Lampiran 1 Sertifikat Kelaikan Etik

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

Lampiran 4.2

Perhitungan Kadar

Curcumin

dalam Sampel vs

Curcumin

dalam Standar dan Perhitungan Kadar

Curcuminoid

dalam Sampel vs

Curcuminoid

dalam

Standar

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16)

(17)

Lampiran 6 Konversi

Perhitungan

Dosis

pada

Hewan

Coba

(Laurence & Bacharach, 1964)

Mencit

20 g

Tikus

200 g

Marmot

400 g

Kelinci

1.5 kg

Kucing

2 kg

Kera

4 kg

Anjing

12 kg

Manusia

70 kg

Mencit

20 g

1.0

7.0

12.25

27.8 29.7 64.1 124.2

387.9 Tikus

200 g

0.14

1.0

1.74

3.9

4.2

9.2

17.8

56.0 Marmut

400 g

0.08

0.57

1.0

2.25

2.4

5.2

10.2

31.5 Kelinci

1.5 kg

0.04

0.25

0.44

1.0

1.08

2.4

4.5

14.2 Kucing

2 kg

0.03

0.23

0.41

0.92

1.0

2.2

4.1

13.0 Kera

4 kg

0.016

0.11

0.19

0.42

0.45

1.0

1.9

6.1 Anjing

12 kg

0.008

0.06

0.10

0.22 0.24 0.52

1.0

3.1 Manusia

70 kg

0.0026

0.018

0.031

0.07 0.076 0.16

0.32

1.0

(18)

Lampiran 7 Volume Maksimum Larutan Sediaan Uji yang Dapat

Diberikan pada Hewan Coba (Ritchel, 1974)

Jenis Hewan Coba Volume Maksimum (ml) Sesuai Jalur Pemberian

i.v

i.m

i.p

s.c

p.o

Mencit (20-30 g)

0,5

0,05

1,0

0,5-1,0

1,0

Tikus (200 g)

1,0

0,1

2-5

5,0

Hamster (50 g)

-

0,1

1-2

2,5

Marmut (300 g)

-

0,25

2-5

5.0 10,0

Kelinci (2.5 kg)

5-10

0.5 10-20

5-10

20,0

Kucing (3 kg)

5-10

1,0

10-20

5-10

50,0

Anjing (5 kg)

10-20

5,0

20-50

10,0

100,0

(19)

Lampiran 8 Kelompok Perlakuan pada Hewan Coba

CATATAN

- Bising yang diberikan: 100 dB selama 2 jam perhari

- Curcuminoid diberikan: 50 mg/ekor perhari

100 mg/ekor perhari

- CMC yang diberikan (0.5%) = 0.5 gr/100cc larutan

- Setiap kelompok perlakuan diberikan bising terlebih

dahulu lalu diikuti pemberian curcuminoid

Kelompok 3

Bising (+) Curcuminoid (+) CMC (+)

Kelompok 4

Kelompok 5

Curcuminoid (+) CMC (+)

Mulai

12/11/2012

Mulai

12/11/2012

Tikus tidak diberi

perlakuan apapun

Kelompok 2

Bising (+) CMC (+)

Terminasi 2

26/11/2012

Terminasi 1

12/11/2012

Kelompok 1

CMC (+)

Mulai

29/10/2012

†

(20)

Lampiran 9.1

Skema Pembuatan Preparat dengan Metode Parafin

Deparafinisasi: 2-3 kali direndam dengan

xylol

3 menit: 2-3 kali direndam dalam alkohol absolut

dua kali selama 3 menit

2-3 kali direndam dalam alkohol 95% dua kali

selama 3 menit

2-3 kali direndam dalam alkohol 80% dua kali

selama 3 menit

2-3 kali direndam dalam alkohol 70% dua kali

selama 3 menit

Direndam dalam air

Dikeringkan dengan

tissue

, diberi tanda dengan

pena parafin

Direndam dalam PBS selama 5 menit

Diteteskan tripsin 0.025% selama 6 menit dalam

37

o

C

Dicuci dengan PBS 2-3 menit

Diteteskan H

2

O

2

selama 2 menit, dicuci dengan

PBS 3 kali 2-3 menit

Pemotongan dengan mikrotom, kemudian obyek

diberi poliolesin

(21)

Lampiran 9.2

Pewarnaan Imunohistokimia

Deparafinisasi: direndam dengan

xylol

3 kali; direndam dalam alkohol

Direndam dalam alkohol 95% tiga kali

Direndam dalam alkohol 80% tiga kali

Direndam dalam alkohol 70% tiga kali

Preparat dicuci 2 kali dengan PBS

Dilakukan bloking dengan BSA 3% selama 10 menit

Preparat direaksikan dengan

anti mouse

sesuai variabel

Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 4

o

C dalam

humidity chamber

Preparat direaksikan dengan

biotylized secondary Ab

(

anti rabbit

)

selama 1 jam

Preparat dicuci dengan PBS 3 kali masing-masing 5 menit

Ditambahkan streptavidin berlabel peroksidase dan diinkubasi selama

1 jam, kemudian dicuci dengan PBS 3 kali

Direaksikan dengan substrat DAB yang dibuat baru dan diinkubasi 30

menit pada suhu kamar sambil digoyang-goyang

Preparat dicuci akuades, kemudian ditambahkan pewarna meyer-HE

selama 10 menit

Dicuci dengan air kran, kemudian dengan akuades

Preparat diangin-anginkan, kemudian dengan akuades

(22)

