Pewarisan Gen Penanda hpt (hygromycine phosphotransferase )
Berdasarkan Analisis PCR dan Ekspresinya pada Populasi Padi
Transforman Mengandung Gen HD Zip Oshox-6
Segregation of hpt gene by PCR analysis and its expression in transgenic rice population containing HD-Zip oshox6 gene
EnungE.S.Mulyaningsih1,3, H.Aswidinnoor2, D.Sopandie2, I.H. Slamet- Loedin3, P.B.F.Ouwerkerk4
1,3
Mahasiswa Pasca Sarjana Departemen Agronomi dan Hortikultura Institut Pertanian Bogor dan Staf Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, 2Departemen Agronomi dan
Hortikultura Institut Pertanian Bogor, 3Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, 4
Institute of Biology IBL Leiden University Netherlands
ABSTRAK
Gen sisipan yang ditransfornasi pada generasi pertama terintegrasi di salah satu pasangan kromosom sehingga tetua bersifat hemizygous, dan akan bersegregasi pada turunanya. Apabila gen sisipan bersifat dominan dan terintegrasi pada satu lokus dalam inti sel maka segregasi akan mengikuti hukum Mendel dengan rasio 3:1. Segregasi gen sisipan dapat dilakukan dengan cara menganalisis keberadaan gen dalam genom dan menganalisis ekspresinya. Analisis segregasi gen sisipan dihitung dengan persamaan khi kuadrat. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pola pewarisan gen sisipan hpt sekaligus untuk menduga pola pewarisan gen OsLEA :: oshox6 dalam genom padi transgenik generasi kedua (T1) dari cv. Batutegi dan Kasalath. Analisis segregasi hpt dilakukan menggunakan metode PCR. Analisis ekspresi gen dilakukan dengan menguji ketahanan daun tanaman terhadap antibiotik higromisin. Analisis dilakukan terhadap 17 galur tanaman transgenik T1 dari kultivar Batutegi dan Kasalath. Gen hpt diwariskan secara Mendellian dengan pola 3:1. Segregasi gen
hpt menjadi indikasi pewarisan gen oshox6. Ekspresi gen higromisin pada daun
menujukkan bahwa dari 17 galur yang diuji, hanya galur T1-BT III 2C yang tidak mengikuti pola pewarisan Mendel. Adanya daun tanaman transgenik nekrotik ketika diuji higromisin sangat ditentukan oleh tingkat ekspresi gen hpt pada tiap individu tanaman. Ekspresi yang terjadi mungkin sangat rendah atau sama sekali tidak terekpresi.
Kata kunci : Mendellian, hpt, OsLEA-oshox6, higromisin tes daun
ABSRACT
The transgene that was transformed at the fisrt generation was integrated into one of the chromosome pair which make the parental plant hemizygous. This transgene would be segregated on its progeny. In the case that the target gene was dominant and integrated at one locus within the nucleus, then segregation would follow the Mendelian inheritance with 3:1 ratio. Segregation of the
transgene might be analyzed by the presence of the gene within the genome and its expression. Segregation analysis of the transgene might be calculated by khi quadrate equation. The purpose of this research was to identify the transgene segregation pattern of a marker gene (hpt) as well as the introduced OsLEA::oshox6 gene in the second generation (T1) of transgenic rice plants Batutegi and Kasalath cultivars. Gene segregation (hpt) analysis was carried out using PCR method. Gene expression analysis was done by hygromycin antibiotic resistant test of leaf samples. Analysis was carried out on 17 lines of T1 transgenic rice plants from Batutegi and Kasalath cultivars. The hpt gene was inherited by mendelian segregation (3:1). This segregation suggested the same inheritance trait for the oshox-6 gene. The hpt gene expression in leaves has shown that one line (T1-BT III 2C) out of 17 lines was not follow the mendelian inheritance rule. The hygromycine test has shown that some transgenic plants showed necrotic effects when was chalanged by hygromycin.This effect was suggested mainly due to different individual plant characteristic. The gene expression might be very low or having no expression at all.
Key word: Mendellian, hpt, OsLEA-oshox6, higromycin test
PENDAHULUAN
Pertumbuhan penduduk Indonesia mencapai 1.34% pada tahun 2000-2005 (BPS 2006) yang jika tidak diimbangi oleh peningkatan produksi pangan dapat menyebabkan kerawan pangan. Produksi pangan di Indonesia khususnya beras sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor penting antara lain: pemanasan global, penurunan luas lahan garapan akibat alih fungsi lahan, kelangkaan air, jumlah air irigasi menurun, degradasi lingkungan dan erosi, serangan hama dan penyakit, serta perubahan iklim yang sulit diprediksi (Miflin 2000).
