i SUMMARY
GENETIC LINKAGE MAPS AND QTL ANALYSIS OF THE RUBBER PLANT (Hevea brasiliensis Muell Arg.) ON THE POPULATION OF RRIM
600 WITH PN 1546 CROSSES AS A BASIC FOR THE STRATEGY IN INCREASING LATEX PRODUCTION
SEKAR WOELAN. Genetic Linkage Maps and QTL Analysis of The Rubber (Hevea brasiliensis Muell. Arg) on The Population of RRIM 600 with PN 1546 Crosses As Basic for The Strategy in Increasing Latex Production (Supervised by: T. CHAIRUN NISA B., EDY IRWANSYAH, TETTY CHAIDAMSARI).
One of the efforts that has been made to increase the genetic diversity of the rubber plant in Indonesia is by utilizing germplasm. Opportunities to obtain new superior genotypes will be greater if the genetic material between Wickham 1876 with germpalsm 1981 could be combined.
The duration of the breeding cycle of the rubber plant which reaches 25-30 years, forms an obstacle to be continually faced. Promotion plot trial is one technology to shorten the breeding cycle of the rubber plant, beside also looking for some yield components which related to the production of latex. The development of molecular techniques, can be used as an alternative strategy for solving this problem. The incorporation of the molecular marker technology into the selection is called Marker Assisted Selection (MAS). MAS is effective and able to shorten the cycle of selection in plants and is reamed for the availability of genetic linkage maps and information about the location and effect of Quantitative Trait Loci (QTL). Selection using markers can be conducted if quantitative trait locies which is linked with a molecular marker or a simple character has been localised.
This study aimed to: 1) obtain data on characteristics of latex yield components and to ascertain of the components affect the latex yield on the first derivative of RRIM 600 with PN 1546 crossed population, 2) obtain the magnitude of the values of heritability (h2) and the expected value of genetic progress (HKG) for some characters of yield components, 3) get a genetic linkage map of RRIM 600 with PN 1546 populations, and 4) obtain DNA loci associated with latex yield characters that has the largest potential for genetic effect and will be used as a marker in the selection of high latex yielding rubber progeny. The results quite high diversity, for variables of latex as well as timber production. Girth, barkthickness, number of latex vessels, production index and latex flow rate characterized showed highly significant correlations with latex production. The relationship between the 12 components of production is indicated with a determination coefficient value R2 of 0,927 and the remaining 0,270% of information is unknown.
The components of latex production that have high direct effect to latex production were number of latex vessels (0.722), rubber particels (0.591), girth (0.588), and a barktchikness (0.556). Based on path analysis and stepwise regression, was known that number of latex vessel and number of rubber particels
ii
had greater direct effect and without of the effect of multicoloniarities. The determination coefficient value of that both characters were R2 of 0,619.
Based on the results of genetic analysis to the coefficient of genetic diversity (KKG) and heritability (h2) of the progeneis tested to show that for the latex production, plant height, girth, barkthickness , number of latex vessels, and timber production were more determined of genetic factors and quite easy inheritaged to the new generation.
Relationship between the two parental and progenies crosses could be seen from the pattern of the phylogenetic tree construction, most progenies tended to approad the RRIM 600 clone as the female parent. Progeny of No. 12/G-663 has the closest relationship with female parent (RRIM 600) at 0.9020, while the No. 13/G-666 has the closest with the male parent (PN 1546) amounted to 0.9013, while among the progenies, the closest relationship were between progenies at No 13 / G-666 and No. 14 / G-689 (0.9525), No. 13/G-666 and No. 15/G-776 (0.9505) and between the No. No14/G-689 and 15/G-776 (0 , 9529).