Hewan coba diambil sampel jaringan, difiksasi dengan

10% formalin

Sampel jaringan dibuat sediaan irisan setebal 2-4 µm,

kemudian dilakukan pewarnaan

Semua slide yang sudah berkode, ditutup nomer

kodenya dan diberi nomor baru secara acak

Pemeriksa terdiri dari 3 orang dan dilakukan terpisah

Pemeriksaan dan penghitungan sel-sel dilakukan

terhadap masing-masing slide pada bidang pandang di

dinding lateral sediaan, yaitu daerah yang ditandai

dengan adanya makrofag, dengan pembesaran 400,

1 lapangan pandang menggunakan gratikuli

Hasil penghitungan sel-sel untuk setiap lapangan

pandang sesuai dengan slide yang diperiksa ditulis di

lembar kerja pada kotak yang sesuai dan hasil akhirnya

(23)

A

C

B

D

Lampiran 10.1

Gambar Alat Stresor Bising

Keterangan:

A. Kotak perlakuan terbuat dari gabus dilapis oleh busa,

speaker

diletakkan menempel pada atap penutup kotak dan pada dasar

kotak dibuat lubang untuk mengukur intensitas

B. CD Player

dan

Amplifier

untuk mengatur intensitas (dB) sesuai

tombol volume dan dipastikan suara yang dihasilkan yang diukur

dengan

sound level meter

C. Kotak perlakuan,

CD Player

dan

Amplifier

(24)

A

B

C

_D

Lampiran 10.2

Gambar Prosedur Penelitian

Keterangan:

A. Penimbangan berat badan tikus sebelum dan sesudah perlakuan

B. Kandang tempat pemeliharaan tikus

C. Curcuminoid

yang sudah disuspensikan dengan CMC 0.5%

D. Pemberian larutan

curcuminoid

pada tikus personde

(25)

A

C

_D

B

Keterangan:

A. Tikus yang sedang berada dalam kandang perlakuan

B. Proses pengambilan tulang Temporal tikus

C. Tulang Temporal tikus

(26)

Lampiran 11

Data Sampel Penelitian

No

Imunohistokimia

Kel. HSP-70 MMP-9 TLR-2

TLR-4

NFκB

Kolagen Tipe IV

1

3

0

2

3

2

12

2

1

2

4

2

3

16

3

1

3

0

3

10

4

1

2

3

2

3

2

13

5

1

4

0

3

4

3

15

6

2

18

23

15

20

16

3

7

2

21

20

13

23

18

4

8

2

23

21

12

20

21

6

9

2

19

18

17

18

24

6 10 2

15

17

14

24

23

3 11 3a

13

18

15

19

18

11 12 3a

12

16

20

17

13 13 3a

10

19

14

21

20

14 14 3a

9

20

14

20

18

12 15 3a

8

21

15

18

19

14 16 3b

11

10

9

13

11

18 17 3b

13

9

12

10

13

23 18 3b

14

8

10

12

15

20 19 3b

13

9

13

9

11

23 20 3b

10

8

15

13

17

20 21 4a

3

11

8

6

11

16 22 4a

4

13

6

4

18

23 23 4a

6

10

11

3

15

20 24 4a

3

13

2

17

18 25 4a

6

9

14

2

10

23 26 4b

1

6

3

2

23 27 4b

1

8

4

3

4

24 28 4b

2

8

5

3

25 29 4b

1

8

3

2

23 30 4b

1

6

4

3

24 31 5a

6

11

13

13 32 5a

8

12

10

12

15

12 33 5a

6

8

13

11

10

14 34 5a

7

8

12

13

11

11 35 5a

6

8

12

15

13 36 5b

2

3

4

5

3

31 37 5b

4

2

4

3

5

34 38 5b

3

1

5

3

30 39 5b

2

3

5

32 40 5b

2

1

4

3

6

34

(27)

Lampiran 10.3 Gambar prosedur pemeriksaan Imunohistokimia

1. Prestaining

Keterangan:

A. Preparasi sampel dan memanaskan pada inkubator 37

0

24 jam

C selama

(28)

2. Deparafinisasi

Keterangan:

B. Menggunakan

xylol

dan alkohol berseri. Simpan pada suhu 4

0

sampai dilakukan

immunostaining

C

C. Bilas dengan dH

2

PBS pH 7.4 satu kali selama 5 menit dan tiriskan

O selama 5 menit dan lakukan pencucian dengan

B

(29)

Keterangan:

D. Blocking endogenous

peroksida menggunakan 3% H

2

O

2

20 menit. Cuci menggunakan PBS pH 7.4 tiga kali selama 5 menit.

selama

Blocking

unspecific

protein menggunakan 5% FBS yang

mengandung 0.25% Triton X-100 dan cuci menggunakan PBS

pH 7.4 tiga kali selama 5 menit

Keterangan:

E. Inkubasi menggunakan monoklonal anti (antibodi primer) selama

D

(30)

F

Keterangan:

F. Cuci menggunakan PBS pH 7.4 tiga kali selama 5 menit. Kemudian

inkubasi menggunakan

anti mouse biotin conjugated

selama 2 jam.