Peningkatan produksi padi Indonesia di masa mendatang sangat tergantung pada pemanfaatan lahan sub optimum termasuk lahan kering. Ekstensifikasi pada lahan kering terkait erat dengan perubahan iklim global yang seringkali menyebabkan periode musim kering yang lebih panjang. Perubahan iklim seperti El Nino berpengaruh besar terhadap produktivitas padi. El Nino tahun 1997/1998 menyebabkan impor beras Indonesia mencapai 5,8 juta ton atau setara dengan 20% dari total perdagangan beras dunia (Naylor et al. 2007). Kemarau panjang tahun 2006 juga menyebabkan sebagian besar lahan pertanaman padi gagal panen. Pengembangan padi gogo toleran kekeringan sangat diperlukan untuk megantisipasi perubahan iklim yang demikian.
Pengembangan padi toleran kekeringan dapat dilakukan melalui transformasi genetik menggunakan gen regulator faktor transkripsi (FT). Gen FT berperan dalam meregulasi sejumlah gen lain yang bertanggung jawab untuk menghadapi cekaman kekeringan. Salah satu gen regulator tersebut ialah HD-Zip
oshox6 yang responsif kekeringan. Regulasinya meningkat ketika ada cekaman
kekeringan (Agalou et al. 2008), namun karakterisasi fungsi gen ini belum dipelajari. Gen ini dikendalikan oleh promotor terinduksi kekeringan yaitu OsLEA (late embryogenesis abundant) di dalam plasmid pC1301H oshox-6. Pada daerah T-DNA terdapat gen hpt (hygromycin phosphotransferase) dan penanda gusA yang keduanya dikendalikan promotor 35S CaMV (Cauliflower Mosaic Virus). Plasmid pC1301H oshox-6 telah berhasil ditransformasikan ke dalam genom padi indica cv. Batutegi dan Kasalath menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Pada generasi pertama (T0), gen hpt terintegrasi dalam genom dengan jumlah salinan gen antara 1-4.
Gen sisipan hasil transfornasi pada tanaman generasi pertama akan terintegrasi di salah satu pasangan kromosom sehingga tetua bersifat hemizygous. Gen sisipan akan bersegregasi pada turunannya. Apabila gen yang terintegrasi bersifat dominan dan terintegrasi pada satu lokus maka pola segregasi akan mengikuti hukum Mendel dengan rasio 3:1. Segregasi gen sisipan dapat dilakukan dengan cara menganalisis keberadaan gen dalam genom dan menganalisis ekspresinya. Analisis segregasi gen sisipan dihitung dengan persamaan khi kuadrat.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pola pewarisan gen sisipan hpt sekaligus untuk menduga pola pewarisan gen oshox6 dalam genom padi transgenik generasi kedua (T1) dari cv. Batutegi dan Kasalath.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler dan rumah kaca Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, pada Desember 2009 – Februari 2010.
Material Penelitian
Bahan tanaman yang digunakan adalah 7 galur tanaman transgenik cv. Batutegi (BT) dan 10 galur Kasalath (Kas) generasi kedua (T1). Galur-galur yang diuji diutamakan memiliki jumlah salinan gen sisipan tunggal dan memiliki jumlah benih cukup banyak. Namun demikian, disertakan pula beberapa galur yang memiliki jumlah salinan gen lebih dari satu. Galur-galur dengan salinan gen tunggal ialah: BT III 2C, BT III 1A, BT II 4A, BT II 1B, T1-BT II 2A, T1-Kas III 1B, T1-Kas V 1B, T1-Kas IV 1A, T1-Kas VII 6A, T1-Kas III 3A, T1-Kas III 2B, T1-Kas V 1A, dan T1-Kas III 2A. Galur-galur dengan tiga salinan gen sisipan ialah: T1-BT II 1A, T1-BT III 1E, T1-Kas IV 2A dan T1-Kas IV 1B.
Persiapan Tanaman
Benih generasi kedua ditanam dalam bak plastik berukuran 40 cm x 30 cm x 10 cm. Media pembibitan ialah campuran tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 3:1. Masing-masing galur ditanam 50 benih dalam setiap bak. Kemudian dipilih 30 tanaman secara acak untuk dianalisis PCR dan ketahanan higromisin.
