PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOL PEGAGAN
(Centella asiatica) TERHADAP EKSPRESI BAX PADA NEURON
PYRAMIDAL CA1 HIPPOCAMPUS TIKUS (Rattus novergicus)
YANG DIINDUKSI SODIUM NITRIT SUB AKUT
Karya Tulis Ilmiah
Untuk Memenuhi Sebagian Syarat Memperoleh Derajat Sarjana Kedokteran
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
Oleh :
A.M. Farid Santoso 12711064
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA
2
THE EFFECT OF ETHANOL EXTRACT OF GOTU KOLA
(Centella asiatica) AGAINT BAX EXPRESSION IN RAT (Rattus
novergicus) HIPPOCAMPAL CA1 PYRAMIDAL NEURONS
INDUCED BY SODIUM NITRITE SUBACUTE
A Scientific Paper
As a Part of Requirements to Obtain a Degree of Medicine Islamic University of Indonesia
MEDICAL EDUCATION PROGRAM
by :
A.M. Farid Santoso 12711064
FACULTY OF MEDICINE
ISLAMIC UNIVERSITY OF INDONESIA 2016
THE EFFECT OF ETHANOL EXTRACT OF GOTU KOLA
(Centella asiatica) AGAINT BAX EXPRESSION IN RAT (Rattus
novergicus) HIPPOCAMPAL CA1 PYRAMIDAL NEURONS
INDUCED BY SODIUM NITRITE SUBACUTE
A.M. FARID SANTOSO1, KUSWATI 2, ETY SARI HANDAYANI 2 1
Student of Faculty of Medicine, Islamic University of Indonesia
2
Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Islamic University of Indonesia
ABSTRACT
Background: Sodium nitrite is widely used as preservatives in foods consumed by
the public. Sodium nitrite can cause hypoxia by converting hemoglobin into methemoglobin. CA1 pyramidal neurons is one of the structures in the hippocampus are susceptible to hypoxic conditions. To prevent damage to the CA1 pyramidal neurons of the hippocampus, it takes a neuroprotective agent. Gotu kola (Centella asiatica) is one of the plants the apparently has a neuroprotective effect.
Objective: This study aimed to determine the effect of ethanol extract of gotu kola
(Centella asiatica) on the expression of Bax in the hippocampal CA1 pyramidal neurons rat (rattus novergicus) induced sub-acute sodium nitrite.
Methods: This study used post test control group design that uses 14 blocks of
biological materials stored are divided into 3 groups: control group (K) as much as 4 blocks, group 1 (P1) as much as 5 blocks, and the treatment group 2 ( P2) as much as 5 blocks. The observations were analyzed by one way ANOVA test.
Results: There were differences in the number of Bax expression in hippocampal
CA1 pyramidal neurons significant difference between the control group, treatment 1 and treatment 2 (P = 0.000). Bax expression in group P1 is higher than P2.
Conclusion: The ethanol extract of leaves of gotu kola (Centella asiatica) decrease
Bax expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons rat (Rattus norvegicus) induced by sodium nitrite subacute.
Keywords: Centella asiatica, Sodium Nitrite, Bax Expression, Hippocampus CA1
5
THE EFFECT OF ETHANOL EXTRACT OF GOTU KOLA
(Centella asiatica) AGAINT BAX EXPRESSION IN RAT (Rattus
novergicus) HIPPOCAMPAL CA1 PYRAMIDAL NEURONS
INDUCED BY SODIUM NITRITE SUBACUTE
A.M. FARID SANTOSO1, KUSWATI 2, ETY SARI HANDAYANI 2 1
Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia
2
Departemen Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia
INTISARI
Latar Belakang : Sodium nitrit banyak digunakan sebagai bahan pengawet makanan
yang dikonsumsi oleh masyarakat. Sodium nitrit dapat menimbulkan hipoksia dengan mengubah hemoglobin menjadi methemoglobin. Neuron pyramidal CA1 merupakan salah satu struktur pada hippocampus yang rentan terhadap kondisi hipoksia. Untuk mencegah terjadinya kerusakan pada neuron pyramidal CA1 hippocampus, dibutuhkan suatu agen neuroprotektif. Pegagan (Centella asiatica) merupakan salah satu tanaman yang diniali memiliki efek neuroprotektif.
Tujuan Penelitian : Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian
ekstrak etanol pegagan (Centella asiatica) terhadap ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (rattus novergicus) yang diinduksi sodium nitrit sub akut.
