DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA. Oleh: ANIFA BINTAR RAHMAWATI G

(1)

DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN

SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA

Oleh:

ANIFA BINTAR RAHMAWATI

G34102010

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(2)

ABSTRAK

ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Deteksi Afrikanisasi Pada Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA WIDJAJA.

Apis mellifera merupakan lebah madu yang persebaran alaminya meliputi daerah Mediterania,

Afrika, dan Eropa. Berdasarkan analisis morfometrik, Apis mellifera terbagi kedalam 24 subspesies yang terdiri dari kelompok garis keturunan A (Afrika), M (Eropa Utara dan Barat), C (Eropa Selatan) dan O (Timur Tengah). Peternak lebah di dunia banyak yang mengimpor A.

mellifera. Peternak di Indonesia umumnya mengimpor dari Australia. Peternakan lebah menjadi

terancam sejak A. m. scutellata diimpor dari Afrika ke Brazil yang keturunannya dengan A. m.

ligustica menghasilkan Africanized honeybee yang bersifat agresif. Hingga saat ini belum ada

usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu Indonesia khususnya di lembaga yang berwenang seperti Balai Karantina Hewan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi afrikanisasi pada lebah A. mellifera berdasarkan gen sitokrom b dari DNA mitokondria. Keberadaan lebah AHB dapat dideteksi dari DNA mitokondria melalui gen sitokrom

b berdasarkan keberadaan situs pemotongan enzim BglII. Hasil amplifikasi daerah gen sitokrom b

dengan menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b menghasilkan fragmen DNA berukuran 485 pb. Hasil pemotongan fragmen DNA tersebut dengan BglII menghasilkan satu mitotipe yang terdiri dari dua fragmen DNA masing-masing berukuran 194 pb dan 291 pb. Data DNA hasil restriksi menunjukkan bahwa belum ada AHB di Jawa.

ABSTRACT

ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Detection africanized of A. mellifera honeybee based on cytochrome b gene in mitochondria DNA. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA WIDJAJA.

Apis mellifera is a honeybee that spread in Mediterania, Africa, and Europe regions. Based on

morphometric analysis, it comprises of 24 subspecies that consist of four lineages; namely the African (A), Western and Northern Europe (M), Southeastern Europe (C), and Near Eastern (O). Beekeepers in many countries import and distribute A. mellifera. The beekeeper in Indonesia generally imported A. mellifera from Australia. The existence of A. m. scutellata in Brazil become threatened since A. m. scutellata hybridized with A. m. ligustica and became aggressive Africanized honeybee (AHB). Until recently, there was no attempt to detect the existence of the Africanized honeybee in quarantine apiary in Indonesia. Therefore, the objective of this research was to detect Africanized honeybee based on cytochrome b gene of mitochondrial DNA. Africanized honeybee could be detected based on cytochrome b gene in mitochondria DNA by using restriction site of cyt b/BglII. DNA fragment amplified by using cyt b forward and reverse primers revealed 485 bp. Digestion of the amplified region with the BglII restriction enzyme revealed one mitotype which produced two fragments of DNA that consist of 194 and 291 bp. This indicated that there were no AHB in Java, so far.

(3)

DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN

SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Oleh:

Anifa Bintar Rahmawati

G34102010

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

(4)

Judul Skripsi : Deteksi Afrikanisasi Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen

Sitokrom B Dari DNA Mitokondria

Nama

: Anifa Bintar Rahmawati

NRP

: G34102010

Menyetujui:

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Dr. Ir. Rika Raffiudin, Msi

Drs. Chandra Widjaja,MM

NIP 131 999 583

NIP 080 057 508

Mengetahui:

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS.

NIP 131473999

(5)

PRAKATA

Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat allah SWT atas segala rahmat serta limpahan karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.

Penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin, MSi. dan Drs. M. Chandra Widjaja, MM. atas bimbingan, saran, dan perhatiannya yang sangat besar selama ini. Terima kasih untuk Dr. Nampiah Sukarno, Msi. Atas masukan dan kritiknya terhadap karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan untuk mbak Zulfarida dan Apriani yang telah membantu selama penelitian di Laboratorium. Ucapan terima kasih juga kepada seluruh dosen Zoologi; Ibu Taruni, Bapak Heru, Ibu Wita Farajalah, Bapak Ahmad Farajalah, Bapak Bambang Suryobroto, Bapak Tri Atmowidi, kak Berry, dan mbak Kanthi, juga staf Zoologi mbak Tini atas nasehatnya, pak Djupri, dan pak Adi. Terima kasih juga untuk teman-teman di Laboratorium Zoologi atas kebersamaannya selama ini: Isma, Adisti, Rian Haris, Ikbal, Bian, Gema, Wida, Rifah, Sanah, Sumi, Dian Erlangga, dan seluruh teman-teman Biologi 39. Ucapan terima kasih juga untuk seluruh warga Griya Amani, kelompok azzahra dan seseorang yang memberikan semangat didalam hatiku.

