some West Indian medicinal plants.” J. Pharm. Pharmacol. 1962; 14: 556–61. 8
Aktifitas kardiodepresan dan Hipotensi
1. Carbajal, D., et al. “Pharmacological screening of plant decoctions commonly
used in Cuban folk medicine.” J. Ethnopharmacol. 1991; 33(1/2): 21–4. 2. Feng, P. C., et al. “Pharmacological screening of some West Indian medicinal
plants.” J. Pharm. Pharmacol. 1962; 14: 556–61.
2.5. Kerangka Teori
Gambar 2.5. Skema kerangka teori penelitian
Benzoalphapyrene Tikus Wistar
Reaksi detoksikasi, epoksidasi & hidroksilasi DNA, RNA &
protein sel tubuh
Anonna muricata
Aktifitas proliferasi sel ( IHC)
Gambaran histopatologik (pewarnaan HE) Progresi
Promosi Inisiasi Mutasi DNA
Keterangan :
Pengaruh karsinogen
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1. Desain Penelitian
Penelitian ini adalah studi eksperimental laboratorik dengan the post test only control group design yang menggunakan tikus strain Wistar sebagai hewan percobaan.
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara (USU) Medan, Laboratorium Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) USU Medan dan Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU dan Instalasi Patologi Anatomi RSH. Adam Malik, Medan. Penelitian ini dilakukan selama 6 (enam) bulan yaitu bulan Desember 2011 sampai dengan Mei 2012.
3.3. Rancangan Penelitian
Wistar sebanyak 25 ekor yang telah diinokulasi kanker terinduksi benzoalphapyrene, dengan nama C1, C2, T1,T2,T3 yaitu :
C1 = diberi diet standar, tanpa pemberian ekstrak daun sirsak (anonna muricata) dan diterminasi setelah 3 minggu.
C2 = diberi diet standar, tanpa pemberian ekstrak daun sirsak (anonna muricata) dan diterminasi setelah 7 minggu.
T1 = diberikan ekstrak metanol daun sirsak dosis 2 gr secara bersamaan dengan inokulasi kanker selama 3 minggu kemudian diterminasi.
T2 = setelah timbul massa tumor (3 minggu) diberikan ekstrak metanol daun sirsak dosis 2 gr selama 4 minggu kemudian diterminasi.
T3 = setelah timbul massa tumor (3 minggu) diberikan ekstrak metanol daun sirsak dosis 4 gr selama 4 minggu kemudian diterminasi.
3.4. Populasi dan Sampel Penelitian
3.4.1. Populasi
3.4.2. Sampel
Besar sampel penelitian ini didapat dari rumus Frederer (Frederer, 1963)
t : jumlah perlakuan (penelitian ini 5 perlakuan) n : jumlah ulangan perkelompok
Sehingga banyaknya sampel yang dibuutuhkan adalah :
= (5-1) (n-1) ≥ 15
= 5 ekor
3.4.3. Cara Pengambilan Sampel
Sampel penelitian diperoleh dari populasi secara simple random sampling, dengan kriteria inklusi dan eksklusi sebagai berikut :
1. Kriteria Inklusi : a. Tikus betina b. umur 8-12 minggu
c. berat badan 130-250 gram
d. sehat yang ditandai dengan gerakan aktif 2. Kriteria eksklusi
a. Tidak tumbuh tumor setelah dilakukan inokulasi b. Tikus tampak sakit (gerakan tidak aktif)
3.5. Variabel Penelitian
3.5.1. Variabel Bebas
Variabel bebas adalah ekstrak metanol daun sirsak (anonna muricata) dengan dosis 2 mg/kgbb dan 4 mg/kgbb.
3.5.2 Variabel Tergantung
Aktivitas proliferasi yaitu proses pembelahan sel, melalui tahapan yang disebut siklus sel. Pembelahan sel terdiri dari 4 tahapan yaitu G1, S, G2dan M, yang akan memberikan ekspresi positif dengan pewarnaan immuno-histokimia Ki67 pada semua tahapan kecuali tahapan G0, skala rasio.