Metode Penelitian : Penelitian ini menggunakan rancangan post test control group
design yang menggunakan 14 blok bahan biologis tersimpan yang dibagi menjadi 3
kelompok, yaitu kelompok kontrol (K) sebanyak 4 blok, kelompok perlakuan 1 (P1) sebanyak 5 blok, dan kelompok perlakuan 2(P2) sebanyak 5 blok. Hasil pengamatan dianalisa dengan uji one way ANOVA.
Hasil : Terdapat perbedaan jumlah ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1
hippocampus yang signifikan antara kelompok kontrol, perlakuan 1, dan perlakuan 2 (P=0,000). Ekspresi Bax pada kelompok P1 lebih tinggi daripada P2.
Kesimpulan : Pemberian ekstrak etanol daun pegagan (Centalla asiatica)
menurunkan ekspresi bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus
norvegicus) yang diinduksi dengan sodium nitrit subakut.
Kata Kunci : Centella asiatica, Sodium Nitrit, Ekspresi Bax, Neuron Pyramidal CA1 Hippocampus.
PENDAHULUAN
Sodium nitrit biasanya digunakan sebagai bahan tambahan pengawet makanan. Sodium nitrit terdapat pada hotdogs, lunch meat,
bacon, dan ham. Selain sebagai bahan
pengawet antimikroba, sodium nitrit berfungsi sebagai pewarna, pemberi aroma, dan cita rasa.1
Konsumsi sodium nitrit dalam jumlah banyak dapat memberikan efek kurang baik bagi tubuh. Sodium nitrit dapat mengubah hemoglobin menjadi methemoglobin di dalam darah sehingga dapat menginduksi terjadinya hipoksia jaringan. Hal ini terjadi karena methemoglobin tidak dapat mengikat oksigen. Pada keadaan hipoksia, kadar reactive oxygen species (ROS) dalam jaringan akan meningkat sehingga memicu terjadinya apoptosis yang ditandai dengan degradasi membran lipid, enzim, dan kerusakan DNA.2
Hipoksia menyebabkan aktifitas protein antiapoptosis Bcl-2 terhambat sehingga mengaktifkan peran dari protein Bax yang meningkatkan permeabilitas membran mitokondria. Keadaan ini
meningkatkan pelepasan sitokrom C yang selanjutnya berikatan dengan
apoptosis protease activating factor-1
(APAF-1) dan membentuk apoptosom. apoptosom mengaktifkan kaspase 9 yang selanjutnya akan mengaktifkan kaspase 3 sehingga terjadi proses apoptosis.2
Otak merupakan bagian utama yang mendapat vaskularisasi. Jaringan neuron otak menghasilkan ATP melalui suplai glukosa dan oksigen saja. Hal ini menyebabkan jaringan otak rentan terhadap jejas hipoksik.3 Selama hipoksia aktivitas elektrik otak menghilang terutama di hippocampus.4 regio cornu ammonis (CA) merupakan struktur pada hippocampus yang berperan dalam proses pembelajaran dan memori.4 Oleh karena itu, dibutuhkan suatu agen neuroprotektif untuk melindungi sebanyak mungkin sel saraf pada otak dari kerusakan akibat hipoksia.4
Pegagan (Centella asiatica) adalah tanaman liar yang tumbuh di Pulau Jawa dan Madura. Tumbuhan pegagan bersifat antioksidan karena mengandung senyawa fitokimia seperti flavonoid pada batang stolon dan
7 akarnya.5 Selain berfungsi sebagai
antioksidan dan antiinflamasi, flavonoid meningkatkan fungsi endotelial dan aliran darah perifer sehingga meningkatkan aliran darah otak (cerebral blood flow/CBF).4
Apoptosis sel adalah suatu mekanisme kematian sel yang terprogram. Apoptosis menyebabkan fragmentasi DNA, penyusutan sitoplasma, perubahan membran, dan akhirnya terjadi proses lisis sel tanpa merusak sel di sekitarnya. Proses apoptosis terjadi melalui dua jalur yaitu jalur instrinsik dan jalur ekstrinsik. Jalur instrinsik adalah jalur mediasi non reseptor dan mekanismenya melalui peran mitokondria. Stimulus apoptosis akan menyebabkan inaktivasi dari antiapoptosis dan aktivasi dari proapoptosis, selanjutnya proapoptosis akan menyebabkan keluarnya
cytochrome c dari mitokondria dan
menginduksi terjadinya apoptosis. Induksi terjadinya apoptosis diawali dengan pengaktifan apalf (apoptotic
protease activating factor-1) oleh cytochrome c yang selanjutnya akan
membentuk apoptosome dan mengaktifkan caspase 9. Akhir dari proses ini adalah aktivasi caspase 3 atau caspase 7 oleh caspase 9 dan menghasilkan kematian sel.6
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol daun pegagan (centella
asiatica) terhadap ekspresi bax pada
neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (rattus novergicus) yang diinduksi sodium nitrit sub akut.
