Oleh :
Azizah Rahayu NRP. 1507. 100. 063
Dosen Pembimbing :
Penicillium
sp.
Produksi selulase
Membantu degradasi selulosa
Produksi enzim selulase murah dan efisien
Bagaimana pengaruh masa inkubasi dan konsentrasi
inokulum dalam proses produksi enzim selulase dengan
menggunakan medium tongkol jagung.
Menggunakan isolat
Penicillium
sp. koleksi laboratorium Mikrobiologi
dan Bioteknologi Biologi ITS yang diisolasi dari kawasan pesisir Wonorejo
Surabaya.
Menggunakan dua jenis medium tongkol jagung; medium dengan
treatment
mekanik, dan medium dengan
treatment
mekanik dan
kimiawi.
Fermentasi dikondisikan pada suhu 35°C dengan pH 6.
Aktivitas enzim diukur pada panjang gelombang 540 nm.
Mengetahui pengaruh masa inkubasi dan konsentrasi
inokulum
Penicillium
sp. terhadap aktivitas enzim selulase
dengan menggunakan medium tongkol jagung.
Memperoleh enzim selulase dari isolat
Penicillium
sp.
dengan menggunakan media tongkol jagung yang sangat
berguna untuk diaplikasikan pada berbagai jenis industri.
Memberikan informasi tentang aktivitas enzim selulase
dari isolat
Penicillium
sp. pada medium tongkol jagung.
Penelitian dilakukan pada bulan Januari sampai Juli 2014
di Laboratorium Mikologi, Botani serta Laboratorium
Mikrobiologi dan Bioteknologi Biologi ITS.
Tempat dan Waktu Penelitian
Pembuatan larutan
Pembuatan larutan DNS
1,4 g NaOH
Dilarutkan dalam 20 ml aquades
Ditambahkan 0,7 g DNS
21,6 g garam Rochelle
0,5 ml fenol + 0,6 g sodium metabisulfit
Dilarutkan dalam 50 ml aquades
Pembuatan larutan NaOH 2%
Pembuatan larutan CMC 1%
200 gr NaOH
Dilarutkan dengan
aquades hingga 1000 ml
Disterilkan dengan
autoclave
Dilarutkan dengan sodium buffer
sitrat pH 4,8 hingga 100 ml
1 gr CMC
Pembuatan larutan tween 80 0,1%
Pembuatan larutan avicel 1%
1 ml tween 80
Dilarutkan hingga
mencapai 100 ml dan
diaduk hingga homogen
1 g avicel
Pembuatan medium padat PDA
Pembuatan medium pertumbuhan
200 gr kentang 2 gr yeast ekstrak
+ 1,5 gr KH2PO4
+ 0,2 gr CaCl2. 2H2O
+ 1 gr MgSO4.7H2O
+ 0,2 gr MnSO4.H2O
+ 0,2 gr FeSO4.7H2O
+ 1,5 gr dextrose + 1,5 gr agar batangan Disaring dan suspensi diencerkan
kembali dalam 1000 ml aquades Direbus dlm 1000 ml aquades
Disterilkan dgn autoclave
Dituang ke dalam tabung reaksi @ 6 ml
Dipanaskan hingga larut sempurna
Disterilkan dgn autoclave
Persiapan medium tongkol jagung
•
Tahap
treatment
secara mekanik
•
Tahap
treatment
secara kimiawi
Dioven pada suhu 100°C selama 2 jam
Disaring dgn ukuran 120-140 mess Dicacah kecil lalu digiling
Tongkol jagung
Dioven pada suhu 100°C selama 3 jam Padatan substrat disiram air panas pada
suhu 70-80°C
Dipisah dgn kertas saring
Substrat ditambahkan lar. NaOH 2% (1:10)
Pembuatan kurva standar glukosa
Ditimbang glukosa anhidrat masing-masing 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2 mg
dibuat kurva standar
Ditambahkan @ 1 ml buffer sitrat
