iv
ABSTRAK
POTENSI EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH (Piper betle Linn) SEBAGAI ANTIOKSIDAN PEMERANGKAP DPPH DAN ANTIKANKER
TERHADAP KULTUR SEL HeLa
Chavia Octaviani, 2011, Pembimbing I: Teresa Liliana W., S.Si., M.Kes., Pembimbing II: Laella K. Liana, dr. Sp.PA, M.Kes., Pembimbing III: Tjandrawati, M.Es.Sc.
Kanker serviks merupakan neoplasma ganas pada wanita tersering kedua di dunia setelah kanker payudara. Tanaman sirih (Piper betle L.) dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan dan antikanker. Penelitan ini dilakukan mengetahui aktivitas antioksidan secara ektrak etanol daun sirih (P. betle L), aktivitas sitotoksik ekstrak etanol daun sirih (P.betle L.) pada kultur sel HeLa, dan aktivitas induksi apoptosis ekstrak etanol daun sirih (P. betle L.) pada kultur sel HeLa. Metode yang digunakan adalah eksperimental laboratorium. Untuk mengetahui aktivitas antioksidan digunakan parameter pemerangkapan radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-1-2-picrylhydrazyl) dibandingkan dengan Epigalokatekin Galat (EGCG) sebagai standar. Untuk menguji antikanker, dilakukan uji aktivitas sitotoksik melalui perhitungan Inhibitory Concentration (IC50) dan induksi apoptosis pada sel HeLa. Ekstrak etanol daun sirih mempunyai aktivitas antioksidan pemerangkap DPPH yang hampir setara dengan EGCG. Ekstrak etanol daun sirih konsentrasi 100 µg/mL mempunyai aktivitas pemerangkap DPPH paling tinggi. Nilai rerata IC50 ekstrak etanol daun sirih adalah 815.6 ±162,6 µg/mL, sedangkan suatu ekstrak dinyatakan memiliki aktivitas antikanker jika nilai IC50 kurang dari 50 µg/mL. Pada uji induksi apoptosis nilai persentase populasi sel di daerah sub G0/G1 setara dengan sel HeLa yang tidak diberi perlakuan apapun. Sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun sirih memiliki aktivitas antioksidan pemerangkap DPPH tetapi tidak memiliki aktivitas antikanker, terbukti dari aktivitas sitotoksik dan induksi apoptosis yang rendah.
v ABSTRACT
Potential ethanol extract of betel leaf (Piper betle Linn) as antioxidant scavenging DPPH and anticancer to culture of HeLa cells
Chavia Octaviani, 2011, Tutor I: Teresa Liliana W., S.Si., M. Kes.,Tutor II: Laella Liana K., dr. Sp.PA, M. Kes., Tutor III: Tjadrawati, M.Es.Sc
Cervical cancer is a malignant neoplasm in women of the world's second most common after mammary cancer. Betel plant (Piper betle L.) has been reported have antioxidant and anticancer activity. This research is done to know the antioxidant activity of ethanol extracts of betel leaf (P. betle L), cytotoxic activity of ethanol extracts of betel leaf (P.betle L.) on HeLa cell cultures, and apoptosis induction activity of ethanol extracts of betel leaf (P. betle L.) on HeLa cell cultures. The method used is an experimental laboratory. To determine the antioxidant activity of free radical trapping parameters used DPPH (1,1-diphenyl-1-2-picrylhydrazyl) compared with epigallocatechin gallate (EGCG) as standard. To test the anti-cancer, including cytotoxic activity median inhibitory Concentration (IC50) and induction of apoptosis in HeLa cells. Ethanol extract of betel leaf has antioxidants scavenging DPPH activity almost equivalent to the EGCG. Ethanol extract of betel leaf which has the highest antioxidant scavenging DPPH activity is 100µg/ml concentration. IC50 value of the ethanol extract of betel leaf is 815.579 µg / mL. Apoptosis induction of ethanol extract of betle leaf same with no treatment HeLa cell. The conclusion is ethanol extract of betle leaf have antioxidant activity but don’t have anticancer activity.