3.6. Bahan dan Alat
3.6.1. Bahan untuk perlakuan
Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :
2. Bahan uji daun sirsak (anonna muricata) diperoleh dari toko tanaman buah dan diekstraksi di bagian Laboratorium Farmasi Fak. Farmasi USU. Daun sirsak segar didapat dari pohon sirsak yang sudah pernah berbuah, daun keempat atau kelima (kematangan yang sedang) dari pucuk ranting. Dosis ekstrak daun sirsak yang digunakan adalah dosis konversi dosis lazim ekstrak daun sirsak untuk manusia dewasa terhadap dosis tikus dengan berat 130-250 gr. Dosis lazim untuk manusia dewasa tersebut adalah 2 gr/hr dan 4 gr/hr. 3. Bahan karsinogen yaitu benzoalphapyrene dikeluarkan oleh Sigma sebanyak
0,3 mg/ grbb/hr dalam oleum olivarium.
3.6.2. Bahan transplantasi jaringan tumor pada tikus
Larutan PBS, alkohol 70%, larutan garam fisiologis, es batu, tikus donor bertumor dan tikus resipien.
3.6.3. Bahan untuk pemeriksaan histopatologi dan immunohistokimia
Formalin buffer 10%, alkohol 50%, 70%, 80%, 90%, absolut, xylol, parafin cair, bahan pengecatan hemtoksilin-eosin (HE), canada balsem dan entelan, Ki-67 Antigen.
3.6.4. Alat transplantasi jaringan tumor pada tikus
3.6.5. Alat-alat untuk pewarnaan HE dan imunohistokimia
3.7. Alur Kerja
Gambar 3.1. Alur Kerja Inokulasi sel tumor ke payudara tikus percobaan
C1 T1 C2 T2 T3
Immunohistokimia Ki67 Slide HE
Indeks proliferasi
Induksi benzoalphapyrene dosis o,3 mg/grbb/hr
3.8. Definisi Operasional
1. Inokulasi sel kanker adalah implantasi sel kanker yang diambil dari jaringan payudara tikus yang menderita kanker payudara yang sebelumnya diinduksi dengan benzoalphapyrene.
2. Pemberian ekstrak daun sirsak yang dimaksud adalah pemberian ekstrak daun sirsak yang telah dibuat sesuai prosedur standar laboratorium Fitokimia, Fakultas Farmasi USU dengan cara dicekok menggunakan gavage oral.
3. Aktivitas proliferasi adalah aktifitas pembelahan sel, melalui tahapan yang disebut siklus sel. Siklus sel terdiri dari 4 tahapan yaitu G1, S, G2 dan M. Aktivitas proliferasi dapat dinilai menggunakan Ki67 yaitu nonhistone nuclear protein, yang akan mengekspresikan seluruh tahapan siklus sel kecuali fase istirahat (G0). Aktivitas prolferasi sel dihitung dengan melihat jumlah sel yang mengekspresikan antibodi monoklonal Ki67 ditandai dengan inti sel yang berwarna coklat. Tiap slide dinilai 5 lapangan pandang dengan pembesaran 400X.
Hasil pulasan imunohistokimia Ki67 adalah tampilan pulasan warna coklat pada inti sel epitel yang dinyatakan :
- Negatif : bila tidak berhasil menampilkan warna coklat, dimana saat proses yang sama kontrol (+) menampilkan warna coklat dengan pewarnaan komogen DAB.
lapangan pandang dan pada saat yang sama kontrol (+) juga menampilkan warna yang sama.