Divortex dan diambil @ 0,5 ml
diukur absorbansinya (540 nm)
Ditambahkan 3 ml DNS, dipanaskan selama 5 menit lalu didinginkan dengan es
Pembuatan strater kapang
Peremajaan kapang
diinokulasikan isolat kapang
kultur stok
Diinkubasi pada suhu ruang (7 hari)
Diinkubasi pada suhu ruang 2,5 gr substrat
+ 12,5 ml medium pertumbuhan
Divortex dan dihitung jmlh sporanya (106/ml)
Kultur kapang + 10 ml aquades steril Medium PDA
kultur kerja
10% suspensi spora
Optimasi enzim selulase pada medium tongkol jagung
Filtrat diuji aktivitas enzimnya
+ 20 ml lar. ekstrak tween 80 0,1% + disentrifuge dan disaring
Diinkubasi pada suhu 35°C selama 20 hari dgn range masa inkubasi hari ke-4; 7; 12; 16; dan hari ke-20
5 gr substrat + 25 ml medium pertumbuhan
•
uji aktivitas enzim endoglukanase
1 ml enzim + 1 ml lar. CMC 1%
Diuji kadar gula pereduksinya
Diinkubasi pada suhu 37°C selama 120 menit
Didinginkan dlm es selama 10 menit, dan diukur absorbansinya
(540 nm)
Dipanaskan dlm water bath
100°C selama 5 menit + 1 ml lar. DNS
Dikonversikan berdasarkan kurva standar glukosa
•
uji aktivitas enzim eksoglukanase
1 ml enzim + 1 ml lar. avicel 1%
Diuji kadar gula pereduksinya
Diinkubasi pada suhu 50°C selama 60 menit
Didinginkan dlm es selama 10 menit, dan diukur absorbansinya
(540 nm)
Dipanaskan dlm water bath
100°C selama 5 menit + 1 ml lar. DNS
•
uji aktivitas enzim Fp-ase
0,5 ml enzim + 1 ml buffer sitrat + kertas saring Whatman no 1 (1x6 cm)
Diuji kadar gula pereduksinya
Diinkubasi pada suhu 50°C selama 60 menit
Didinginkan dlm es selama 10 menit, dan diukur absorbansinya
(540 nm)
Dipanaskan dlm water bath
100°C selama 5 menit + 3 ml lar. DNS
Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) pola 2
faktorial dengan setiap perlakuan terdiri dari dua kali ulangan.
Lama Fermentasi Konsentrasi inokulum
Enzim selulase
Data penelitian ini dianalisa dengan menggunakan metode deskriptif
kuantitatif dengan menggunakan dua faktor, yakni variasi masa inkubasi
dan konsentrasi inokulum.
endoglukanase eksoglukanase Fp-ase
Medium I 15%- hari ke 4
(3,4904 U/ml)
10%- hari ke 4 (11,3525 U/ml)
20%- hari ke 8 (42,2619 U/ml)
Medium II 15%- hari ke16
(7,706 U/ml)
15%- hari ke 4 (11,1408 U/ml)
20%- hari ke 16 (34,9702 U/ml)
Medium I Medium II
Treatment
mekanik
(digiling, dipanaskan, dioven)
V V
Treatment
kimiawi
(perlakuan alkali NaOH)
(Pratiwi, 2006)
•
proses delignifikasi tidak dapat menghilangkan
lignin secara keseluruhan, karena lignin terikat
pada selulosa maupun hemiselulosa.
•
Kadar selulosa setelah delignifikasi menjadi lebih
rendah,
dikarenakan
mikrofibril
selulosa
dibungkus oleh lignin, sehingga selulosa ikut
terlarut bersama lignin yang hilang.
•
Kadar hemiselulosa meningkat, dikarenakan ikut
terlarutnya xilan bersama lignin yang merupakan
komponen utama dari hemiselulosa. Sehingga
kadar hemiselulosa meningkat.
