LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER
“Isolasi DNA Tanaman Ubi Banggai Mutan”
Oleh kelompok 1 :
Silvia Telese (16 507 034) Belina E. Kosegeran (16 507 002) Destiany Pasappa’ (16 507 104) Vicca T. Tengkel (16 507 019) Icimilia Rompas (16 507 097)
UNIVERSITAS NEGERI MANADO
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala rahmat-NYA sehingga laporan praktikum ini dapat tersusun hingga selesai. Tidak lupa kami juga mengucapkan banyak terima kasih atas bantuan dari pihak yang telah berkontribusi dengan memberikan sumbangan baik materi maupun pikirannya.
Dan harapan kami semoga laporan praktikum ini dapat menambah pengetahuan dan pengalaman bagi para pembaca, Untuk ke depannya dapat memperbaiki bentuk maupun menambah isi makalah agar menjadi lebih baik lagi.
Karena keterbatasan pengetahuan maupun pengalaman kami, masih banyak kekurangan dalam penulisan makalah ini, Oleh karena itu kami sangat mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari pembaca untuk perbaikan makalah ini.
Tondano, Desember 2018
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ... 1
DAFTAR ISI ... 2
I. PENDAHULUAN ... 3
A. LATAR BELAKANG... 3
B. TUJUAN PRAKTIKUM... 4
II. METODE PRAKTIKUM ... 5
A. Waktu dan tempat ... 2
B. Alat dan bahan ... 3
C. Prosedur pelaksanaan ... 5
III. HASIL PENGAMATAN ... 7
IV. PEMBAHASAN ... 9
V. KESIMPULAN ... 12
DAFTAR PUSTAKA ... 13
A. Latar Belakang
DNA merupakan materi yang membentuk kromosom-kromosom dan juga merupakan informasi genetik yang tersimpan dalam tubuh makhluk hidup. Informasi genetik ini pada dasarnya merupakan kumpulan instruksi/perintah yang mengatur sel untuk bisa melakukan hal-hal tertentu. DNA singkatan darideoxyribonucleic acid, atau dalam Bahasa Indonesia disebut dengan Asam Deoksiribosa Nukleat atau ADN. Kata deoxyrybo mengacu pada nama gula yang terkandung dalam DNA, yaitu deoxyrybose (deoksiribosa) (Tohib, 2012).
Susunan kimia DNA adalah polimer berupa rantai panjang dari nukleotida. Perlu Kamu ingat bahwa satu nukleotida terdiri dari satu gugus fosfat, satu komponen gula pentosa (5-karbon), dan satu basa nitrogen. Satu-satunya pembeda tiap nukleotida ialah basa nitrogen. Hanya ada 4 kemungkinan basa yang terdapat pada tiap satu nukloetida DNA, yaitu adenine (A), guanine (G), thymine (T), ataucytosine (C). Variasi urutan dari keempat basa-basa tersebut membentuk suatu kode genetik pada sel. Mungkin hal ini dirasa aneh, hanya dengan 4 huruf yang terdapat pada DNA, suatu informasi genetik yang berbeda-beda dapat diwariskan pada keturunan makhluk hidup. Itu sebenarnya wajar saja, karena pada kromosom terdapat berjuta-juta nukleotida, maka sangat banyak kombinasi yang berbeda meskipun hanya berasal dari 4 huruf tersebut. James Watson dan Francis Crick memenangkan Nobel di tahun 1962 mengenai model penyatuan sturktur DNA. Bersama dengan Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins, mereka menyatakan bahwa struktur DNA merupakan dua untaian nukleotida yang disebut dengan double helix, dimana untaian tersebut tersusun secara spiral dengan posisi gula dan gugus fosfat terletak di sisi luar dan basa-basa nitrogen saling berpasangan di sisi dalam (menyambung kedua untaian tersebut).
dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.
Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit (Albert, 1994). Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.
B. Tujuan
II. METODE PRAKTIKUM
A. WAKTU DAN TEMPAT
Tanggal :
Waktu : 10 : 00 – 13 : 15
Tempat : Laboraturium biologi molekuler jurusan biologi FMIPA UNIMA
B. ALAT DAN BAHAN
- ZR Bashing Bead Lysis Tube (2.mm)
- Zymo-Spin IV Spin Filter (penutup berwarna orange) - Zymo-Spin IV HRC Spin Filter (penutup berwarna hijau) - Collection tube
- Matrix column 2.