Keterangan:

G. Cuci menggunakan PBS pH 7.4 tiga kali selama 5 menit dan

inkubasi menggunakan SA-HRP selama 40 menit pada temperatur

ruangan

(31)

Keterangan:

H. Cuci menggunakan PBS pH 7.4 tiga kali selama 5 menit dan tetesi

dengan DAB (Diamino Benzidine) dan inkubasi selama 10 menit

(32)

Keterangan:

I. Cuci menggunakan PBS pH 7.4 tiga kali selama 5 menit dan dH

2

O

2

selama 5 menit, kemudian

counterstaining

menggunakan

Mayer

Hematoxilen

yang diinkubasi selama 10 menit dan cuci dengan

tap

water

J. Bilas menggunakan dH

2

menggunakan entelan dan tutup dengan

cover glass

. Amati pada

O dan kering anginkan.

Mounting

mikroskop cahaya

I

(33)

Lampiran 12 Hasil Analisis Statistik

Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 1

The GLM Procedure Class Level Information Class Levels Values

Perlakuan 8 K1 K2 K3A K3B K4A K4B K5A K5B Number of observations 40

The GLM Procedure Dependent Variable: HSP70

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 1317.775000 188.253571 71.72 <.0001 Error 32 84.000000 2.625000

Corrected Total 39 1401.775000

R-Square Coeff Var Root MSE HSP70 Mean 0.940076 21.82068 1.620185 7.425000

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1317.775000 188.253571 71.72 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1317.775000 188.253571 71.72 <.0001 Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value

K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 122.2321429 122.2321429 46.56 K2 VS K3 1 208.0333333 208.0333333 79.25 K2 VS K4 1 896.5333333 896.5333333 341.54 K2 VS K5 1 710.5333333 710.5333333 270.68 K3A VS K3B 1 8.1000000 8.1000000 3.09 K4A VS K4B 1 25.6000000 25.6000000 9.75 K5A VS K5B 1 40.0000000 40.0000000 15.24 Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001

(34)

The GLM Procedure Dependent Variable: MMP9

Sum of

R-Square Coeff Var Root MSE MMP9 Mean 0.948605 16.68191 1.643168 9.850000

K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 388.9285714 388.9285714 144.05 K2 VS K3 1 120.0000000 120.0000000 44.44 K2 VS K4 1 374.5333333 374.5333333 138.72 K2 VS K5 1 662.7000000 662.7000000 245.44 K3A VS K3B 1 250.0000000 250.0000000 92.59 K4A VS K4B 1 40.0000000 40.0000000 14.81 K5A VS K5B 1 136.9000000 136.9000000 50.70 Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B <.0001 K4A VS K4B 0.0005 K5A VS K5B <.0001

(35)

The GLM Procedure Dependent Variable: TLR2

Sum of

R-Square Coeff Var Root MSE TLR2 Mean 0.883718 20.24372 1.837117 9.075000

K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 225.0035714 225.0035714 66.67 K2 VS K3 1 2.7000000 2.7000000 0.80 K2 VS K4 1 168.0333333 168.0333333 49.79 K2 VS K5 1 154.1333333 154.1333333 45.67 K3A VS K3B 1 22.5000000 22.5000000 6.67 K4A VS K4B 1 108.9000000 108.9000000 32.27 K5A VS K5B 1 115.6000000 115.6000000 34.25 Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 0.3778 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B 0.0146 K4A VS K4B <.0001 K5A VS K5B <.0001

(36)

The GLM Procedure Dependent Variable: TLR4

Sum of

R-Square Coeff Var Root MSE TLR4 Mean 0.966085 15.49759 1.491643 9.625000

(37)

The GLM Procedure Dependent Variable: NFkBp65

Sum of

R-Square Coeff Var Root MSE NFkBp65 Mean 0.914607 20.12460 2.238861 11.12500

K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 415.2892857 415.2892857 82.85 K2 VS K3 1 67.5000000 67.5000000 13.47 K2 VS K4 1 472.0333333 472.0333333 94.17 K2 VS K5 1 464.1333333 464.1333333 92.60 K3A VS K3B 1 62.5000000 62.5000000 12.47 K4A VS K4B 1 324.9000000 324.9000000 64.82 K5A VS K5B 1 176.4000000 176.4000000 35.19 Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 0.0009 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B 0.0013 K4A VS K4B <.0001 K5A VS K5B <.0001

(38)

The GLM Procedure Dependent Variable: Kolagen4

Sum of

R-Square Coeff Var Root MSE Kolagen4 Mean 0.956273 10.91401 1.907223 17.47500