Yang dinilai pada jaringan adalah :
Persentase jumlah sel yang positif terwarnai sesuai dengan kriteria Ki-67 labelling index, yaitu:
1 1-15% sel yang terwarnai Lemah 2 15-30% sel yang terwarnai Sedang 3 ≥30% sel yang terwarnai Kuat
3.9. Pemeliharaan Tikus Wistar
Dipelihara dalam kandang berukuran 30x20x20 cm, yang dilapisi sekam padi 1-2 cm serta ditutup dengan kawat ayam. Kandang dibersihkan dan sekam padi ditukar 2 hari sekali untuk mencegah infeksi yang dapat terjadi akibat kotoran tikus tersebut. Kandang ditempatkan dalam suhu kamar dan cahaya menggunakan sinar matahari tidak langsung. Makanan tikus Wistar diberikan berupa pellet. Makanan dan minuman diberikan secukupnya dalam wadah terpisah dan diganti setiap hari. Setiap minggu dilakukan pengukuran berat badan tikus.
3.10. Persiapan Hewan Percobaan
Sebelum perlakuan, terhadap setiap tikus ditimbang berat badannya dan diamati kesehatannya secara fisik (gerakannya, berat badan, makan dan minum). Jika ada tikus yang sakit pada saat adaptasi ini, maka diganti dengan tikus yang baru dengan kriteria yang sama dan diambil secara acak.
3.11. Prosedur Kerja
Dua puluh lima ekor tikus strain Wistar dibagi menjadi 5 kelompok, yaitu kelompok Kontrol 1 (C1), Kontrol 2 (C2), Perlakuan 1 (T1), Perlakuan 2 (T2), dan Perlakuan 3 (T3). Masing-masing kelompok terdiri dari 5 tikus Wistar, kemudian dikandangkan sesuai kelompok dan tiap tikus diberi penomoran dengan memberi tanda pada telinga tiap tikus. Masing-masing kelompok diberi perlakuan seperti pada alur kerja (gambar 2).
3.11.1. Induksi kanker payudara oleh benzoalphapyrene.
3.11.2. Prosedur transplantasi tumor
a. Tikus donor dimatikan dengan dekapitasi servikalis, kemudian diletakkan terlentang pada tatakan/alas fiksasi dan keempat kakinya difiksasi dengan jarum.
b. Kulit di bagian yang bertumor diusap dengan alkohol 70%, kemudian dibuat sayatan dengan gunting lurus, untuk mengeluarkan tumor.
c. Tumor diletakkan di cawan petri kecil yang telah terlebih dahulu dicuci dengan garam fisiologis dan diletakkan diatas es.
d. Amati bentuk dan keadaan tumor, kemudian ambil/potong jaringan tumor yang masih baik yaitu bagian yang tanpa nekrosis (biasanya di daerah tepi jika tumor besar) sebanyak kira-kira yang dapat menghasilkan bubur tumor paling sedikit 1 ml dan taruh di cawan petri kecil lainnya. Bersihkan dari jaringan ikat (simpai), jaringan nekrotik dan darah, kemudian cacah/potong-potong sampai halus dengan gunting hingga akhirnya terbentuk “bubur tumor” yang partikelnya dapat melewati jarum trokar. Tambahkan garam fisiologis lebih kurang sama banyaknya dengan volume tumor.
e. Bubur tumor disuntikkan ke payudara tikus dengan dosis 0,2 ml menggunakan spuit insulin dengan ketepatan 10-1.
f. Sisa tumor yang padat dimasukkan ke dalam botol formalin untuk dibuat sediaan mikroskopik.
3.11.3 Pengamatan morfologi benjolan, perubahan berat badan tikus.
Pengamatan dilakukan dengan menghitung volume benjolan yang terjadi di payudara tikus. Benjolan yang terbentuk diukur luas dan tingginya. Luas benjolan diukur dengan jangka sorong sedangkan tinggi benjolan ditentukan dengan bantuan penggaris/rol. Kemudian ditentukan volume benjolan dengan rumus kerucut.
Volume benjolan = 1/3 Luas benjolan x tinggi benjolan.
Sedangkan perubahan berat badan tikus ditentukan dengan menimbang berat badan sekali dalam seminggu.