Bahan
- DNA Evolution Buffer 100µl
C. PROSEDUR PELAKSANAAN
Protokol isolasi DNA Tumbuhan dengan menggunakan Kit Quick-DNA Plant/Seed Miniprep Zymo Research:
1. Ambil sampel tumbuhan Daun Ubi Banggai ( Pothil) sebanyak 0,3 gram (sebelumnya dibersihkan dengan alkohol), digerus pada mortar sampai halus dan kemudian dimasukan kedalam ZR Bashing Bead Lysis Tube (2.0 mm). Tambahkan lysis soluction sebanyak 750µl.
2. Vortex sampel pada kecepatan maksimal sekitar 20 menit 3. Sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit
4. Transfer supernatan sebanyak 400µl pada Zymo-spin IV spin filter (penutup berwarna orange yang sudah diletakan pada collection tube dan sentrifugsi pada 7000 rpm selama 1 menit.
5. Tambahkan 1.200µl Genomic Lysis Buffer pada tube dan campurkan di inversi. 6. Ambil 800µl campuran pada langah 5 Zymo-spin IIC Column yang sudah diletakan
pada collection tube dan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit 7. Buang supernatan dari sentrifuge dan ulangi langkah 6
8. Tambahkan 200µl DNA Pre-Wash Buffer pada tube sebelumnya (Zymo-spin IIC Column) dan sentrifugasi pada 10.000 rpm selama 2 menit
9. Tambahkan 500µl g-DNA Wash Buffer dan sentrifugasi pada 10.000 rpm selama 2 menit
10. Pindahkan Zymo-spin ICC column pada tube 1,5 ml steril dan tambahkan 100µl DNA Elution Buffer pada matrix column dan sentrifugasi pada 10.000 rpm selama 1 menit untuk mengulesi DNA.
11. Jepret dasar dari Zymo-spin IV HRC Spin Filter ( penutup berwarna hijau) dan letakan pada collection tube steril. Sentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama 4 menit.
12. Transfer Elusi DNA pada Zymo-spin IV HRC Spin Filter yang sudah disediakan (pada langkah 11) selama 2 menit.
III. HASIL PENGAMATAN
No. Gambar pengamatan Keterangan
1. Sempel yang akan di amati DNAnya.
2. Tahap penggerusan sempel pada mortar sampai halus
3. Jika sempel telah halus lalu dimasukan ke dalam ZR BashingBead Lysis Tube
5. Penimbangan sempel ubi banggai (mutan) menggunakan timbangan digital.
IV. PEMBAHASAN
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi. Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel darah serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel. Sampel dari daun macam-macam jenis tanaman adalah sebanyak 200 gram. Tulang daun tidak boleh ikut dalam penelitian, maka membuang tulang daun sebelum ditimbang sangat diperlukan. Tulang daun tidak ikut ditumbuk karena DNA tanaman tidak ada pada tulang daun, melainkan pada jaringan klorofil daun. Larutan CTAB pertama-tama ditambahkan sebanyak 1 ml untuk membantu memudahkan proses penggerusan. Larutan buffer CTAB ini sebaiknya dihangatkan dulu sebelum digunakan untuk membantu dalam penggerusan DNA. Larutan CTAB bisa diletakkan di dalam waterbath untuk menjaga larutan buffer tetap hangat. Setelah daun digerus menjadi halus dan telah dipastikan bahwa daun sudah benar-benar hancur sampai dengan ke jaringannya, tuang ekstrak daun tersebut ke dalam microtube dengan volume 2 ml. Untuk mencuci mortar dan pestle dari ekstrak daun yang masih menempel, larutan CTAB sebanyak 1 ml bisa ditambahkan kembali sebelum ditambahkan lagi ke dalam microtube 2 ml yang sebelumnya sudah terisi ekstrak daun dan larutan CTAB sebanyak 1 ml. Ketika semua sudah dimasukkan dalam microtube, maka akan didapatkan ekstrak daun tanaman pada microtube terisi penuh sebanyak 2 ml.
kortoran sisa protein dan polisakarida dari larutan dan mengurangi pembentukan busa selama ekstraksi. Padatan dibagian bawah yang dapat dibuang karena pada bagian bawah tersebut adalah asam nukleat dan polisakarida asam dari tanaman tersebut, sedangkan DNA berada di permukaan atas yang berwarna agak bening dibanding dengan padatannya. Microtube tersebut kemudian didinginkan pada icebath selagi menunggu proses sentrifugasi.
Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu rendah yaitu 4°C. Proses sentrifugasi membutuhkan keseimbangan antar microtube satu dengan microtube lain. Jadi pemasangan microtube pada refrugrated centrifuge berdasarkan berat microtube tersebut. Tutup microtube juga harus diperhatikan bahwa microtube sudah tertutup rapat. Karena jika tidak, saat alat berputar tutup yang tidak rapat bisa terbuka dan menumpahkan larutan. Sentrifugasi berfungsi untuk mengendapkan kotoran akibat lisis sel. Selain itu, supernatan atau fase cair yang berisi DNA juga terbentuk setelah sentrifugasi. Setelah sentrifugasi, laerutan supernatan atau fase cair dapat dipindahkan ke microtube 1,5 ml. Saat pemindahan supernatan ini harus hati-hati agar larutan yang berada di bawah microtube tidak ikut terambil. Pemindahan dilakukan menggunakan micropipet 200 ml yang diatur volumenya sesuai volume supernatan yang diperoleh. Volume supernatan kemudian dicatat karena volume supernatan yang diperoleh mempengaruhi jumlah larutan isopropanol dan Na-asetat yang akan ditambahkan. Larutan campuran tersebut kembali di sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Proses ini juga disebut sebagai Presipitasi DNA atau pengendapan DNA. DNA bisa tampak sebelum disentrifugasi. Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular. Jika DNA seperti lendir atau jelly di bawah larutan sudah tampak, dapat diartikan proses penumbukan berhasil menembus jaringan dengan baik sehingga DNA zang diperoleh cukup banyak. Sentrifugasi kembali pada kali ini dimaksudkan untuk membuat pelet DNA zang telah diperoleh, namun sebelum itu supernatan harus dibuang terlebih dahulu secara hati-hati jangan sampai DNA yang telah diperoleh ikut terbuang.
milliQ pada suhu 4°C sampai -20°C. Pemberian larutan buffer TE ini berbeda-beda sesuai dengan ukuran DNA yang diperoleh. Contoh pada kelompok 1, larutan TE yang ditambah untuk DNA nangka adalah sebanyak 200 µl, cabai 100 µl dan kemangi 100 µl. Seperti yang dijelaskan sebelumnya, masing-masing kelompok mendapat perlakuan yang berbeda pada tiap-tiap jenis daun tanamannya. Pada praktikum isolasi DNA, terbentuk 4 kelompok dan tiap-tiap kelompok mendapat 1 jenis daun tanaman ubi banggai dengan perlakuan yang sama.
Bila melihat hasil pengamatan dari tiap-tiap kelompok. Pengoyakan DNA paling penting saat proses penumbukan dan penggerukan diatas mortar. Proses ini harus dilakukan dengan seksama dan penuh perhatian ekstra agar jaringan dapat teroyak sempurna dan DNA berhasil diperoleh.
V. KESIMPULAN
Pada hasil yang diperoleh dari praktikum isolasi DNA ini, dapat disimpulkan bahwa ketika praktikum berlangsung, prinsip-prinsip isolasi DNA selalu diterapkan. Prinsip-prinsip DNA tersebut adalah penghancuran dinding sel dengan cara menumbuk dan menggerus diatas mortar, lalu penghilangan protein dan RNA menggunakan beberapa larutan buffer, pengendapan DNA atau presipitasi DNA dengan menambahkan larutan isopropanol dan Na-asetat pada sampel, dan terakhir adalah pemanenan DNA yaitu dengan diperolehnya pelet DNA.
VI. DAFTAR PUSTAKA
Albert, B., 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techiques in Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ,USA.
Surzycky, R. 2000. Molecular and Cellular Biology. Wadsworth Inc., Belmont
Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada tanggal 2 Juli 2015, pada pukul 23.00 WIB.