Verification of PCR analysis with microsatellite primer combinations d ( mTcCIR 229 forward + mTcCIR 15 reverse), progenies of No. 5/G-277, 13/G-666, 16/G-451, 20/G-441, 24/G-442 , 25/G-521, 27/G-514, 28/G-577, and 29/G-637 showed tendencies leading to the female parent with in the size of 450 bp, 850 bp. Genotypes of No. 14/G-689, 15/G-776, 17/G-669 and 19/G-567 trended to lead male parent identified by the primer combination c (mTcCIR 37 forward + mTcCIR 15 reverse) with sizes of 400 bp, 850 bp, 2000 bp and primer combinations m (mTcCIR 15 forward + mTcCIR 229 reverse) with the size of 700 bp, 2000 bp. While the progenies No. 2/G-360, 11/G-515, 12/G-663, 18/G-518, 23/G-794, 30/G-691, 31/G-571, 33/G-876 , 36/G-906, 37/G-1078, 39/G-874, 40/G-875 contain properties of both parents, which is detected by a combination of i (mTcCIR 15 forward + mTcCIR m 37 reverse) at a 1000 bp marker (PN 1546) and 650 bp, 850 bp, 1650 bp and 2000 bp (RRIM 600).
The results of the analysis of Blast-X peptide sequence of PN 1546 male parent showed a high similarity with several other species, including Solanum demissum, Oryza sativa, Anthirrhinum hispanicum, Vitis vinefera, Medicago truncatula, Arabidopsis thaliana. As for the RRIM 600 peptide sequences have similirities with species such as Populus trichocarpa and Oryza sativa. The sequence of peptide amino acid (Rubber Biosinthesis Stimulator Protein/RBSP) is predicted to have similarity with eucariotic Initiation Factor 5A (eLF-5A) of 13 kDa molecular weight and an protein inhibitor wihch has amino acid sequence similer to patatin of 43,7 kDa molecular weight.
The number of linkage map group for PN 1546 clone formed were two groups constructed at minimum LOD value of 2.0. The linkage map formed were constructed at a minimum LOD value of 2.0 with recombination fraction 0.25. And two linkage map groups were consisted of two linkaged markers. The first linkage map group on the primer OPH11_90 and OPH 16_90 with a genetic distance of 25.2 cM. The second linkage map group on the primer OPJ7_850 and OPL11_12 with genetic distance of 25.5 cM. While, the linkage map group of RRIM 600 clone formed were three group contructed at minimum LOD value of 3.0 with a recombination fraction of 0.25. The first linkage map group (KP-1) includes the locus OPC2_500, OPD15_2000, and OPN15_1650, the second of linkage map group (KP-2) includes OPD3_4000 and OPD11_2000 locus and the
iii
linkage maps group-3 (KP-3) includes the locus OPD5_1650 and OPN5_850. Also, linkage map formed of RRIM 600 clone is constructed with a minimum LOD 2.0 at recombination fraction 0.25 had been produced 5 linkage groups. Map of linkage group 1 (KP-1) includes the locus OPB19_4000 and OPB19_5000; map of linkage group 2 (KP-2) includes the locus OPB20_750, OPC2_500, OPC13_2000, OPD3_4000, OPD5_1650, OPD11_2000, OPD15_2000, OPH03_900, OPH06_850, OPH13_5000, OPH15_500, OPH19_650, OPM05_500 , OPN05_850, OPN09_3000, OPN15_850 and OPN15_1650; map linkage map three (KP-3) includes the locus OPB20_1650 and OPD11_500; linkage map group-4 (KP-4) includes the locus OPB20_2500 and OPJ09_800, and linkage map group-5 (KP-5) includes the locus OPD8_3000 and OPM5_1000.
Based on the analysis of single markers by t test could be identified map position and characteristics of QTL from the variable of production component, which have greater direct effect. Girth have three QTL, namely lb2-1; lb2-2 were position at OPC13_2000 markers (63.6 cM), OPH19_650 (51.1 cM) markers and lb3-1 position was at OPB20_1650 markers (25.5 cM ); existence of this QTL detected on minimum LOD 2.0 and were in KP-2 and KP-3. Barkthickness have two QTL, namely tk2-1 position was at OPC13_2000 markers (63.6 cM) and tk3-1 position was at OPB20_tk3-1650 markers (25.5 cM), the existence of this QTL detected at LOD 2.0 and the minimum is at KP-2 and KP-3. Number of latex vessels have two QTL, namely jpl2-1, jpl2-2 position was at OPC13_2000 locus (63.6 cM) and OPH06_850 (63.6 cM), the existence of this QTL detected at minimum LOD 2.0 was at KP-2.