vi DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
LEMBAR PERSETUJUAN ... ii
SURAT PERNYATAAN ... iii
ABSTRAK ... iv
ABSTRACT ... v
KATA PENGANTAR ... vi
DAFTAR ISI ... viii
BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Identifikasi Masalah ... 2
1.3 Tujuan Penelitian ... 2
1.4 Manfaat Karya Tulis Ilmiah ... 3
1.5 Kerangka Pemikiran dan Hipotesis ... 3
1.5.1 Kerangka Pemikiran ... 3
1.5.2 Hipotesis Penelitian ... 5
1.6 Metodologi Penelitian ... 5
1.7 Lokasi dan Waktu Penelitian ... .5
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Kanker Serviks ... 6
2.1.1 Insidensi dan Epidemiologi Kanker Serviks ... 6
2.1.2 Etiologi Kanker Serviks ... 7
2.1.3 Faktor Risiko Kanker Serviks ... 8
vii
2.1.5 Patogenesis Kankeer Serviks ... 11
2.1.6 Penatalaksanaan Kanker Serviks ... 12
2.2 Daun Sirih ... 13
2.2.1 Taksonomi Sirih ... 13
2.2.2 Kandungan dan Khasiat Daun Sirih ... 14
2.3 Radikal Bebas ... 14
2.4 Karsinogenesis ... 16
2.5 Antioksidan ... 17
2.6.Antikanker ... 18
2.6.1 Sitotoksik ... 18
2.6.2 Induksi Apoptosis ... 19
2.7 Flowcytometry ... 20
2.8 Sel HeLa ... 23
BAB III. METODE PENELITIAN 3.1 Alat dan Bahan ... 24
3.1.1 Alat yang Digunakan. ... 24
3.1.2 Bahan ... 25
3.2 Pemilihan Tanaman ... 25
3.3 Persiapan Alat ... 25
3.3.1 Sterilisasi Alat ... 26
3.4 Metode Penelitian ... 26
3.4.1 Desain Penelitian ... 26
3.4.2 Variabel Penelitian ... 26
3.4.3 Cara Kerja ... .27
viii
3.5.1 Hipotesis Statistik ... 29
3.5.2 Kriteria Uji ... 29
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 4.1 Uji Aktivitas Antioksidan Pemerangkap DPPH pada Ekstrak Etanol Daun Sirih ... 30
4.1.1 Perbandingan Uji Aktivitas Andioksidan Pemerangkap DPPH pada Ekstrak Etano Daun Sirih ... 30
4.2 Hasil Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Daun Sirih terhadap Kultur Sel Hela ... 34
4.3 Hasil Uji Apoptosis Ekstrak Etanol Daun Sirih terhadap Kultur Sel HeLa ... 38
4.4 Pembahasan ... .39
4.5 Uji Hipotesis ... 42
4.6 Simpulan ... 42
BAB V SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan ... .43
5.2 Saran ... 43
Daftar pustaka ... 44
Lampiran ... 46
ix
DAFTAR TABEL
Halaman
x
DAFTAR GRAFIK
Halaman
1 LAMPIRAN
Lampiran 1. Data Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Pemerangkap DPPH pada Ekstrak Etanol Daun Sirih
Tabel Absorbansi aktivitas antioksidan pemerangkap DPPH pada ekstrak etanol
daun sirih dan EGCG
Agen Antioksidan Konsentrasi Absorbansi 15 menit Rata-rata Ulangan
Tabel AktivitasAntioksidan Pemerangkap DPPH (%) pada Ekstrak Etanol Daun
Sirih dan EGCG
Agen Antioksidan Konsentrasi % DPPH Rata-rata Ulangan
2
Lampiran 2. Data Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanol Daun Sirih terhadap Kultur Sel HeLa
Tabel Absorbansi Standar Kultur Sel HeLa
2,5x104 1.135 1.147 0.951
1.159
0,5x104 0.471 0.466 0.27
0.461
0,25x104 0.378 0.3605 0.1645
0.343
0,05x104 0.29 0.2465 0.0505
3
Tabel Absorbansi Ekstrak Daun Sirih pada Sel Hela
Jumlah sel Absorbansi
4 Lampiran 3. Data Uji Apoptosis Ekstrak Etanol Daun Sirih
Normal (I)
Normal (II)
5 Ekstrak Etanol Daun Sirih 100 µg/mL (I)
6 Doxorubisin (I)