3.11.4. Pembuatan ekstrak daun sirsak dan suspensi ekstrak daun sirsak.
Pembuatan ekstrak daun sirsak dengan pelarut etanol, sesuai dengan prosedur
3.11.5. Pencekokan suspensi ekstrak daun sirsak
Pencekoan dilakukan setiap hari, sebelum dicekok, setiap tikus ditimbang berat badannya. Pencekoan suspensi ekstrak daun sirsak dilakukan dengan menggunakan alat gavage oral yang bias dilewati oleh ekstrak yang kental. Pencekokan dilakukan satu kali sehari, pada jam yang sama tiap harinya.
3.11.6. Prosedur pembuatan slide HE
a. Fiksasi
Potongan kanker dimasukkan dalam larutan formalin buffer (larutan formalin 10% dalam buffer natrium asetat sampai mencapai pH 7,0). Waktu fiksasi jaringan 18-24 jam. Setelah fiksasi selesai, jaringan dimasukkan dalam larutan aquadest selama 1 jam untuk proses penghilangan larutan fiksasi.
b. Dehidrasi
Potongan kanker dimasukkan dalam alkohol konsentrasi bertingkat. Jaringan menjadi lebih jernih dan transparan. Jaringan kemudian dimasukkan dalam alkohol-xylol selama 1 jam dan kemudian larutan xylol murni selama 2x2 jam.
c. Impregnasi
d. Embedding
Jaringan ditanam dalam paraffin padat yang mempunyai titik lebur 56-58oC, ditunggu sampai paraffin dipotong setebal 4 mikron dengan mikrotom. Potongan jaringan ditempelkan pada kaca objek yang sebelumnya telah diolesi polilisin sebagai perekat. Jaringan pada kaca objek dipanakan dalam inkubator suhu 56-58oC sampai paraffin mencair.
e. Pewarnaan jaringan dengan H&E
Secara berurutan jaringan pada kaca objek dimasukkan dalam :
1 Xylol 1 menit 9 Air 1 menit
Prosedur pulasan immunohistokimia KI67 sesuai protokol Dako :
1. Siapkan preparat berupa potongan tipis jaringan 4 µm yang sudah ditempelkan pada kaca objek silanized.
2. Preparat dimasukkan dalam inkubator 1 malam, suhu 37 ⁰C.
3. Deparafinisasi dengan meletakkan slide di hot-plate selama 60 menit, kemudian mencelupkan slide ke dalam cairan xylol sebanyak 3 kali, masing-masing 5 menit.
4. Rehidrasi dengan cara mencelupkan secara berurutan dalam etanol 98% sebanyak 3 kali, masing-masing selama 5 menit, kemudian alkohol 90%, 80% dan 70% masing-masing selama 5 menit.
5. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit. 6. Berikan antigen retrieval
7. Bilas dengan air selama 2-3 menit.
8. Netralisasi peroksidase endogen menggunakan Peroxidase Block selama 5 menit.
9. Bilas dengan TBS selama 2 x 5 menit.
10. Inkubasi dengan protein block selama 5 menit. 11. Bilas dengan TBS selama 2 x 5 menit.
12. Inkubasi dengan antibodi primer yang telah didilusi secara optimal selama 60 menit.
13. Bilas dengan TBS selama 2 x 5 menit.
17. Bilas dengan TBS selama 2 x 5 menit dengan kocokan lembut. 18. Amati aktivitas peroksidase dengan DAB working solution. 19. Bilas slide dengan air mengalir.
20. Beri counterstain Hematoksilin
21. Bilas slide dengan air mengalir selama 5 menit 22. Dehidrasi dengan alcohol kemudian bersihkan
23. Tetesi dengan Entellan® dan tutup dengan kaca penutup.
3.12. Analisis Data
BAB 4
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1. HASIL PENELITIAN
4.1.1. Deskripsi Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Fisiologi Hewan Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan ilmu Pengetahuan Alam, Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi, Laboratorium Patologi Antomi Fakultas Kedokteran USU dan Laboratorium Patologi Anatomi RS H. Adam Malik Medan. Hewan coba penelitian ditempatkan dalam kandang yang diberikan sekam, dibagi sesuai kelompoknya, yang terdiri dari 3-5 tikus per kandangnya.