Isolasi DNA genomik
Daun padi diambil dari bibit yang berumur 15 hari. DNA padi diisolasi dengan metode CTAB. Daun sepanjang 5 cm dimasukan ke dalam tabung 1.5 ml, diberi N2 cair lalu digerus dan ditambahkan 750 μl dapar isolasi. Dapar isolasi
terdiri dari dapar lisis (Tris-HCl pH 7.5 0.2 M, EDTA 0.05 M, NaCl 2 M, dan CTAB 2%)], dapar ekstraksi (sorbitol 0.35 M, Tris-HCl pH 7.5 0.1 M, 5 mM EDTA) dan 5% sarkosil. Selanjutnya reaksi diinkubasi pada suhu 65oC selama 1 jam. Kemudian ke dalam tabung ditambahkan 750 μl chloroform:isoamylalkohol (24:1) dan disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 8.000 rpm pada suhu 4oC. Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan ditambah dengan 400 μl isopropanol dingin, lalu disentrifugasi selama 6 menit dengan kecepatan 8.000 rpm pada suhu 4oC. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 70% etanol. Pelet dalam tabung dikeringkan dan dilarutkan dengan 20 μl dapar TE pH 8.0.
Analisis integrasi gen hpt
Analisis Polymerase Chain Reaction (PCR) dilakukan untuk mengetahui keberadaan gen sisipan dalam genom padi transgenik generasi kedua (T1). Posisi gen hpt berada dalam T-DNA yang sama dengan gen target oshox-6 (Gambar 1).
LB hpt II CaMV Oshox6 P-OsLEA CaMV gusA RB
Gambar 1. Skema daerah T-DNA dalam vektor transformasi pC1301H Oshox-6.
Sepasang primer untuk penggandaan gen hpt ialah: hpt forward 5’-GATGC CTCCGCTCGAAGTAGCG-3’ dan reverse 5’-GCATCTCCCGCCGTGCAC-3’. Volume untuk 1x reaksi PCR ialah 12.5 µl dengan komposisi : 6.25 μl taq polimerase mix (dream taq mix (Fermentas), 0.2 μM primer hpt reverse, 0.2 μM primer hpt forward, 100 ng DNA hasil isolasi sebagai cetakan, dan dH2O.
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan alat PCR Thermal Cycler (Biometra). Kondisi PCR ialah: satu siklus denaturasi (95oC, 3 menit); 30 siklus amplifikasi [denaturasi 95oC 1 menit, annealing 65oC 1 menit, sintesis 72oC 1 menit]; 72oC 10 menit (pemanjangan final); 4oC (penyimpanan). Hasil PCR dianalisis pada 1% gel agarose. Gel diwarnai menggunakan ethidium bromida (0,5 mg/liter) untuk visualisasi pita DNA. Produk amplifikasi berukuran +500 pb.
Segregasi gen hpt
Pola segregasi gen hpt berdasarkan keberadaan pita DNA hasil amplifikasi yang dianalisis dengan khi-kuadrat, yaitu membandingkan nilai khi kuadrat hitung dengan nilai Tabel. Nilai khi-kuadrat (X2) dihitung dengan persamaan:
X2 = (Oi-ei)2
ei
dimana:
Oi = jumlah suatu fenotipe ke-i menurut hasil pengamatan. ei = jumlah fenotipe tersebut yang diharapkan menurut hipotesis
Analisis ekspresi dan segregasi gen hpt
Analisis dilakukan terhadap daun tanaman berumur 3 minggu. Larutan penguji terdiri dari: 0,01% gel (gelrite) 1000 µl yang telah dipanaskan, 780 µl air steril, 1% triton X-100 200 µl, setelah suhu larutan sekitar 30°C, ditambahkan 20 µl higromisin (stok 50 µg/ml). Larutan kontrol dibuat seperti larutan penguji tanpa higromisin. Pada satu helai daun dibuat dua buah lingkaran dengan menggunakan spidol. Disamping masing-masing lingkaran diberi tanda (+) dan (–) untuk memudahkan aplikasi pengujian. Lingkaran dengan tanda (+) diulasi dengan larutan penguji dan pada lingkaran (-) diulasi dengan larutan kontrol. Pengamatan ketahanan daun tanaman terhadap higromisin dilakukan setelah 3 hari perlakuan. Daun yang mengalami nekrotik pada lingkaran yang diulas larutan penguji menunjukkan tanaman tersebut peka terhadap antibiotik higromisin.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis segregasi gen hpt dengan PCR
Pada dasarnya analisis PCR bertujuan untuk mengetahui integrasi suatu gen. Dalam penelitian ini selain mengetahui integrasi gen hpt, hasil PCR digunakan juga untuk melihat pewarisan gen tersebut berdasarkan jumlah tanaman terintegrasi. Hasil PCR menunjukkan bahwa sebagian besar segregan (30 tanaman per galur) dari 17 galur yang diuji menghasilkan produk amplifikasi gen
hpt sebesar + 500 pb. Selanjutnya hasil analisis pewarisan menunjukkan bahwa
gen tersebut terwariskan secara Mendelian dengan pola 3:1 pada semua galur (Tabel 1 dan Gambar 2). Berdasarkan hasil tersebut, diduga gen hpt masuk ke dalam genom inti sel tanaman dan terwariskan pada generasinya. Pola segregasi gen hpt dapat menjadi indikasi pewarisan gen lain dalam satu T-DNA termasuk gen oshox6.