7 Tabel Hasil uji induksi apoptosis sel HeLa dibandingkan dengan doxorubisin
Induksi apoptosis (%) normal doksorubisin
8
Riwayat Hidup
Nama : Chavia Octaviani
Jenis Kelamin : Perempuan
Tempat/ tanggal lahir : Bandung, 22 Oktober 1989
Agama : Kristen
Alamat : Jalan Babakan Ciparay Gg Haji Zakaria No.4
Pendidikan : TK Maria Bintang Laut 1994-1996
SD Maria Bintang Laut 1996-2002
SMP Waringin 2002-2005
SMA Trinitas 2005-2008
Universitas Kristen Maranatha 2008- sekarang
1
Bab I
Pendahuluan
1.1Latar Belakang
Kanker serviks merupakan neoplasma ganas pada wanita tersering kedua di
dunia setelah kanker payudara. WHO pada tahun 2005 melaporkan terdapat
sekitar 7,6 juta orang meninggal akibat kanker serviks, yaitu sekitar 13%
kematian di dunia, sedangkan di Asia Tenggara angka kejadian kanker serviks
tahun 2008 dilaporkan 188.242 kasus baru (Ferlay et al., 2004; GLOBOCAN,
2008).
Penatalaksanaan yang dilakukan pada penderita kanker serviks biasanya
disesuaikan dengan stadium penyakitnya. Penderita kanker invasif awal diberi
terapi operasi seperti cryotherapy, histerektomi total, histerektomi radikal,
sedangkan pada penderita kanker yang sudah menyebar diberikan radioterapi dan
kemoterapi. Obat kemoterapi yang sering diberikan contohnya adalah ifosnamide
(Gracia, 2010). Pemberian obat-obat kemoterapi tersebut akan menimbulkan
banyak efek samping yang tidak diinginkan. Selain itu pengobatan–pengobatan
tersebut mahal, belum ada obat yang hanya membunuh sel kanker saja, dan tidak
semua kasus dapat memberikan respons terapi yang sama. Maka dari itu
dibutuhkan obat baru yang lebih sedikit efek sampingnya dan relatif lebih aman,
harga yang relatif terjangkau, dapat membunuh sel kanker langsung pada target,
serta dapat memberikan respon terapi yang baik pada setiap kasus.
Tanaman sirih sudah sejak lama dimanfaatkan oleh masyarakat Indonesia
sebagai tanaman obat tradisional yang berkhasiat untuk mengobati mimisan, diare,
sakit gigi, alergi, bronkitis, dan keputihan (Tanaman Berkhasiat-Obat tradisional,
2008; Nuri Andarwulan, 1996). Penelitian ini ingin mempelajari potensi daun
sirih untuk pengobatan kanker karena daun sirih juga diduga memiliki aktivitas
2
Menurut penelitian hasil uji fitokimia daun sirih senyawa penting seperti
alkaloid, flavanoid, steroid, dan fenol beserta turunannya, yaitu Hidroxychavicol
(HC) dan Euginol (EU) (Arya, 2008; Pin et al.,2010). HC berperan dalam
aktivitas antioksidan ekstrak daun sirih (Pin et al.,2010). Aktivitas antioksidan
juga diduga akibat adanya kandungan beta karoten yang terdapat pada daun sirih
(Nuri Andarwulan, 1996).
Daun sirih diduga memiliki aktivitas sitotoksik karena mengandung senyawa
flavonoid yang dikenal memiliki aktivitas antikanker. Pada penelitian Arya
Srisadono pada tahun 2008 didapatkan bahwa ekstrak etanol daun sirih dapat
membunuh larva Artemia salina Leach sehingga membuktikan adanya aktivitas
antikanker menurut metode Brine Shrimp Lethality Test. Namun penelitian
tersebut masih berupa dasar indikasi komponen sitotoksik, sehingga perlu
dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan kultur sel kanker (Arya,
2008).