Whereas the existence of QTL from number of rubber particles and latex production which linkaged with the locus OPH03_2000; QTL of girth and latex production which linkaged with the locus OPH12_500, OPJ15_4000; QTL of barkthickness and latex production with the locus OPH12_500, OPJ15_4000, OPJ16_1400, OPJ19_650 could′t mapped with a minimum LOD 2.0. Because of the 40 locus selected, only 25 markers were linkaged, which 5 KP formed and covering of 1495.8 cM.
The establishment of an ideal linkage map could be conducted by multiplying RAPD screened primers, increasing the population size and the possibility of combining the data of RAPD markers with other types of DNA markers. It is necessary to do verification of markers which are related with the production components for other populations with larger population size.
iv
RINGKASAN
PETA PAUTAN GENETIK DAN ANALISIS QTL TANAMAN KARET (Hevea brasiliensis Muell. Arg) PADA POPULASI HASIL PERSILANGAN
RRIM 600 DENGAN PN 1546 SEBAGAI DASAR STRATEGI PENINGKATAN PRODUKSI LATEKS
SEKAR WOELAN. Peta Pautan Genetik dan Analisis QTL tanaman
karet (Hevea brasiliensis Muell. Arg) Pada Populasi Hasil Persilangan RRIM 600 Dengan PN 1546 Sebagai Dasar Strategi Peningkatan Produksi Lateks (Bimbingan: T. CHAIRUN NISA B., EDY IRWANSYAH, TETTY CHAIDAMSARI).
Salah satu upaya yang telah dilakukan untuk memperbesar keragaman
genetik tanaman karet di Indonesia yaitu dengan memanfaatkan plasma nutfah. Peluang untuk mendapatkan projeni unggul baru akan lebih besar apabila dilakukan penggabungan genetik antara Wickham 1876 dengan Plasma Nutfah 1981.
Lamanya siklus pemuliaan tanaman karet yang mencapai 25 – 30 tahun merupakan suatu kendala yang secara terus-menerus dihadapi. Pengujian plot promosi merupakan salah satu teknologi untuk dapat memperpendek siklus pemuliaan tanaman karet. Disamping juga mencari beberapa komponen produksi yang berkaitan dengan produksi lateks. Berkembangnya teknik molekuler, dapat dimanfaatkan sebagai salah satu strategi alternatif untuk memecahkan masalah tersebut. Penggabungan antara teknologi marka molekuler ke dalam seleksi disebut sebagai Marker Assisted Selection (MAS). MAS efektif dan mampu memperpendek siklus seleksi pada tanaman dan sebagai salah satu syarat tersedianya peta pautan genetik dan informasi tentang lokasi dan pengaruh Quantitatif Trait Loci (QTL). Seleksi menggunakan bantuan marka dapat dilakukan bila telah dapat dilokalisir lokus suatu sifat kuantitatif yang terpaut dengan marka molekuler atau dengan sifat sederhana.
Penelitian ini bertujuan untuk: 1) mendapatkan komponen hasil yang mempengaruhi hasil lateks untuk digunakan dalam seleksi pada populasi tanaman turunan pertama dari hasil persilangan RRIM 600 dengan PN 1546. untuk digunakan dalam seleksi, 2) mendapatkan marka DNA spesifik untuk identifikasi karakter komponen hasil lateks tanaman karet, 3) mendapatkan peta pautan genetik tanaman karet dari populasi RRIM 600 dengan PN 1546, dan 4) mendapatkan lokus DNA yang berasosiasi dengan karakter hasil lateks yang mempunyai potensi efek genetik terbesar dan yang akan digunakan sebagai penanda dalam seleksi projeni karet penghasil lateks tinggi.
Hasil penelitian menunjukkan terjadi adanya keragaman yang cukup tinggi untuk peubah produksi lateks maupun produksi kayu. Karakter lilit batang, tebal kulit, jumlah pembuluh lateks, indeks produksi dan kecepatan aliran lateks menunjukkan korelasi yang sangat nyata terhadap produksi lateks. Adanya hubungan diantara 12 komponen produksi ditunjukkan dengan besaran nilai
v
koefisien determinasi yaitu R2 = 0,927 dan sisanya 0,270 informasinya belum diketahui.