Akhirnya, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sangat mendalam untuk Bapak dan Ibu, adik-adik: Putra Aminudin dan Ainin Jariati atas dukungan, semangat, kasih sayang serta doanya selama ini.

Bogor, Mei 2007

(6)

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Nabire Pada tanggal 2 Maret 1985 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara pasangan Rochmadi dan Siti Qomariah.

Penulis menyelesaikan pendidikan dasar pada tahun 1996 di SDN 02 Karang Tumaritis Nabire. Pendidikan menegah pertama diselesaikan pada tahun 1999 di SLTPN 1 Nabire. Pendidikan menengah atas diselesaikan pada tahun 2002 di SMUN 1 Nabire dan pada tahu yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis juga pernah mengikuti organisasi Himabio dan kewirausahaan Bioworld Pada Tahun 2003/2004. Kegiatan studi lapang pernah pernah dilakukan pada tahun 2004/2005 bertempat di Situ Gunung, Sukabumi dengan topik Identifikasi Semut Epifit. Pada tahun yang sama penulis menjadi asisten mata kuliah Vertebrata, Fisiologi Hewan dan Biologi Dasar. Kegiatan praktek lapang pernah penulis lakukan pada tahun 2005 mengenai aktivitas makan kupu-kupu jeruk Papilio demoleus di Museum Serangga dan Taman Kupu, Taman Mini Indonesia Indah. Penulis juga pernah mengikuti seminar

(7)

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL...

vii

DAFTAR GAMBAR ...

vii

DAFTAR LAMPIRAN...

vii

PENDAHULUAN

Latar Belakang ... 1

BAHAN DAN METODE

Koleksi Lebah ... 1

Ekstraksi dan Isolasi DNA ... 1

Amplikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera ... 2

Elektroforesis dan Visualisasi DNA... 2

Pengukuran pita DNA ... 2

PCR-RFLP ... 2

Sequencing (pengurutan) DNA dan Alignment (penjajaran) DNA... 3

HASIL

Amplifikasi DNA ... 3

Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplikasi dengan Enzim Restriksi BglII... 3

Pengurutan DNA A. mellifera ... 3

Alignment DNA... 3

PEMBAHASAN

... 7

KESIMPULAN ...

7

SARAN ...

8

DAFTAR PUSTAKA ...

8

LAMPIRAN...

9

(8)

DAFTAR TABEL

Halaman

1. Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplikasi gen sitokrom b A. Mellifera ... 2

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1. Hasil amplikasi gen sitokrom b A. mellifera menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b ... 3

2. Hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera meggunakan enzim restriksi BglII ... 3

3. Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b ... 4

4. Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera ... 5

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1. Daftar nama dan alamat peternak A. mellifera di Jawa Timur, Jawa Tengah, Yogyakarta, dan Jawa Barat... 9

2. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer forward sitokrom b ... 11

3. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer reverse sitokrom b ... 12

(9)

PENDAHULUAN

Latar belakang

Apis mellifera termasuk kedalam Ordo

Hymenoptera, famili Apidae dan subfamili Apinae (Michener 2000). Lebah A. mellifera adalah lebah madu yang dibudidayakan karena produksi madunya yang tinggi. Lebah madu ada yang hingga saat ini belum semua dapat dibudidayakan. Lebah madu yang telah dapat dibudidayakan adalah dari kelompok lebah A. mellifera, dan A. cerana, sedangkan lebah madu yang belum dapat dibudiyakan yaitu A. koscevnikovi, A. dorsata, A. andreni-

formis, A. florea dan A. laboriosa.

Lebah A. mellifera merupakan spesies le- bah madu yang persebarannya paling luas. A.

mellifera ditemukan di sebagian besar daerah

gurun pasir dan daerah dengan temperatur yang dingin (Ruttner 1988). Persebaran alami

A. mellifera adalah di daerah Mediterania,

Afrika, dan Eropa.