Data dan Pembahasan
Aktivitas endoglukanase pada medium I
Aktivitas tertinggi : 3,4904 U/ml
Perhitungan :
• Regresi linier dari kurva standar y = 0,042x – 0,003
• Absorbansi produk (gula pereduksi) : 1,7605 – 0,708 = 1,0525
• Waktu inkubasi : 120 menit
• Berat molekul glukosa : 180
• V1 : volume larutan = 3 ml
• V2 : volume enzim = 1 ml
• Konsentrasi produk (gula pereduksi) : y =0,042x – 0,003 1, 0525 = 0,042x – 0,003
x = 25,1309
Aktivitas endoglukanase = [gula pereduksi] x V1x 103 µmol BM x V2 x T
0
Aktivitas tertinggi : 7,706 U/ml
Aktivitas endoglukanase pada medium II
Perhitungan :
• Regresi linier dari kurva standar y = 0,042x – 0,003
• Absorbansi produk (gula pereduksi) : 2,9145 – 0,587 = 2,3275
• Waktu inkubasi : 120 menit
• Berat molekul glukosa : 180
• Konsentrasi produk (gula pereduksi) : y =0,042x – 0,003 12,3275 = 0,042x – 0,003
x = 55,4880 U/ml
Aktivitas endoglukanase = [gula pereduksi] x V1x 103 µmol BM x V2 x T
0
• Regresi linier dari kurva standar y = 0,042x – 0,003
• Absorbansi produk (gula pereduksi) : 1,869 – 0,1555 = 1,7135
• Waktu inkubasi : 60 menit
• Berat molekul glukosa : 180
• V1 : volume larutan = 3 ml
• V2 : volume enzim = 1 ml
• Konsentrasi produk (gula pereduksi) : y =0,042x – 0,003
1, 7135 = 0,042x – 0,003
x = 40,8690
Aktivitas eksoglukanase pada medium I
Aktivitas tertinggi : 11,3525 U/ml
Aktivitas eksoglukanase = [gula pereduksi] x V1x 103µmol BM x V2x T
0
• Regresi linier dari kurva standar y = 0,042x – 0,003
• Absorbansi produk (gula pereduksi) : 2,06 – 0,3785 = 1,6815
• Waktu inkubasi : 60 menit
• Berat molekul glukosa : 180
• V1 : volume larutan = 3 ml
• V2 : volume enzim = 1 ml
• Konsentrasi produk (gula pereduksi) : y =0,042x – 0,003
1, 6815 = 0,042x – 0,003
x = 40,1071
Aktivitas eksoglukanase = [gula pereduksi] x V1 x 103 µmol BM x V2 x T
= (40,1071 x 3 x 103 µmol) / (180 x 1 x 120) = 11,1408 U/ml
0
Aktivitas Fp-ase pada medium I
Aktivitas tertinggi : 42,2619 U/ml
Perhitungan :
• Regresi linier dari kurva standar y = 0,042x – 0,003
• Absorbansi produk (gula pereduksi) : 2,656 – 0,529 = 2,127
• Waktu inkubasi : 60 menit
• Berat molekul glukosa : 180
• V1 : volume larutan = 4,5 ml
• V2 : volume enzim = 0,5 ml
• Konsentrasi produk (gula pereduksi) : y =0,042x – 0,003
2,127 = 0,042x – 0,003
x = 50,7142
Aktivitas Fp-ase = [gula pereduksi] x V1x 103 µmol BM x V2 x T
= (50,7142 x 4,5 x 103 µmol) / (180 x 0,5 x 60)
0
Aktivitas Fp-ase pada medium II
Aktivitas tertinggi : 34,9702 U/ml
Perhitungan :
• Regresi linier dari kurva standar y = 0,042x – 0,003
• Absorbansi produk (gula pereduksi) : 2,4855 – 0,726 = 1,7595
• Waktu inkubasi : 60 menit
• Berat molekul glukosa : 180
• V1 : volume larutan = 4,5 ml
• V2 : volume enzim = 0,5 ml
• Konsentrasi produk (gula pereduksi) : y =0,042x – 0,003
1,7595 = 0,042x – 0,003
x = 41,9642
Aktivitas Fp-ase = [gula pereduksi] x V1x 103 µmol BM x V2 x T
= (41,9642 x 4,5 x 103 µmol) / (180 x 0,5 x 60)
Grafik aktivitas enzim selulase pada medium I
endoglukanase-10% endoglukanase-15% endoglukanase-20%
eksoglukanase-10% eksoglukanase-15% eksoglukanase-20%
fpase-10% fpase-15% fpase-20% fpase - 20% - 42,2619 U/ml
Masa inkubasi (hari)
Grafik aktivitas enzim selulase pada medium II
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0 5 10 15 20 25
endoglukanase-10% endoglukanase-15% endoglukanase-20%
eksoglukanase-10% eksoglukanase-15% eksoglukanase-20%
Aktivitas enzim selulase pada medium pertama
10% 0,5059 11,3525 0
15% 3,4904 9,5304 1,08133
20% 2,1064 8,2638 0
8 hari
10% 0,9143 0 0,5059
15% 1,8435 0 27,4305
20% 0 0 42,2619
15% 1,6980 0 14,8710
20% 0,0496 0 35,7738
20 hari
10% 0 ` 0,2314 0
15% 0,5092 0 0
Aktivitas enzim selulase pada medium kedua
10% 0,8779 10,9528 0
15% 7,4140 11,1408 0
20% 7,5892 10,1455 0,3373
8 hari
10% 0 0 0
15% 3,4871 0 0
20% 6,8601 0 32,1031
12 hari
10% 3,0935 0 13,8194
15% 1,8105 0 9,8809
20% 7,0271 0 19,3650
16 hari
10% 0,8796 0 0
15% 7,7066 0 11,2599
20% 5,3009 0 34,9702
20 hari