Komponen produksi yang mempunyai pengaruh langsung cukup tinggi terhadap produksi yaitu pembuluh lateks (0,722) , partikel karet (0,591), lilit batang (0,588), dan tebal kulit (0,556). Dan berdasarkan analisis lintas dan regresi bertatar jumlah pembuluh lateks dan jumlah partikel karet mempunyai pengaruh yang paling besar terhadap produksi lateks dan bebas dari efek multikoloniaritas. Koefisien determinasi ke dua peubah tersebut yaitu R2 = 0,619.
Berdasarkan hasil analisis genetik bahwa, koefisien keragaman genetik (KKG) dan heritabilitas (h2) dari projeni yang diuji menunjukkan bahwa, karakter produksi lateks, tinggi tanaman, lilit batang, tebal kulit, jumlah pembuluh lateks, dan produksi kayu merupakan karakter yang lebih banyak ditentukan oleh faktor genetik dan mudah diwariskan pada generasi berikutnya.
Hubungan kekerabatan diantara projeni persilangan dan kedua tetuanya dapat dilihat dari pola konstruksi pohon filogenetik, sebagian besar projeni kecenderungannya mengarah ke klon RRIM 600 sebagai induk betina. Projeni No 12/G-663 mempunyai hubungan kekerabatan yang paling dekat induk betina (RRIM 600) sebesar 0,9020, sedangkan projeni No 13/G-666 dengan induk jantan (PN 1546) sebesar 0,9013, dan diantara projeni pada No 13/G-666 dengan No 14/ G-689 (0,9525), No 13/G-666 dengan No 15/G-776 (0,9505) serta No14/G-689 dengan No 15/G-776 (0,9529).
Verifikasi hasil analisis PCR dengan primer kombinasi mikrosatelit d (mTcCIR 229 forward + mTcCIR 15 reverse) menunjukkan bahwa, projeni No 5/G-277, 13/G-666, 16/G-451, 20/G-441, 24/G-442, 25/G-521, 27/G-514, 28/G-577, dan 29/G-637 kecenderungannya mengarah ke induk betina pada ukuran 450 bp, 850 bp. Projeni No 14/G-689, 15/G-776, 17/G-669 dan 19/G-567 kecenderungannya mengarah induk jantan yang teridentifikasi dengan primer kombinasi c (mTcCIR 37 forward + mTcCIR 15 reverse) pada ukuran 400 bp, 850 bp, 2000 bp dan primer kombinasi m (mTcCIR 15 forward + mTcCIR 229 reverse) pada ukuran 700 bp, 2000 bp. Sedangkan projeni No 2/G-360, 11/G-515, 12/G-663, 18/G-518, 23/G-794, 30/G-691, 31/G-571, 33/G-876, 36/G-906, 37/G-1078, 39/G-874, 40/G-875 mengandung sifat dari kedua induknya, yang terdeteksi dengan kombinasi i (mTcCIR 15 forward + mTcCIR 37 reverse) pada marka 1000 bp (PN 1546) dan 650 bp, 850 bp, 1650 bp, dan 2000 bp (RRIM 600).
Hasil analisis Blast-X sekuen peptida tetua jantan PN 1546 mempunyai kesamaan yang cukup tinggi dengan beberapa jenis tanaman lain, diantaranya Solanum demissum, Oryza sativa, Anthirrhinum hispanicum, Vitis vinefera, Medicago truncatula, Arabidopsis thaliana. Sedangkan untuk RRIM 600 sekuen peptidanya mempunyai kesamaan dengan spesies diantaranya Populus trichocarpa dan Oryza sativa. Diduga sekuen asam amino protein (protein stimulator biosintesis karet) mempunyai kemiripan dengan eukariotik Initiation Factor 5A (eLF-5A) dengan berat molekul 13 kDa dan protein inhibitor yang sekuen asam aminonya menyerupai patatin dengan berat molekul 43,7 kDa.