METODE PENELITIAN
Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian post test with
control group design.
Sampel Penelitian
Penelitian ini menggunakan bahan biologis tersimpan berupa blok parafin jaringan otak tikus (Rattus
novergicus) sebanyak 14 buah.
Jaringan tersebut berasal dari tikus yang sudah mendapat perlakuan. Perlakuan pada hewan percobaan ini dilakukan selama 42 hari dengan frekuansi satu kali sehari. Kelompok kontrol tidak mendapatkan perlakuan. Kelompok perlakuan 1 diberikan sodium nitrit dengan dosis 50 mg/kgBB/hari dan kelompok perlakuan 2 diberikan sodium nitrit dengan dosis 50 mg/kgBB/hari dan ekstrak pegagan 600 mg/kgBB/hari. Pemberian sodium nitrit dan ekstrak pegagan dilakukan dengan menggunakan sonde. Pemberian
dilaksanakan pada pukul 15.00 WIB tiap harinya.
Analisis Data
Penilaian ekspresi bax menggunakan skor allred. Skor allred didapatkan dari penjumlahan proporsi dan intensitas ekspresi Bax pada setiap lapang pandang dari masing-masing kelompok perlakuan. Nilai skor allred antara 0-8, 0 menunjukkan tidak terdapatnya ekspresi Bax dan 8 menunjukkan banyaknya ekspresi Bax dan kuatnya intensitas warna yang di ekspresikan. Data skor allred kemudian dianalisis secara statistik dengan mengunakan one way anova
(Analysis of varian), dilanjutkan
dengan post hoc test untuk mengetahui kelompok yang mempunyai perbedaan.
HASIL
Pengamatan neuron pyramidal CA1 hippocampus dilakukan menggunakan mikroskop Olympus CX21 dengan perbesaran 400x. Hasil pengamatan pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus
novergicus) dari kelompok kontrol,
perlakuan 1, dan perlakuan 2, disajikan dalam gambar 1.
Berdasarkan hasil pengamatan, ekspresi bax ditandai dengan timbulnya warna cokelat pada neuron pyramidal CA1 hippocampus. Gambar A (perbesaran 40x) panah merah menunjukkan letak neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus
novergicus). Pada gambar B
(kelompok kontrol) tidak terdapat ekspresi bax, hal tersebut berdasarkan pada pengamatan sel neuron pyramidal CA1 hippocampus yang tidak memperlihatkan warna cokelat. Gambar C (kelompok perlakuan 1) memperlihatkan warna cokelat pada seluruh neuron pyramidal CA1 hippocampus. Warna cokelat tersebut menunjukkan adanya ekspresi bax. Gambar D (kelompok perlakuan 2) menunjukkan ada sel yang mengekspresikan bax, ada juga sel yang tidak mengekspresikan bax.
9 Gambar 5. (a) Letak neuron pyramidal CA1 hippocampus Rattus novergicus (perbesaran 40x). (b) Neuron pyramidal CA1 hippocampus Rattus novergicus kelompok kontrol (perbesaran 400x). (c) Neuron pyramidal CA1 hippocampus Rattus
novergicus kelompok perlakuan 1 (perbesaran 400x). (d) Neuron pyramidal CA1
hippocampus Rattus novergicus kelompok perlakuan 2 (perbesaran 400x) Tabel 1. Data Skor Allred Ekspresi Bax
Kelompok Minimum Maksimum Mean SD One way anova
Kontrol 0,00 0,00 0,00 0,00
0,000
Perlakuan 1 3,00 8,00 6,60 2,07
Perlakuan 2 1,86 4,18 3,09 0,97
Tabel diatas menunjukkan nilai minimum, maksimum, mean, standar deviasi dan uji one way anova Ekspresi Bax dari kelompok kontrol, perlakuan 1, dan perlakuan 2. Pada kelompok kontrol, rerata terendah adalah 0,00 dan yang tertinggi adalah 0,00 dengan mean 0,00 (SD = 0,00). Kelompok perlakuan 1 memiliki rerata terendah 3,00 dan yang tertinggi sebesar 8,00 dengan mean 60 (SD = 2,07). Kelompok perlakuan 2 memiliki rerata terendah 1,86 dan yang tertinggi
sebesar 4,18 dengan mean 3,09 (SD = 0,97).