Maka dari itu perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui aktivitas
antioksidan dari ekstrak etanol daun sirih. Untuk pemeriksaan antikanker
dilakukan pengujian aktivitas sitotoksik dan induksi apoptosis.
1.2Identifikasi Masalah
• Apakah ektrak etanol daun sirih (P. betle L.) memiliki aktivitas
antioksidan pemerangkap DPPH secara in vitro
• Apakah ekstrak etanol daun sirih (P. betle L.) memiliki aktivitas
sitotoksik secara in vitro pada kultur sel HeLa
• Apakah ekstrak etanol daun sirih (P. betle L.) memiliki aktivitas
induksi apoptosis secara in vitro pada kultur sel HeLa
1.3Tujuan
Maksud dari penelitian ini adalah mengetahui potensi antioksidan dan
3
Tujuan dari penelitian ini adalah
1. mengetahui aktivitas antioksidan secara in vitro dari ektrak etanol daun
sirih (P. betle L) dengan parameter pemerangkapan radikal bebas
1,1-diphenyl 1-2-pycrylhydrazyl (DPPH) dibandingkan dengan
epigalokatekin galat (EGCG)
2. mengetahui aktivitas sitotoksik secara in vitro dari ekstrak etanol daun
sirih (P.betle L.) pada kultur sel HeLa dengan parameter kemampuan
membunuh sel karsinoma (IC50)
3. mengetahui aktivitas induksi apoptosis secara in vitro dari ekstrak
etanol daun sirih (P. betle L.) pada kultur sel HeLa dibandingkan
dengan doksorubisin.
1.4Manfaat Karya Tulis Ilmiah
Manfaat dari penelitian ini untuk menambah pengetahuan dan memperluas
wawasan tentang khasiat antioksidan pemerangkap DPPH dan antikanker ekstrak
etanol daun sirih.
1.5Kerangka Pemikiran dan Hipotesis
1.5.1 Kerangka Pemikiran
Antioksidan adalah senyawa-senyawa yang melindungi sel dari efek
berbahaya radikal bebas oksigen reaktif, yang dapat berasal dari metabolisme
tubuh maupun faktor eksternal lainnya. Antioksidan secara nyata dapat
memperlambat atau menghambat oksidasi dari zat yang mudah teroksidasi
meskipun dengan konsentrasi yang rendah. Tumbuh-tumbuhan memproduksi
metabolit sekunder seperti fenolik (asam fenolik, flavonoid, kuinin dan
koumarins), nitrogen (alkaloid dan amina) vitamin dan terpenoid yang merupakan
sumber antioksidan (Singh, 2004). Daun sirih memiliki senyawa alkaloid,
4
Euginol (EU) (Arya, 2008; Pin et al., 2010). Dengan adanya senyawa aktif HC
dan EU diharapkan daun sirih memiliki aktivitas antioksidan dalam
pemerangkapan radikal bebas DPPH.
Kanker atau lebih dikenal sebagai neoplasma ganas, adalah istilah untuk
sekelompok besar penyakit yang pertumbuhan sel-selnya tidak dapat diatur lagi
oleh tubuh. Sel-sel membelah dan tumbuh tak terkendali, membentuk tumor ganas,
dan menyerang bagian tubuh dekatnya. Kanker juga dapat menyebar ke bagian
yang lebih jauh dari tubuh melalui sistem getah bening atau aliran darah.
Kanker serviks merupakan kanker tersering di Indonesia (Imam Rasjidi, 2009).
Penyebab terjadinya kanker serviks adalah infeksi dari HPV 16 dan 18. HPV
menginfeksi sel basal yang belum matang dari epitel skuamosa pada epitelial yang
mengalami kerusakan, atau metaplasia sel squamosa yang belum matang pada
squamocolumnar junction (Elleson, 2010). Akibat dari infeksi HPV tersebut
terjadi perekrutan dan aktivasi sel-sel imun (makrofag, neutrofil dan sel dendritik),
sel-sel tersebut melepaskan akumulasi spesies oksigen reaktif (ROS) dan spesies
nitrogen reaktif. Spesies oksigen reaktif dan spesies nitrogen reaktif (NOS) adalah
radikal bebas yang sangat reaktif dan mengandung elektron tidak berpasangan.