4.1.2. Karakteristik Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus Wistar betina, umur 8-12 minggu, berat badan 130-250 gram dengan kondisi sehat yang ditandai dengan gerakan aktif. Jumlah sampel penelitian adalah 24 ekor, masing-masing kelompok terdiri dari 5 tikus kecuali kelompok perlakuan 3 yaitu sebanyak 4 ekor tikus dikarenakan 1 ekor tikus mati saat penelitian.
4.1.3. Suspensi ekstrak daun sirsak.
hari, dengan menggunakan pelarut CMC 1% yang ditambahkan aquadest sampai volume yang telah ditentukan. Suspensi yang dihasilkan berupa larutan kehitaman kental.
4.1.4. Inokulasi Tumor
Tikus donor yang telah diinduksi benzoalphapyrene dilakukan terminasi setelah 30 hari. Kemudian diambil massa yang tumbuh di payudara tikus dan dijadikan bubur tumor. Sebagian dari bubur tumor tersebut diambil untuk dibuat sediaan sitologi dengan pewarnaan Giemsa. Di bawah mikroskop terlihat sel yang atipik, inti membesar, bentuk pleomorfik (gambar 4.1).
Gambar 4.1. Mikroskopik sel yang terlihat dari bubur tumor. (A)(B)Sel epitel bentuk pleomorfik dengan inti membesar (tanda panah). (Giemsa, 200x)
4.1.5. Rata-rata perubahan berat badan tikus selama penelitian
Tabel 4.1 Rata-rata perubahan berat badan tikus setiap minggu
Kelompok Lama
Dari tabel diatas terlihat bahwa tikus kontrol mengalami peningkatan berat badan yang hampir sama setiap minggunya sekitar 5,93 gram (11,50%). Sedangkan tikus perlakuan 1 hanya meningkat sedikit sekitar, 0,33 gram(0,43%) dan sedangkan pada perlakuan 2 terjadi penurunan berat badan (1,13%).
4.1.6. Makroskopis massa di payudara tikus
Setelah tikus diterminasi, massa dipayudara diambil dan diamati secara makroskopis, dan ditimbang beratnya.
Gambar 4.2. Makroskopis tumor. (A) Massa di payudara tikus (dalam lingkaran merah), (B) Massa tumor setelah diangkat, berwarna putih kekuningan.
Tabel 4.2. Berat massa di payudara tikus
Kelompok tikus Kode tikus Massa (gram) Mean (gr)
Kontrol 1 M1 1,37 0,09
4.1.7. Mikroskopis massa
Massa tumor yang diambil dibuat sediaan histopatologi dengan pewarnaan HE.
Gambar 4.3. Sediaan histopatologi massa. Tampak kelenjar payudara proliferatif, dilapisi epitel bentuk bulat-oval, kromatin padat basofilik. (A.HE,40x, B.HE,
100x)
Pada sediaan histopatologi (gambar 4.3 dan gambar 4.4.) terlihat struktur kelenjar yang sebagian besar solid tanpa lumen. Epitel kelenjar hiperplasia, bentuk bulat-oval, kromatin padat basofilik, sitoplasma sedikit. Stroma kelenjar adalah jaringan ikat fibrous dalam batas normal. Tanda-tanda keganasan tidak dijumpai.
Gambar 4.4. Histopatologis massa. Kelenjar payudara proliferatif, sebagian lumen
A B
4.1.8. Tampilan imunohistokimia Ki-67 pada massa payudara tikus
Tampilan immunohistokimia yang dinilai pada massa yang ditemukan, hanya tampak fokus-fokus atau tidak luas. Sehingga penilaiannya berdasarkan intensitas warna coklat yang tertampil.
Tabel 4.3. Tampilan imunohistokimia Ki-67 di massa kontrol 1
Tikus kontrol
Skor Ki-67
M1 1
M2 3
M3 1
H1 1
H2 1
Didapati 1 jaringan massa yang positif kuat dengan Ki67, sedangkan 4 massa lainnya lemah.