Sebanyak dua kelompok peta pautan yang terbentuk pada klon PN 1546 yang dikonstruksi pada nilai LOD minimum 2.0 dengan fraksi rekombinasi 0,25. Kelompok pautan tersebut terdiri atas 2 marka yang terpaut. Kelompok peta pautan pertama pada primer OPH 11_90 dan OPH 16_90 dengan jarak 25.2 cM. Kelompok peta pautan kedua pada primer OPJ7_850 dan OPL11_12 dengan jarak
vi
25,5 cM. Sedangkan peta pautan yang terbentuk pada klon RRIM 600 yang dikonstruksi dengan LOD minimum 3,0 dengan fraksi rekombinasi 0,25 yaitu 3 kelompok pautan. Kelompok peta pautan 1 (KP-1) meliputi lokus OPC2_500, OPD15_2000, dan OPN15_1650, peta pautan 2 (KP-2) meliputi lokus OPD3_4000 dan OPD11_2000 dan peta pautan 3 (KP-3) meliputi lokus OPD5_1650 dan OPN5_850. Peta pautan yang terbentuk pada klon RRIM 600 yang dikonstruksi dengan LOD minimum 2,0 dengan fraksi rekombinasi 0,25 yaitu 5 kelompok pautan. Kelompok peta pautan 1 (KP-1) meliputi lokus OPB19_4000 dan OPB19_5000; peta pautan 2 (KP-2) meliputi lokus
OPB20_750, OPC2_500, OPC13_2000, OPD3_4000, OPD5_1650,
OPD11_2000, OPD15_2000, OPH03_900, OPH06_850, OPH13_5000,
OPH15_500, OPH19_650, OPM05_500, OPN05_850, OPN09_3000,
OPN15_850 dan OPN15_1650; peta pautan 3 (KP-3) meliputi lokus OPB20_1650 dan OPD11_500; peta pautan 4 (KP-4) meliputi lokus OPB20_2500 dan
OPJ09_800; dan peta pautan 5 (KP-5) meliputi OPD8_3000 dan OPM5_1000.
Berdasarkan analisis marka tunggal dengan uji t diketahui bahwa dapat diidentifikasi posisi peta dan karakteristik QTL dari peubah komponen produksi yang mempunyai pengaruh langsung yang tinggi. Lilit batang memiliki tiga QTL, yaitu lb2-1;lb2-2 posisinya berturut-turut berada pada marka OPC13_2000 (63,6 cM), OPH19_650 (51,1 cM) dan lb3-1 posisinya berada pada marka OPB20_1650 (25,5 cM); eksistensi QTL ini dideteksi pada LOD minimum 2,0 dan berada pada KP-2 dan KP-3. Tebal kulit memiliki dua QTL, yaitu tk2-1 posisinya berada pada marka OPC13_2000 (63,6 cM) dan tk3-1 posisinya berada pada marka OPB20_1650 (25,5 cM); eksistensi QTL ini dideteksi pada LOD minimum 2,0 dan berada pada KP-2 dan KP-3. Jumlah pembuluh lateks memiliki dua QTL, yaitu jpl2-1, jpl2-2 posisinya berada pada lokus OPC13_2000 (63,6 cM) dan OPH06_850 (63,6 cM); eksistensi QTL ini dideteksi pada LOD minimum 2,0 dan berada pada KP-2 .
Sedangkan eksistensi QTL jumlah partikel karet dan produksi lateks yang terpaut dengan lokus OPH03_2000; QTL lilit batang dan produksi lateks yang terpaut dengan lokus OPH12_500, OPJ15_4000; QTL tebal kulit dan produksi yang terpaut dengan lokus OPH12_500, OPJ15_4000, OPJ16_1400, OPJ19_650, belum dapat dipetakan sampai dengan LOD minimum 2,0. Karena dari 40 lokus yang terpilih, hanya 25 marka yang terpaut, membentuk 5 KP dan mencakup 1495,8 cM.
Pembentukan peta pautan yang ideal dapat dilakukan dengan memperbanyak primer RAPD yang diskrining, meningkatkan ukuran populasi dan kemungkinan menggabungkan data marka RAPD dengan marka DNA jenis lain. Perlu dilakukan adanya verifikasi dari marka-marka yang terpaut dengan komponen produksi pada populasi lain dengan ukuran populasi yang lebih besar lagi.