Berdasarkan analisis morfometrika, Rutt- ner (1988) membagi 24 subspesies ini menjadi empat kelompok garis keturunan (lineage). Garis keturunan A terdiri dari A. mellifera yang daerah persebarannya meliputi daerah Afrika, M meliputi Eropa utara dan barat, C meliputi Eropa Selatan dan O meliputi Timur Tengah. Pengelompokan yang sama juga di- hasilkan oleh Franck et al. (2000)berdasarkan DNA mitokondria.

Peternak lebah di dunia banyak mengim- por beberapa subspesies A. mellifera yaitu A.

m. mellifera dan A. m. ligustica dari Eropa.

Hal itu karena sifat jinak serta produksi madunya yang tinggi (Gojmerac 1983).

Peternakan lebah menjadi terancam sejak lebah madu A. m. scutellata yang berasal dari Afrika diimpor ke Brazil pada tahun 1956. Lebah Afrika tersebut diimpor dengan tujuan untuk mendapat galur lebah yang adaptasinya baik di daerah tropis. A. m. scutellata menga- lami hibridisasi dengan lebah madu Eropa yaitu A. m. ligustica dan A. m. mellifera yang menghasilkan Africanized honey bee (AHB) (Kenneth 1999). AHB memiliki sifat ganas, sengat yang mematikan dan sangat cepat dalam perbanyakan koloni (Sheppard 1999). Keturunan lebah AHB ini tersebar dari Brazil ke Meksiko, Texas, Arizona, dan California (Schneider et al. 2003).

Secara morfologi peternak lebah tidak dapat membedakan antara lebah AHB dan

lebah madu Eropa (bukan AHB). Penelitian dasar untuk mendeteksi lebah AHB dilakukan dengan menggunakan penanda molekuler mitokondria DNA. Mitokondria DNA diturun- kan secara maternal melalui sitoplasma, tidak mengalami rekombinasi atau sedikit terjadi rekombinasi gen (Hoy 1994).Gen sitokrom b pada DNA mitokondria yang dipotong dengan enzim BglII dapat digunakan untuk mende- teksi AHB. Berdasarkan Crozier et al. (1991) enzim BglII mampu untuk memotong gen

sitokrom b yang digunakan untuk mendeteksi

AHB. Selain BglII dengan gen sitokrom b, enzim dan daerah gen lain dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan lebah AHB. Daerah gen tersebut adalah lrRNA/Eco RI dan

cox 1/Hinc II (Pinto et al. 2003).

Hingga saat ini belum ada usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu di Indonesia khususnya di Balai Karantina Hewan. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi afrikanisasi lebah A. melli-

fera di pulau Jawa berdasarkan gen sitokrom b

pada DNA mitokondria.

Bahan dan Metode

Koleksi Lebah

Contoh lebah diperoleh dari hasil pengkoleksian lebah madu pada tahun 2005 yang dilakukan di Pati (Jawa Tengah) dan Jember (Jawa Timur) (Raffiudin 2006). Se- banyak 70 koloni lebah yang berasal dari Pati dan Jember disimpan dalam tabung berisi etanol absolut.

Ekstraksi dan Isolasi DNA

Ekstraksi DNA sudah dilakukan oleh peneliti sebelumnya (Hidayat 2006, Raffiudin 2006). Secara garis besar tahap persiapan dan pelaksanaan ekstraksi DNA adalah sebagai berikut.

Sebelum ekstraksi DNA dilakukan, lebah dimasukkan ke dalam Tris-EDTA (TE) 10 mM untuk menggantikan etanol dalam jaringan. Sumber DNA lebah yang digunakan adalah bagian toraks lebah. Jaringan toraks lebah dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml diletakkan dalam steroform berisi nitrogen cair lalu digerus. Ekstraksi DNA menggunakan metode ekstraksi CTAB dan presipitasi alkohol (Sambrook et al. 1989).

(10)

Tabel 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen sitokrom b A. mellifera berdasarkan posisi urutan DNA mitokondria A. mellifera Crozier & Crozier (1993)

Sebanyak 200 µl cetyl trimetyl amonium

bromida (CTAB) konsentrasi 20% dimasuk-

kan ke dalam tabung berisi toraks yang sudah digerus untuk melisis membran. Kemudian ditambahkan 14 µl proteinase K dengan konsentrasi 5 mg/µl dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama dua jam. Larutan berisi campuran CTAB dan proteinase K disentrifugasi 13000 rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung steril baru, kemudian ditambahkan 250 µl Chloroform Isoamil Alkohol (C:IAA=24:1). Supernatan dikocok (5 menit) dan disentrifugasi 13000 rpm (5 menit). Fenol kloroform isoamil alkohol (P:C:I=25:24:1) kemudian disentrifugasi 13000 rpm (1menit). Larutan berisi DNA dipindahkan ke tabung 1.5 ml steril dan ditambahkan 400 µl CIAA, lalu dikocok (5 menit).