Gambar 4.5. Immunohistokimia Ki67 massa di kelenjar payudara. Positif di kelenjar payudara pada kelompok kontrol (berwarna coklat)(A, HE 200x), (B,
Pada gambar 4.5. dan 4.6. terlihat sel epitel kelenjar positif dengan immunohistokimia Ki67 ditandai dengan warna coklat kuat.
Gambar 4.6. Foto tampilan Ki67 massa di kelenjar payudara. Positif di kelenjar payudara pada kelompok kontrol (berwarna coklat)(A, HE 200x), (B, HE,400x)
Tabel 4.4. Tampilan immunohistokimia Ki-67 perlakuan 1
Tikus T1 Skor Ki-67
M1 0
M2 0
M3 0
H1 0
H2 0
Seluruh massa dari perlakuan 1 (pemberian ekstrak daun sirsak 2mg/kgbb bersamaan dengan inokulasi tumor) negatif (tidak berwarna coklat) dengan Ki67.
Tabel 4.5. Tampilan imunohistokimia Ki67 kontrol 2
Tikus kontrol 2 Skor Ki-67
M1 1
M2 0
M3 2
H1 1
H2 1
Berdasarkan tabel diatas terlihat bahwa satu jaringan massa negatif terhadap immunohistokimia Ki67. Sedangkan 3 jaringan member tampilan lemah dan satu sedang.
Tabel 4.6. Tampilan imunohistokimia Ki67 perlakuan 2
Tikus perlakuan 2 Skor Ki-67
Berdasarkan tabel diatas terlihat bahwa seluruh perlakuan 2 negatif terhadap immunohistokimia Ki67.
Tabel 4.7. Tampilan imunohistokimia Ki67 perlakuan 3
Tikus perlakuan 3 Skor K-i67
M1 0
Dari 4 tikus yang hidup sampai perlakuan 3 selesai hanya dijumpai 1 massa dan ekspresi negatif terhadap Ki67. Oleh karena hanya dijumpai satu massa saja pada kelompok ini, maka kelompok ini tidak diikutkan dalam uji statistik.
perbedaan bermakna antara empat kelompok yang ada. Sehingga menyatakan dauan sirsak dapat membedakan antifitas proliferasi pada tiap kelompok.
Setelah dilakukan uji statistik dengan Mann-Whitney test terhadap tampilan Ki-67 pada kelompok kontrol 1 dan perlakuan 1 didapati Asymp. Sig 0,04 (p<0,05). Hal ini menyatakan bahwa ada perbedaan yang bermakna antara kontrol dan kelompok yang diberikan perlakuan. Hal ini menunjukkan proliferasi kelompok perlakuan lebih rendah dari kelompok kontrol, dengan kata lain ekstrak daun sirsak berperan dalam menurunkan proliferasi sel tumor.
Kemudian dilakukan uji Mann-Whitney terhadap tampilan Ki-67antara kelompok kontrol 2 dan perlakuan 2 didapati Asymp. 0,017. Hal ini menyatakan bahwa terdapat perbedaan bermakna pada aktifitas proliferasi kelompok kontrol 2 dan perlakuan 2. Artinya daun sirsak dapat berguna untuk emnurunkan proliferasi jika diberikan pada seseorang menderita tumor.
4.2. Pembahasan
4.2.1. Perubahan berat badan tikus selama penelitian
(lampiran 4) didapati ada perbedaan rata-rata berat badan antara kelompok kontrol 2 dengan perlakuan 1 dan kelompok kontrol 2 dengan perlakuan 2.