NOS dapat memodifikasi berbagai protein, membuat otoantigen dan juga dapat
meningkatkan fosforilasi dan menonaktifkan protein penekan tumor
retinoblastoma 1 (pRb) dan menyebabkan proliferasi sel tidak terkontrol.
Peningkatan NOS dapat meningkatkan aktivasi transkripsi angiogenesis dan
proto-onkogen, dan potensi metastasis tumor juga mutasi sehingga protein
penekan tumor p53 tidak bisa menginduksi apoptosis dari sel (Schetter, 2009).
Diharapkan eksktrak etanol daun sirih memiliki aktivitas antioksidan
pemerangkap DPPH serta aktivitas antikanker terutama aktivitas sitotoksik dan
menginduksi apoptosis sel HeLa yang merupakan kultur sel dari kanker serviks.
Sehingga untuk meneliti aktivitas antikanker secara in vitro dari kanker serviks
5
1.5.2 Hipotesis
o Ekstrak etanol daun sirih (P. betle L) memiliki aktivitas
antioksidan pemerangkap DPPH.
o Ekstrak etanol daun sirih ( P. betle L) memiliki aktivitas sitotoksik
terhadap kultur sel HeLa
o Ekstrak etanol daun sirih (P. betle L ) memiliki aktivitas
menginduksi apoptosis pada kultur sel HeLa.
1.6Metodologi
Metodologi penelitian adalah eksperimental laboratorium. Untuk mengetahui
aktivitas antioksidan digunakan parameter pemerangkapan radikal bebas DPPH
(1,1-diphenyl-1-2-picrylhydrazyl) dibandingkan dengan Epigalokatekin Galat
(EGCG) sebagai standar. Untuk menguji antikanker, meliputi aktivitas sitotoksik
dengan menggunakan MTS Assay melalui perhitungan Inhibitory Concentration
(IC50) dan induksi apoptosis pada sel HeLa.
1.7Lokasi dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Pusat Penelitian Ilmu Kedokteran
Universitas Kristen Maranatha Bandung dan Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia Bandung. Penelitian berlangsung pada bulan Desember 2010 hingga
November 2011.
43
Bab V
Simpulan dan Saran
5.1Kesimpulan
1. Ekstrak etanol daun sirih mempunyai aktivitas antioksidan pemerangkap
DPPH yang hampir setara dengan EGCG
2. Ekstrak etanol daun sirih yang mempunyai aktivitas pemerangkap DPPH
paling tinggi adalah konsentrasi 100 µg/mL, yaitu 89.091 % .
3. Ekstrak etanol daun sirih tidak memiliki efek aktivitas membunuh 50 %
sel HeLa.
4. Ekstrak etanol daun sirih tidak menginduksi apoptosis pada kultur sel
HeLa.
5.2Saran
Perlunya penelitian lebih lanjut uji sitotoksitas dan induksi apoptosis sel HeLa
dengan mengunakan fraksi-fraksi dari ekstrak etanol daun sirih.
Daftar Pustaka
Arya Srisadono.2008. Skrining awal ekstrak etanol daun sirih (Piper betle Linn) sebagai antikanker dengan metolde Brine Shrimp Lethality Test (BLT). Fakultas Kedokteran Diponegoro. Semarang.