5 56600bbpp 500 pb 2 233113300bbpp 9 9441166bbpp 6 6555577bbpp 4 4336611bbpp 2 2332222bbpp 2002277 2 bbpp χ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 A hpt χ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 31 32 33 2 233113300bbpp 9 9441166bbpp 6 6555577bbpp 4 4336611bbpp 2 2332222 bbpp 2 2002277 bbpp 5 56600bbpp 500 pb B hpt
Gambar 2. Hasil analisis PCR menggunakan primer hpt pada generasi kedua (T1) padi transgenik mengandung promotor OsLEA:: oshox-6. A. Batutegi galur T1-BT II 1B, B. Kasalath galur T1-Kas VII 6A
χ. χ/HindIII; 1. plasmid pC1301H Oshox-6; 2. Batutegi T0 K+/ Kasalath T0 K+ 3. Batutegi T1 K- / Kasalath T1 K-; 4. air; 5-33 pada A. transforman Batutegi; 5-35 pada B. transforman Kasalath. Panah dengan 500 pb adalah gen hpt .
Analisis ekspresi dan segregasi gen hpt
Higromisin merupakan sistem marker ketahanan antibiotik yang banyak digunakan untuk transformasi pada tanaman monokotil terutama gramineae (Bashir et al. 2004). Uji ketahanan terhadap higromisin pada daun tanaman segregan transgenik merupakan salah satu cara untuk mengetahui keberadaan gen
hpt di genom dan ekspresinya. Antibiotik higromisin bekerja dengan cara
menghambat sintesis protein melalui gangguan translokasi yang menyebabkan kesalahan translokasi pada ribosom 80S (Bashir et al. 2004).
Hasil pengamatan ekspresi higromisin menunjukkan bahwa galur T1-BT III 2C tidak mengikuti pola pewarisan Mendel, meskipun berdasarkan PCR mengikuti pola segregasi Mendel. Daun yang menunjukkan gejala nekrotik merupakan tanaman peka terhadap higromisin, sebaliknya daun yang segar tahan higromisin. Tanaman transgenik yang mengandung gen hpt (berdasarkan uji PCR) dan mengekspresikan gen tersebut tidak menunjukkan gejala nekrotik pada lingkaran yang disapu dengan larutan uji. Ekspresi gen hpt terjadi pada sebagian besar segregan yang diuji. Pada tanaman demikian, enzim higromisin fosfo-
transferase yang dihasilkan gen hpt mampu mendetoksifikasi aminosiklitol higromisin B (Rodriguez & Nottenburg 2002) dan mengkatalisis fosforilasi kelompok hydroxyl dalam antibiotik higromisin sehingga menjadi tidak aktif dan tidak meracuni sel tanaman (Brasileiro & Aragao 2001).
Keberadaan gen hpt dalam genom tidak selalu menunjukkan ekspresi gen tersebut. Tanaman transgenik yang tidak mampu mengekspresikan ketahanan higromisin menunjukkan gejala nekrotik pada daerah lingkaran yang disapu dengan larutan uji dan tidak nekrotik pada lingkaran yang disapu larutan kontrol. Gejala nekrotik pada tanaman transgenik serupa dengan gejala nekrotik pada kontrol, artinya tanaman transgenik tersebut peka seperti tanaman kontrol.