Uji one way anova dengan menggunakan α = 95%, didapatkan nilai P value sebesar 0,000. Hal ini menyimpulkan bahwa terdapat perbedaan jumlah ekspresi Bax yang signifikan minimal 2 kelompok dari tiga kelompok penelitian. Analisis dilanjutkan dengan menggunakan uji
post-hoc untuk menilai kelompok
mana yang memiliki perbedaan bermakna. Pada uji post-hoc,
didapatkan adanya perbedaan bermakna antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan 1 (P1) dengan nilai P = 0,000. Perbedaan bermakna ditunjukkan pada perbandingan kelompok perlakuan 1 (P1) dengan kelompok perlakuan 2 (P2). Hal ini dibuktikan dengan nilai P = 0,002. Perbedaan bermakna juga terdapat pada kelompok perbandingan kontrol dengan perlakuan 2 (P2) dengan nilai P = 0,007
PEMBAHASAN
Ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus dinilai dengan uji one way anova dan
post-hoc didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol, perlakuan 1 (P1), dan perlakuan 2 (P2). Nilai tersebut menunjukkan bahwa pemberian sodium nitrit subakut pada kelompok perlakuan 1 (P1) dapat meningkatkan ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus novergicus). Selain itu, nilai uji tersebut juga menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanol daun pegagan pada kelompok Perlakuan 2 (P2) dapat menurunkan ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus novergicus) yang diinduksi sodium nitrit subakut.
penelitian ini yaitu penelitian oleh Anda, P. T., (2015) yang menyimpulkan bahwa sodium nitrit memiliki efek yang signifikan pada kerusakan sel purkinje serebelum.7
Penelitian serupa juga dilakukan oleh Lyhatskiy et al. (2013). Penelitian tersebut menyebutkan bahwa induksi sodium nitrit 45mg/kgBB/hari menyebabkan peningkatan kadar methemoglogin yang signifikan dalam darah. Selain itu, terjadi peningkatan kadar NO2- yang signifikan pada jaringan yang menyebabkan intoksikasi endogen. Intoksikasi tersebut yang menyebabkan kematian sel.8
Dalam hasil penelitian ini, pemberian sodium nitrit subakut dapat meningkatkan ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus sebagai penanda adanya proses apoptosis. Hal tersebut di buktikan dengan adanya perbedaan bermakna pada uji post-hoc test antara kelompok kontrol dengan kelompok P2. Sementara itu, pemberian ekstrak etanol pegagan (Centella asiatica) dapat mencegah terjadinya apoptosis yang ditandai dengan menurunnya ekspresi Bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus. Hal tersebut dibuktikan dengan nilai uji post-hoc
11 bermakna. Perbedaan bermakna juga
ditunjukkan pada nilai uji post-hoc test antara kelompok kontrol dengan kelompok P2. Hal tersebut membuktikan masih terdapat perbedaan ekspresi Bax antara kelompok kontrol dengan kelompok P2. Ekspresi Bax pada kelompok P2 lebih tinggi dibandingkan kelompok kontrol.
Pegagan (Centella asiatica) merupakan tanaman yang telah digunakan sebagai obat herbal sejak beberapa ribu tahun yang lalu. Flavonoid merupakan salah satu kandungan yang terdapat dalam
Centella asiatica yang berperan
sebagai agen neuroprotektif. Flavonoid dan metabolitnya dapat melindungi otak dari jejas yang diinduksi neurotoksin. Dalam mencegah inflamasi, flavonoid menekan ekspresi COX-2 dan iNOS, produksi NO, pelepasan sitokin, aktivasi NADPH
oksidase, dan pembentukan ROS.