http://www.linkpdf.com/ebook-viewer.php?url=http://eprints.undip.ac.id/24178/1/Arya.pdf diunduh pada 19 Desember 2010
Baitul Herbal.2010.Tanaman Herbal Indonesia
http://baitulherbal.com/tanaman-herbal/tanaman-herbal-indonesia-sirih/ diunduh pada 4 April 2011
Bidus MA, Elkas JC.2007.Cervical and Vaginal Cancer In JS Berek: Berek&Novak’s Gynecology 14th ed.Lippincot Williams & Wilkins
Capes DA,Theodosopoulos G, Atkin I.2010.Check yout cultures!A list of cross contaminated or misidentified cell lines. Int J Cnacer. 127(1):1-8
Demeule M, Michaud-Levesque J, Annabi B, Gingras D, Boivin D, Jodoin J et al. 2002. Green tea catechins as novel antitumor and antiangiogenic compounds. Curr. Med. Chem-anticancer Agents 2:441-63
http://borhaneannabi.net/files/2002/2002%20Article%20Revue%20The%20 Vert.pdf
diunduh pada 5 Januari 2010
Ellenson LH, Pirog EC. 2010. Cervical Carcinoma In V Kumar, MBBS, MD.FRCPath, A Abbas K, MMBS, N Fausto, MD, J Aster C , MD, PhD Ed: Robbins Cotran Pathologic Basis of Disease 8th ed.China:Saunders Elsevier.
Ferlay J,Bray F,Pisani P et al. GLOBOCAN 2002:Cancer Incidence, Mortality and Pervalence Worldwide. IARC CancerBase No. 5. Version2.0, IARCPress,Lyon,2004.
http://www-dep.iarc.fr/
diunduh pada 19 Desember 2010
Freshney RI.2000.Cell line.In:Cultures of Animal Cells a Manual of Basic Technique.4th .Canada:Wiley Liss, Inc.p177-182, 309-312, 329, 325.
Garcia A, Agustin MD. 2010. Emedicine:Cervical Cancer:Treatment & Medication.Southern California.
GLOBOCAN 2008.Most frequent canceres:women.WHO SOUTH-EAST ASIA REGION (SEARO). (IARC) Section of Cancer Information.
http://globocan.iarc.fr/factsheets/populations/factsheet.asp?uno=995 diunduh pada 19 Desember 2010
Hawley TS, Hawley RG.2004.Flow Cyometry Protocols Second editionIn Metrhod in Molecular Biology vol 264.Totowa, New Jersey:Humana Press
Imam Rasjidi.2009.Epidemiologi KankerServiks.Indonesian Jurnal of Cancer vol 3 No.3 hal 103-8
Ilham Kunchayo.2007.Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi,L) terhadapa 1,1 Diphenyl-2 Picryhidrazil (DPPH). Yoyakarta:Seminar Nasiolnal Teknologi 2007
Nuri Andarwulan.1996.Karaterisasi Antioksidan Alami dari Daun sirih(Piper bettle L): Pemisahan Komponen dalam Oleoresin Daun Sirih dengan Kromatografi Lapis Tipis.BuL Tek dan Industri Pangan Vol.VII.No.I.hal 75-8
http://jurnal.pdii.lipi.go.id/admin/jurnal/71967578.pdf diunduh pada 19 Desember 2010
Pin KY, Chuah AL, Rashih AA, Mazura MP, Fadzureena J, Vimalai S , Rasadah MA. 2010. Antioxidant and anti inflammatory activities of extracts of betel leaves (Piper betle)form solvents with different polarities. Journal of Tropical Forest Science 22(4): 448-55.
http://info.frim.gov.my/cfdocs/infocenter/Korporat/2003Publications/Links/ JTFS22(4)/15.%20KY%20Pin.pdf
diunduh pada 19 Desember 2010
Schetter AJ,Heegaard NHH, Harris CC.2009.Inflammation and cancer: interweaving microRNA, free radical, cytokine and p53 pathways.Oxford Jurnal vol 31,p:37-49
Sjamsul Arief.2008.Radikal bebas.Surabaya:Bagian SMF Ilmu Kesehatan Anak FK UNAIR/RSU DR Soetomo
Schorge JO. 2008.Section 4 Gynecologic Oncology Chapter 30 Cervical Cancer
In WilliamsGynecology.Mc Graw Hill-Companies.p1285-322
Stricker TP, Kumar v 20V0. Neoplasia In V Kumar, MBBS, MD.FRCPath, A
Abbas K, MMBS, N Fausto, MD, J Aster C , MD, PhD Ed: RobbinsCotran
PathologicBasisofDisease 8th ed.China:Saunders Elsevier