Adanya perbedaan ini dapat disebabkan karena rasa penuh pada lambung setelah dicekoki ekstrak suspensi dengan konsistensi kental, juga dapat disebabkan oleh faktor stress akibat pencekokan tiap harinya. Keadaan stress pada tikus (hewan coba) juga dilaporkan oleh Jonathan P. Balombe, bahwa pemeliharaan rutin (dengan memegang), pungsi vena dan orogastric gavage
menyebabkan stress akut pada binatang, yang diperiksa melalui adanya peningkatan denyut jantung, tekanan darah dan konsentrasi glukokortikoid yang bertahan selama 30-60 setelah perlakuan selesai.39
4.2.2. Kejadian timbulnya massa di payudara tikus
Berdasarkan tabel 4.2 didapati bahwa seluruh payudara tikus (100%) kontrol 1 dan perlakuan 1 didapati massa yang terlihat setelah dilakukan pembukaan kulit tikus. Waktu yang diperlukan untuk timbulnya massa tersebut 3 minggu setelah inokulasi. Keadaan ini 1 minggu lebih lama dari pada teori sebelumnya yang menyebutkan setelah 2 minggu inokulasi tumor sudah tumbuh. Massa yang timbul dijumpai setelah beberapa lama dapat dikarenakan faktor immune surveillance. Menurut Jeremy B Scwann dan Mark, sistem imun memiliki tiga peran dalam menghambat tumor. Pertama, sistem imun dapat melindungi host dari
spesifik mengenali dan mengeliminasi sel tumor. Immune surveillance inilah mungkin menjadi alasan tumbuh atau tidaknya tumor.41
Demikian juga dari tabel tersebut didapati bahwa seluruh payudara tikus (100%) kontrol 2 dan perlakuan 2 didapati massa yang terlihat setelah dilakukan pembukaan kulit tikus. Dari tabel tersebut juga terlihat bahwa hanya 1 tikus yang dijumpai massa dari 4 tikus yang bertahan hidup. Hal ini disebabkan pemakaian dosis yang tinggi 2x lipat dari dosis perlakuan 1.
4.1.3. Tampilan imunohistokimia Ki-67 di massa
Pada tabel 4.4 dilihat bahwa perlakuan 1 tidak menampilkan ekspresi terhadap Ki67. Hal ini menunjukkan bahwa tidak ada proliferasi pada semua massa (jinak).
Keadaan ini dapat disebabkan oleh aktiftas ekstrak daun sirsak, yang beberapa diantaranya sebagai immunomodulator dan antitumor.9 Sebagai imunomodulator, daun sirsak dapat meningkatkan sistem imun yang berperan dalam immune surveillance tumor, sehingga tumor tidak berkembang. Demikian halnya dengan sifat antitumor daun sirsak adalah pada aktifitas inhibitor NADH-ubiqiunone oxidireductase (NADH-dehydrogenase atau complex I).12 Aktifitas ini menyebabkan tumor tidak dapat berkembang.
Pada tabel 4.4. dilihat bahwa kontrol 2 menampilkan ekspresi terhadap Ki-67, dengan skor yang beragam. Kemudian dilakukan uji Mann-Whitney dengan p 0,05, didapati bahwa Asymp.Sig 0,017. Hal ini menyatakan bahwa ada perbedaan bermakna tampilan Ki67 di kelenjar pada kelompok perlakuan 2 dengan kelompok kontrol 2. Keadaan ini membuktikan bahwa sirsak dapat menurunkan aktifitas proliferasi sel setelah tumbuh tumor.
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
1. Dari hasil penelitian ini, didapati bahwa tampilan Ki67 pada kontrol 1 positif 100% dibandingkan dengan perlakuan 1yang seluruhnya negatif.
2. Uji statistik dengan Mann-Whitney test pada kelompok kontrol 1 dan perlakuan 1 didapati Asymp. Sig 0,04 (p<0,05).
3. Uji statistik dengan Mann-Whitney test pada kelompok kontrol 2 dan perlakuan 2 didapati Asymp. Sig 0,017 (p<0,05).
4. Berdasarkan hasil uji diatas didapati perbedaan bermakna aktifitas proliferasi pada kelompok kontrol dan perlakuan baik yang sifatnya preventif ataupun kuratif.
5. Ekstrak daun sirsak memiliki kemampuan untuk menurunkan aktifitas proliferasi sel.
5.2. Saran
1. Perlu dicari bentuk ekstrak daun sirsak yang lebih nyaman untuk diberikan pada tikus sehingga mengurangi rasa penuh ( kenyang) pada tikus.