Pada 12 galur transgenik yang diuji, populasi jumlah tanaman yang mampu mengekspresikan ketahanan higromisin lebih sedikit dibandingkan jumlah tanaman yang mengandung hpt berdasarkan PCR (Tabel 1 dan Gambar 3). Pada tanaman yang demikian ada dua kemungkinan yang terjadi. Pertama adalah bahwa gen tersebut mungkin diekspresikan tetapi dengan level yang sangat rendah. Jika pengujian ketahanan ini menggunakan konsentrasi higromisin yang lebih rendah, ada kemungkinan daun tanaman tersebut tidak menunjukkan gejala nekrotik. Dengan demikian sensitivitas tanaman terhadap higromisin akan sangat beragam tergantung pada tingkat ekspresi gen tersebut dalam setiap individu tanaman. Kemungkinan kedua yang lebih jauh ialah bahwa gen tersebut benar-benar tidak terekspresi. Artinya gejala nekrotik tetap terjadi meskipun konsentrasi larutan higromisin dalam level yang sangat rendah. Pada tanaman demikian diduga telah terjadi mekanisme gene silencing terhadap ekspresi gen hpt. Namun demikian hal ini masih perlu dibuktikan dengan analisis lanjut misalnya dengan melihat level mRNA (analisis dengan northern blot).
Tabel 1. Analisis pewarisan untuk parameter keberadaan gen hpt dalam genom dan ekspresi gen hpt pada populasi tanaman transgenik cv. Batutegi dan Kasalath generasi kedua (T1).
Nilai O X2 Kesimpulan
Galur Populasi Nilai E
PCR Hig PCR Hig X2 Tabel PCR Hig. T1-BT III 2C 30 22,5 14 11 3,2 5,9 3,8 1 2 T1-BT II 1A 30 22,5 30 29 2,5 1,9 3,8 1 1 T1-BT III 1E 19 14,3 18 15 1,0 0,0 3,8 1 1 T1-BT III 1A 30 22,5 28 27 1,3 0,9 3,8 1 1 T1-BT II 4A 30 22,5 19 18 0,5 0,9 3,8 1 1 T1-BT II 1B 29 21,8 25 25 0,5 0,5 3,8 1 1 T1-BT II 2A 30 22,5 29 27 1,9 0,9 3,8 1 1 T1-Kas III 1B 30 22,5 21 21 0,1 0,1 3,8 1 1 T1-Kas V 1B 30 22,5 30 28 2,5 1,3 3,8 1 1 T1-Kas IV 2A 19 14,3 17 16 0,5 0,2 3,8 1 1 T1-Kas IV 1A 30 22,5 27 27 0,9 0,9 3,8 1 1 T1-Kas VII 6A 30 22,5 30 24 2,5 0,1 3,8 1 1 T1-Kas III 3A 30 22,5 29 29 1,9 1,9 3,8 1 1 T1-Kas III 2B 30 22,5 24 21 0,1 0,1 3,8 1 1 T1-Kas V 1A 30 22,5 24 21 0,1 0,1 3,8 1 1 T1-Kas III 2A 30 22,5 27 24 0,9 0,1 3,8 1 1 T1-Kas IV 1B 16 12,0 16 16 1,3 1,3 3,8 1 1 Keterangan : - Hipotesis
Ho : Data yang diamati sesuai dengan nisbah 3:1 H1 : Data yang diamati tidak sesuai dengan nisbah 3:1 - Kesimpulan: 1= terima H0, 2 = terima H1
D. T1-Kas V.1B +
-
C. T1- BT III. 1A +-A. Batutetgi kontrol (peka)
+
-B. Kasalath kontrol (peka)
+
-peka tahan
Gambar 3. Hasil Uji higromisin pada daun tanaman.
A-B adalah daun tanaman kontrol cv. Batutegi dan Kasalath
C-D daun tanaman galur transgenik yang tahan dan peka terhadap higromisin. (+) lingkaran disapu larutan higromisin, (–) lingkaran disapu larutan kontrol
KESIMPULAN
1. Pada semua galur transgenik yang diuji berdasarkan keberadaan gen hpt, gen tersebut diwariskan dan mengikuti hukum pewarisan Mendel 3:1 untuk gen tunggal dominan, sehingga gen sisipan terintegrasi pada inti sel dan pada lokus tunggal.
2. Ekspresi gen hpt pada daun menunjukkan bahwa dari 17 galur yang diuji, hanya galur T1-BT III 2C yang tidak mengikuti pola pewarisan Mendel.
3. Daun tanaman transgenik yang nekrotik ketika diuji higromisin sangat ditentukan oleh tingkat ekspresi gen hpt pada tiap individu tanaman. Ekspresi yang terjadi mungkin sangat rendah atau sama sekali tidak terekpresi.