Selain berfungsi sebagai antioksidan dan antiinflamasi, flavonoid meningkatkan aliran darah otak dan memicu neurogenesis di hippocampus.4
Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian Priyantiningrum et al. (2015) yang bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian
ekstrak etanol pegagan (Centella
asiatica) terhadap jumlah sel neuron di
korteks prefrontalis tikus (Rattus
novergicus) yang diberi perlakuan stres
menyimpulkan, pegagan (Centella
asiatica) berpengaruh terhadap
peningkatan jumlah sel neuron Rattus
novergicus. Oleh karena itu, pegagan
dapat menghambat kematian sel akibat stres.9 Kuswati et al. (2015) dalam penelitiannya menyimpulkan ekstrak etanol daun pegagan dapat meningkatkan ekspresi protein antiapoptosis B-cell lymphoma (Bcl-2) di korteks prefrontalis tikus Sprague
Dawley yang diberi perlakuan stres
retrain kronik.10
SIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan dan perhitungan jumlah ekspresi Bax pada sediaan bahan biologi tersimpan berupa blok parafin untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol pegagan (Centella asiatica) terhadap ekspresi bax pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus novergicus) yang diinduksi sodium nitrit subakut, maka diambil kesimpulan bahwa pemberian ekstrak etanol daun pegagan (Centalla
asiatica) menurunkan ekspresi Bax
pada neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus (Rattus norvegicus)
yang diinduksi dengan sodium nitrit subakut.
SARAN
Dari hasil penelitian dapat disarankan beberapa hal seperti perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui gambaran sel-sel neuron pyramidal CA1 hippocampus tikus yang rusak akibat induksi sodium nitrit dan Diperlukan penelitian lanjutan dengan struktur otak tikus (Rattus
novergicus) yang berbeda untuk
melihat pengaruh pemberian ekstrak etanol pegagan sebagai agen neuroprotektif.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada dr. Kuswati, M.Sc., dan dr. Ety Sary Handayani, M.Kes., kedua orang tua, saudara, sahabat dan semua pihak yang baik secara langsung maupun tidak langsung telah membantu sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
1. Gehle, K., 2013. ATSDR Case
Studies in Environmental Medicine Nitrate/Nitrite Toxucity.
ATSDR, U.S. Departement of
2. Petrova, E., Dishkelov, A. T.,
Vasileva, E. G., 2011. Glycolipid Change in Rat Brain Mitochondria and Synaptosomes Following Experimental Hypoxia. MD-Medical Data, Volume
3(4):331-334.
3. Tortora, G.J., 2009. Principles of
Anatomy and Phyisilogy, 12th
Edition, John Wiley & Sons, Inc, USA.
4. Halim, H.D.P., Ibrahim, N., 2013. Efek Neuroprotektif Ekstrak Akar Acalypha indica 500 mg/kgBB terhadap Perubahan Inti Sel Saraf Hipokampus Pascahipoksia Serebri.
Vol. 1, No. 2
5. Hussin, M., et al. 2007. Protective Effect of Centella asiatica Extract and powder on oxidative stress in rats. Elsevier, Food chemistry 100,
535-541
6. Khattouti,A., Selimovic,D.,
Haikel, Y., Hassan,M., 2011.
Crosstalk Between Apoptosis and Autophagy: Molecular Mechanisms and Therapeutic Strategies in Cancer. Journal of
Cell Death. doi:
10.4137/JCD.S11034.
7. Anda, P. T., 2015. Pengaruh
Pemberian Ekstrak Etanol Daun Pegagan (Centella asiatica)
Terhadap Jumlah Sel Serebelum Tikus (Rattus novergicus) yang Diinduksi Natrium Nitrit Subakut,
Karya Tulis Ilmiah, Jurusan
Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran, Universitas Islam Indonesia
8. Lyhatskiy, P. G. et al., 2013.
Methabolic Abnormalities in the Organism of Rats Under the Conditions of Natrium Nitrite Damage, Horbachevsky Ternopil State Medical Universty.
9. Priyantiningrum, A.K., Kuswati,
Handayani, E.S., Pengaruh Ekstrak Etanol Centella Asiatica
13 Korteks Prefrontalis Tikus yang
Diberi Perlakuan Stres. http://journal.uii.ac.id/index..php/J KKI/article/download/3397/3052 [diakses pada tanggal 10 Maret 2016]
10. Kuswati, Prakosa, D., Wasita,
B,.Wiyono, N., 2015. Centella asiatica increases B-cell lymphoma 2 expression in rat prefrontal cortex. Univ Med