Larutan berisi DNA disentrifugasi 13000 rpm (3 menit), kemudian supernatan dipindahkan ke tabung baru. DNA yang terlarut dalam supernatan dipresipitasi dengan menggunakan 600 µl isopropanol selama semalam pada suhu −4 º

C. Campuran DNA dan isopropanol disentrifugasi 13000 rpm selama 30 menit. Etanol 70% sebanyak 500 µl ditambahkan pada pelet DNA. Campuran tersebut disentrifugasi 13000 rpm (10 menit) pada suhu 4 oC. Etanol dibuang dan pelet DNA dikeringkan dengan cara divakum (30 menit). DNA hasil ekstraksi dilarutkan dalam TE 0.5 mM dan disimpan pada suhu −4 o

C.

Amplifikasi DNA Gen Sitokrom b A. melli-

fera

DNA lebah diamplifikasi menggunakan mesin PCR TaKaRa Thermal Cycler. Pe-reaksi PCR terdiri atas ddH20, 2.5 µM dNTP, Mg 2+ free buffer, 25 µM MgCl2, 10 µM pri- mer sitokrom b reverse, 10 µM primer sito-

krom b forward (Tabel 1) (Crozier et al.

1991), Taq polimerase 5 unit/0.1 µl, dan DNA hasil ekstraksi. Proses PCR dilakukan dengan tahapan; denaturation (pemisahan DNA utas ganda) pada 94 ºC selama 1 menit, annealing (penempelan primer) pada 55 ºC selama 1 menit, dan elongation (pemanjangan) pada 72 º

C selama 2 menit. Semua tahap dilakukan selama 30 siklus.

Elektroforesis dan Visualisasi DNA

DNA hasil amplifikasi dipisahkan dengan

polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE)

6% menggunakan bufer 1 x Tris 0.5 M, Asam borat 0.65 M, EDTA 0.02M (TBE). Arus lis- trik yang digunakan sebesar 160 V selama 90 menit. Visualisasi DNA dalam gel poli akrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak (Silver staining) yang dilakukan dalam sha-

king bath (Tegelstrom 1986). Gel hasil

elektroforesis dicuci dengan larutan CTAB (0.2 gr/200 ml akuades) selama 8 menit. Kemudian gel dicuci dengan aquades dua kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel dibilas lagi dalam larutan NH4OH (2 ml/200 ml akuades) selama 6 menit.

Selanjutnya gel direndam dalam campuran larutan 0.32 AgNO3, 0.8 ml NH4OH, dan akuades 200 ml selama 10 menit. Kemu- dian gel dicuci lagi menggunakan aquades dua kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel direndam dalam campuran larutan 4 gr Na2CO3, 100 µl formaldehida, dan 200 ml akuades sampai muncul pita DNA. Terakhir, gel direndam dalam larutan asam asetat 1% dalam 200 ml akuades untuk pengawetan pita DNA.

Pengukuran pita DNA

Pengukuran pita DNA dilakukan untuk mengetahui ukuran DNA berdasarkan gel akrilamida. Pengukuran ini dilakukan pada pita penanda DNA dan pada DNA target. Penentuan ukuran pita DNA target berdasar- kan regresi menggunakan program R (the R

Development Core Team Version 1.6.0) (Ve-

nables & Ripley 1999).

PCR-RFLP

DNA A. mellifera hasil amplifikasi dipo- tong menggunakan enzim restriksi BglII. Enzim restriksi BglII merupakan enzim pemo- tong enam basa. Situs pemotongannya adalah

AGATCT (Griffiths et al. 1999) memotong

basa ke 291 gen sitokrom b pada GenBank L06178. Komposisi pereaksi RFLP dalam total reaksi 4 µl terdiri atas DNA hasil amplifikasi 2 µl, 10 x bufer enzim BglII 0.4 µl, enzim BglII 10 unit/0.5 µl, air destilata Nama Primer Susunan nukleotida primer (5’-3’) Posisi nukelotida primer

pada mitokondria total

Sitokrom b Forward TATGTACTACCTTGAGGACAAATATC _11400-11425 Sitokrom b Reverse ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT _11859-11884